酶促製備成纖維細胞生長因子的方法

2024-01-28 09:23:15 1

專利名稱：酶促製備成纖維細胞生長因子的方法
技術領域：
本發明涉及鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)的酶促製備方法。
bFGF最初是作為146個胺基酸的多肽從腦和腦垂體中分離的(Esch et al.，PNAS USA 82，6507-6511，1985)。已克隆了牛bFGF的基因(Abraham et al.，Science，233，545-548，1986)。據核苷酸序列可推測出一個155胺基酸的bFGF轉譯產物。進一步的工作表明，在加入酶抑制物後可從正常腦垂體組織中連同146胺基酸bFGF一起分離到154胺基酸bFGF(Ueno et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.138，580-588，1986)而且腦和肝癌細胞中的酸性蛋白酶可裂解bFGF(Klagsbrun et al.，PNAS USA 84，1839-1843，1987)。
使用蛋白質工程技術有可能得到用於治療目的的重組生長因子。然而，一旦這些生長因子得以表達，即可被加工成不同形式的混合物。在這方面，FGF也不例外(Barr et al，J.Biol.Chem.263，31，16471-16478，1988)。
我們現已設計了一種製備其末端被截短之bFGF的方法。可用該方法由更長形式的bFGF製得146胺基酸形式的bFGF，並由bFGF的混合物中產生出單一形式的bFGF。所得產物是純的且不摻雜其他形式的bFGF。
因此，本發明提供了一種製備bFGF的方法，該方法包括(ⅰ)使肝素或硫酸肝素與具有9-10Leu-Pro鍵的bFGF間形成加合物;
(ⅱ)用胃蛋白酶A或組織蛋白酶D處理該加合物，以裂解所說的鍵;以及(ⅲ)由加合物中釋放出如此製得的bFGF。
步驟(ⅰ)中可利用各自有9-10Leu-Pro鍵、從位置11到其各C末端有相同的胺基酸序列、且具有不同的N末端胺基酸序列的2種或多種bFGF的混合物。它們的胺基酸序列可只因有不同的N末端而有所差異。典型情況下，bFGF序列之間僅有的差異是N末端胺基酸殘基的數目不同。一種bFGF不能比另一種bFGF多有一個或幾個N末端胺基酸殘基。另外，各bFGF間可能在第9位胺基酸之前的N末端序列中包含不同的殘基。
因此，本發明方法有可能適用於任何下述bFGF的混合物，即混合物中各bFGF的胺基酸序列均以序列編號小於9的N末端胺基酸殘基開始，且各bFGF具有不同的N末端。因此，應用於步驟(ⅰ)的混合物可由具有下列通式的bFGF組成NH2-(AA)x-Leu-Pro-Y-COOH其中AA是任何胺基酸殘基，X是0或正整數，Y代表(11-155)bFGF的胺基酸序列。全長bFGF具有155個胺基酸殘基並可定名為155-bFGF或(1-155)bFGF。人(1-155)bFGF的胺基酸序列示於SEQIDNO1中。因此本發明可應用於(1-155)bFGF至(8-155)bFGF之一或其中兩種或多種的混合物，此時上述通式中的X分別是8至1的正整數，且(AA)x代表SEQ IDNOS2-6中之一所述的序列、IleThrThr、ThrThr或Thr。特別是，本發明可適用於154胺基酸殘基bFGF〔(2-155)bFGF〕和153胺基酸殘基bFGF〔(3-155)bFGF〕的混合物。
通常可用DNA重組技術製得bFGF或bFGF的混合物。在這樣的混合物中，因為在其N末端加工各轉譯產物，故可得到不同形式的bFGF。所有的或各bFGF均可以是人、小鼠或齧齒動物bFGF。
可按常規方法在選自肝素和硫酸肝素的bFGF保護劑與bFGF之混合物間形成加合物。保護劑和bFGF大多都是以水溶液形式提供的。該溶液可以是經過緩衝的。可以加入二硫蘇糖醇等抗氧化劑以防止蛋白質氧化。bFGF保護劑的比例可以是從0.5∶1到10∶1(W/W)，如1∶1到5∶1(W/W)。作為加合物來保護bFGF，可防止在加入胃蛋白酶A時使之遭受進一步的水解。
然後是使胃蛋白酶A(EC3.4.23.1)或組織蛋白酶D(EC3.4.23.5)與加合物接觸，從而特異地裂解包含在加合物中之bFGF的9-10Leu-Pro鍵。可在加合物的溶液中提供酶，因此可將酶加到bFGF和保護劑內。一般酶是在調到PH4～6的溶液中提供的。
如在使用胃蛋白酶A的情況下，可將溶液保溫30分鐘至10小時，例如1至8小時。如使用組織蛋白酶，一般保溫時間更長達90至130小時，較好為大約110小時。保溫溫度可從5℃至室溫，例如10℃左右。保溫直到反應完成為止。
另外，可將保護劑固定在載體上製成親和柱。可使用任何一種適當的載體，如瓊脂糖凝膠或交聯的葡聚糖凝膠珠(例如Sepharose)。將bFGF的溶液加到柱上。bFGF與保護劑結合併保留在柱上。然後使酶溶液通過柱。最後，可從柱上洗脫被截短的單一形式的bFGF。此可用氯化鈉水溶液的線性梯度來完成。
可按本發明的方法得到純的bFGF，特別是可得到稱為(10-155)bFGF的146胺基酸形式的bFGF。例如可用如此得到的bFGF治療創傷和燒傷。可作為任何適當的配製品將bFGF應用於創傷或燒傷。因此這樣的配製品可另外含有生理上可接受的載體或稀釋劑。
提供下列實施例(包括製備實施例和比較實施例)進一步闡述本發明。
製備實施例製備154/153形式的bFGF按照歐洲專利申請EP-A-363675中所述的方法構建bFGF的合成DNA序列和攜帶這一序列的表達質粒。所用發酵和純化方法如下所述(a)發酵方法用攜帶編碼bFGF之人基因和四環素抗性基因的質粒轉化得自Institute Pasteur collection的B型大腸桿菌菌株。使用該轉化菌株來生產重組的非糖基化h-bFGF(人bFGF)。製備該菌株的主細胞庫(15個凍幹管)和工作細胞庫(W.C.B.)(70個儲存於-190℃液氮中的管)。用一管W.C.B作為發酵階段的接種物。發酵過程在裝有4升培養基的10升發酵罐內進行。向培養基內加入鹽酸四環素以維持菌株選擇條件。37℃發酵20小時後，最終生物量乾重為42±Zg/L，以比較凝膠電泳法測得bFGF產率為2500±500mg/L。
為了使細菌生長良好，發酵期間須供入純氧。
(b)初步純化以離心法由總發酵液中分離細胞(微生物)。將所得沉澱物重新懸浮於含氯化鈉的磷酸鈉緩衝液中。為有效地破碎細胞，須使之至少三次通過高壓勻漿器。離心澄清所得溶胞產物，收集上清作進一步的處理。
(c)純化將澄清的上清液加到Sepharose(商品名)SFast Flow(陽離子交換劑)柱上，並使用磷酸鹽緩衝液中漸增氯化鈉濃度的梯度由柱上洗脫產物。然後在用磷酸鹽緩衝液中漸增的氯化鈉濃度梯度洗脫的肝素-Sepharose 6B柱上進一步純化該產物。最後在Sephadex(商品名)G25樹脂柱上進行緩衝液交換，得到溶於大量產物緩衝液(磷酸鈉-EDTA)中的產物。
(d)柱消毒經用氫氧化鈉溶液洗滌來消毒Sepharose S Fast Flow和Sephadex G25柱。另外可用PH8.5和PH5.5的含3M氯化鈉的溶液洗肝素-Sepharose。
以這種方式得到154/153形式的bFGF。亦即得到含下列組分的約50∶50混合物具有155個胺基酸的胺基酸序列的154胺基酸人bFGF〔(2-155)bFGF〕，其為Abraham等人所報導的、有SEQ ID NO∶1中所示序列但沒有N末端Met殘基的bFGF形式;和由SEQIDNO∶1中所示155個胺基酸之bFGF形式組成的但沒有N末端Met和Ala殘基的153胺基酸人bFGF〔(3-155)bFGF〕。
實施例1用硫酸肝素作保護劑;胃蛋白酶A1.蛋白質樣品的製備在緩衝溶液10mM磷酸二氫鈉、0.1mMEDTA二鈉鹽(PH6.0)中以1.8mg/ml的濃度提供製備實施例中得到的154/153形式的bFGF。
為避免蛋白質在控制的水解期間氧化，向1.8mg bFGF中加入20mg二硫蘇糖醇。
2.bFGF的酶促水解程序a)保護劑的標準溶液溶液1∶20mg保護劑加在1mlH2O中。
b)bFGF和保護劑溶液的製備100ml蛋白質樣品、9μl溶液1、3μl1M檸檬酸鈉(PH3.0)、70μlH2O、18μg(18μl1)由豬小腸黏膜中製得的胃蛋白酶A，終體積200μl。
保護劑為硫酸肝素，且bFGF/保護劑比例為1∶1(W/W)。向bFGF和保護劑的溶液(PH4.0)中加入胃蛋白酶A(EC3.4.23.1)，並於10℃下保溫1小時。
3.酶促水解的動力學在不同時間經SDS-PAGE分析法監測水解過程。於1、20、40和60分鐘後用SDS-PAGE法分析消化混合物的樣品。使用Phast System(商標名，Pharmacia)裝置在SDS-PAGE分析中分離154/153bFGF和146-bFGF。限定下述樣品製備條件，以避免樣品在高密度Phast凝膠的堆積帶中形成蛋白質沉澱15μl蛋白質溶液，10μl的40mM Tris-HCl、4mM EDTA、10%SDS、20%巰基乙醇(PH8.0)，3μl DMSO(二甲基亞碸)和1μl溴酚蘭(0.3%)。
將樣品於100℃下加熱5分鐘使之變性。樣品分析結果表明，在取自1小時後消化混合物的樣品中，154/153-bFGF片段已完全消失。得到一個大片段，它與作為參考使用的146-bFGF重組片段完全相符。
4.bFGF的純化將反應混合物直接加到用10mM Tris緩衝液(PH8.0)、0.5M NaCl預平衡的肝素-瓊脂糖柱上。使用0.5M至3M Nacl的梯度在濃度梯度為1.5M NaCl時洗脫bFGF。使用154/153bFGF作為參考，以Bradford方法測定蛋白質濃度。
5.對146胺基酸形式bFGF的電吸印分析用於該電吸印分析的程序與Ploug等人(Anal.Biochem181，33-39，1989)所述者相似。使用的膜是Immobilon PVDF膜(Millipore)。
電泳後，將凝膠置於轉移緩衝液(10mM CAPS(3-〔環己基氨基〕-1-丙磺酸)PH11.0、20%甲醇)中平衡10分鐘。先用純甲醇將Immobilon PVDF膜潤溼，然後在轉移緩衝液中平衡備用。使用半乾吸印裝置(Kyhse-Andersen，J.Biochem.Biophys.Methods，10，203-209，1984)。電轉移過程以0.2mA/Cm2進行2小時。
用水衝洗PVDF膜，然後用加在50%(V/V)甲醇中的0.1%(W/V)考馬斯亮藍R-250染色1分鐘。用水簡單洗滌除去過多的染料，然後在含10%(V/V)醋酸的40%(V/V)甲醇中脫色5-10分鐘。將PVDF膜再次在水中小心衝洗後用於序列分析。
6.氨基末端序列分析切下PVDF膜上含著染之蛋白質的區域，並作為單層置於Polybrene限制之濾膜的頂上。使用配有120A型PTH-胺基酸分析儀的470A型Applied Biosystems序列分析儀進行序列測定。
在這些條件下，測知蛋白質NH2末端部分的前三個胺基酸是Pro-Ala-Leu。這些胺基酸相當於146-bFGF之氨基末端的三個胺基酸。
7.雷射掃描光密度分析進行這一分析是為了確定在154/153-bFGF經胃蛋白酶A水解1小時後所產生之146-bFGF的百分率。1小時後，將50μl反應混合物與50μlSDS變性緩衝液混合。在同樣條件下，對不同蛋白質濃度的bFGF樣品作SDS變性處理。在PAA4/30凝膠(Pharmacia)上電泳分離這些樣品。使用LKB BROMA2220記錄積分儀分析各峰的光密度值。利用在這些條件製備的標準曲線，測得146-bFGF的濃度相當於原154/153-bFGF濃度的91%。
8.親和層析純化後的146-bFGF產率在肝素一瓊脂糖柱上純化146-bFGF後測定酶促水解反應產物的得率。將得自上述步驟2的1.64mg反應混合物加在已用10mMTris(PH8)、0.5MNaCl預平衡的肝素一瓊脂糖柱上。在PH8、胃蛋白酶A完全無活性且硫酸肝素與bFGF的複合物失去了穩定性的情況下，使bFGF吸附到以過量存在於培養基中的肝素一瓊脂糖上。以1.5MNaCl濃度洗脫bFGF。回收到1.14mg146-bFGF。
在使用硫酸肝素作為保護劑進行有控制的水解及親和柱層析純化之後，所得146-bFGF的總得率為73%。
實施例2用肝素作保護劑;蛋白質酶A重複實施例1所述的程序，不同的是用肝素作保護劑，bFGF-肝素比例為5∶1(W/W)，於2分鐘和4、6、8小時後分析消化混合物的等分樣品，且總保溫時間為8小時。bFGF和肝素的溶液由下列組分構成100μl蛋白質樣品，18μl溶液2，3μl1M檸檬酸鈉(PH3.0)，70μlH2O，18μg胃蛋白酶A，終體積200μl。
其中溶液2由100μl溶液1和900μlH2O組成。在這些條件下，保溫8小時後也是只得到1個片段。用SDS-PAGE分析法測得該片段表現分子量為16，200。
經氨基末端序列分析，得到同實施例1中所述的三個N末端胺基酸Pro-Ala-Leu。
實施例3用肝素作保護劑;胃蛋白酶A在肝素-瓊脂糖柱上純化146-bFGF片段後，測定由肝素保護的bFGF經控制的水解作用所獲產物的得率。在實施例2中所述的相同條件下水解7小時後，將含有1.54mgbFGF的反應介質加到用10mM磷酸鈉緩衝液(PH8.0)和0.5MNaCl預平衡的肝素-瓊脂糖柱上。在1.5MNaCl梯度時洗脫出1.02mg146-bFGF。
使用肝素作保護劑，經親和柱層析後所得146-bFGF形式產物的總收率為69%。
實施例4用固定於瓊脂糖上的肝素作保護劑;胃蛋白酶A1.bFGF酶促水解方法用10mM磷酸鈉、0.1mMEDTA、0.5MNaCl(PH4.0)於10℃下預平衡肝素-瓊脂糖柱(7ml凝膠，含5.6mg肝素)。將154/153-bFGF裝填於該親和柱上。然後再將在同樣磷酸鹽溶液中稀釋的0.18mg胃蛋白酶A加到柱頂。該酶以0.5ml/分鐘的流速反覆循環過柱6小時。
在時間達6小時時，先用10mM磷酸鈉緩衝液(PH7.0)0.1mMEDTA、0.5MNaCl(三倍體積)洗柱，然後再用0.5至3MNaCl梯度洗柱。bFGF在NaCl梯度為1.5M時洗脫。
2.氨基末端序列分析電泳後，按實施例1所述使用半乾吸印裝置將凝膠電吸印到Immobilon PVDF膜上。切下含著染之蛋白質的PVDF膜區域，並作為單層置於Polybrene限制之濾膜的頂上。在這些條件下，測知蛋白質NH2末端部分的前三個胺基酸是Pro-Ala-Leu，它們相當於146-bFGF之氨基末端部分的三個胺基酸。
3.146-bFGF回收率定量分析由肝素-瓊脂糖柱上洗出的146-bFGF片段後，檢測水解反應產物的回收率。結果回收到1.28mg146-bFGF。在肝素-瓊脂糖柱上經過控制的水解後，所得146-bFGF胺基酸形式產物(MW＝16，200)的總得率為81%。
實施例5用肝素作保護劑;組織蛋白酶D1.bFGF酶促水解方法重複實施例2，但不同的是用得自牛脾臟的組織蛋白酶D代替胃蛋白酶A，並且保溫時間為110小時。
2.反應動力學雖然酶促水解期間得到的146-bFGF片段顯現很不清楚，但1小時後仍可用SDS-PAGE分析法檢測到。72小時後，154-153-bFGF水解作用尚未完成，此時向反應介質中加入36μg組織蛋白酶D。40小時後反應方可完成。這是由於組織蛋白酶D的活性低(10單位/mg)。
3.氨基末端序列分析電泳後，按實施例1所述使用半乾吸印裝置將凝膠電吸印到Immobilon PVDF膜上。切下含有著色之蛋白質的PVDF膜區域並作為單層置於Polybrene限制的濾膜上。用配有120A型PTH-胺基酸分析儀的470A型APPlied Biosystems序列儀進行序列分析。在這些條件測知蛋白質NH2末端部分的前三個胺基酸是Pro-Ala-Leu。
比較實施例1胃蛋白酶A;沒有保護劑重複實施例1，但不同的是不加保護劑。在幾分鐘內用胃蛋白酶A完全消化154/153形式的bFGF。
比較實施例2組織蛋白酶D;沒有保護劑重複實施例5，但不同的是反應中不存在保護劑。在幾分鐘內用組織蛋白酶D完全消化154/153形式的bFGF。
比較實施例3α-胰凝乳蛋白酶重複實施例1，但不同的是用α-胰凝乳蛋白酶代替胃蛋白酶A，並且不加保護劑。在幾分鐘內用α-胰凝乳蛋白酶完全消化154/153形式的bFGF。因此試驗了不同的陰離子化合物保護bFGF免受α-胰凝乳蛋白酶水解的能力。
1.肝素3，000(Sigma，H7516)bFGF/保護劑比例＝1;溫度＝10℃;
PH＝7.5;保溫時間＝4小時。
使用肝素3，000作為保護劑，如用SDS-PAGE分析法測出的，主要得到一個表現分子量為14，000的片段，以及一些其他較低分子量的片段。
2.肝素(Sigma，H3125)bFGF/保護劑比例(W/W)＝5;溫度＝10℃;
PH＝7.5;保溫時間＝4小時使用這一品級的肝素作保護劑，不能發揮適當的保護作用，而得到許多片段。
3.硫酸軟骨素bFGF/保護劑比例(W/W)＝1;溫度＝10℃;
PH＝7.5;保溫時間＝2小時不能發揮適當的保護作用，而得到許多片段。
4.硫酸皮膚素bFGF/保護劑比例(W/W)＝1;溫度＝10℃;
PH＝7.5;保溫時間＝2小時不能發揮適當的保護作用，而得到許多片段。
5.聚天冬氨酸bFGF/保護劑比例(W/W)＝1;溫度＝10℃;
PH＝7.5;保溫時間＝2小時使用聚天冬氨酸作保護劑不能發揮適當的保護作用，而得到許多片段。
實施例6用肝素或硫酸肝素作保護劑;胃蛋白酶A或組織蛋白酶D
1.實施程序在溶液中對可溶性bFGF-肝素和bFGF-硫酸肝素複合物作蛋白水解處理在10mM檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液(PH4.0)中，使1.6mg154/153胺基酸形式的bFGF與1.6mg肝素或硫酸肝素於10℃下複合。保溫1小時後，向溶液內加入160μg胃蛋白酶A(Sigma P-6887，3200-4500單位/mg蛋白質)。於不同時間取反應混合物樣品並於4℃下直接加到用10mM磷酸鹽緩衝液(PH8.0)/0.5NaCl預平衡過的肝素-Sepharose柱上。然後用同樣的緩衝液徹底洗柱並用加在10mM磷酸緩衝液(PH8.0)中的3MNaCl洗脫bFGF。合併的各部分在預先用10mM磷酸鹽緩衝液(PH6.0)平衡過的Sephadex G25柱上脫鹽後進行SDS-PAGE分析。使用硫酸肝素作保護劑，1小時後即可得到一定量回收率的146-bFGF。用胃蛋白酶處理bFGF-肝素複合物時，則於保溫6.5小時時達到同樣的收率。
用胃蛋白酶A處理結合到肝素-Sepharose柱上的bFGF取50mgbFGF(154/153)以2.5ml/分鐘的流速過預先在25mM檸檬酸鹽緩衝液(PH4.0)/0.5M NaCl(4℃)平衡過的肝素-Sepharose柱(Pharmacia)(2.6×22.5cm)。4℃下使680單位/ml溶於檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液中的豬胃蛋白酶A(Sigma)溶液以2.5ml/分鐘的流速連續反覆通過柱3小時。然後用25mM磷酸鹽緩衝液(PH8.0)/0.5MNaCl徹底洗柱以失活並除去酶。用加在25mM磷酸鹽緩衝液(PH8.0)中的3MNaCl逐步洗脫bFGF。收集含bFGF的各管，在Amicon PM10膜上超濾濃縮，並在預先用10mM磷酸鹽緩衝液(PH6.0)平衡的Sephadex G25柱(Pharmacia)上除鹽。
N末端序列分析在配有120A型PTH-胺基酸分析儀的477A型脈衝液相序列儀(Applied Biosystems，CA，USA)上進行自動N末端序列分析。使用稍加改動的Normal-1程序。所有序列分析材料和試驗劑均購自Applied Biosystems。
C末端序列分析在室溫下，在10mM醋酸鈉緩衝液(PH3.8)/0.05%Brij-35中研究羧肽酶P消化bFGF的時間過程，其中所用酶對底物的比例為大約1∶100(W/W)(Lu et al，J.Chromatogr.447，351-364，1988)。
用0.1-0.2μgCpP(Boehringer)將0.5-1nmol蛋白質消化2小時;加入N-亮氨酸作為內部標準。於不同時間抽取10/100μl等分樣品，在420A型衍生儀(APPlied Biosystems)上用PITC自動衍生，並注入配有130A型分析儀的RP-HPLC柱中後進行胺基酸分析。在PTC-C8柱(P/N0711-0204，220×2.1mm，5μ，Applied Biosystems)上分離衍生的PTC胺基酸。
生物學試驗使用由牛主動脈得到的內皮細胞株(BAEC)研究bFGF誘導的增殖反應。將細胞懸浮在由添加了13%胎牛血清(FBS)(Gibco，UK)的Dubecco氏改良的Eagle培養基(DMEM)組成的完全培養基中，並以每孔2500個細胞鋪敷在96孔微量滴定板中。附著後，將上述完全培養基換成由添加了0.5%胎牛血清(FBS)、0.1%牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，USA)和所需濃度之bFGF(Erbamont)的DMEM組成的實驗培養基。培養物被保溫3天時，用福馬林固定並用結晶紫染色。染色後，徹底衝洗各孔以除去未摻入的染料。向各孔內加入甲醇(95%;0.1ml/孔)以提取染料，達到與各孔內生長之細胞量成正比。將平板移到配有540nm濾光片的微平板分光光度閱讀器上以自動讀出測定結果。
為合成血纖維蛋白溶酶原激活劑，將懸浮於完全生長培養基中的BAEC(每孔0.2ml含3×104個細胞)接種於96孔微量滴定板中，細胞附著後將培養基換成添加了0.5%FBS、0.1%BSA和試驗濃度bFGF的DMEM。保溫28小時後，洗滌培養物並用含有0.5%Triton X-100的溶液溶解破碎細胞。使用進行醯胺水解試驗的生色底物(Spectrozyme PL)和血纖維蛋白溶酶原(兩種試劑均購自American Diagnostica Inc。)檢測細胞溶胞產物之等分樣品的血纖維蛋白溶酶原激活劑活性。
結果對bFGF的控制的酶促加工純化的重組154/153混合物與兩種不同的天冬氨酸蛋白酶即胃蛋白酶A和組織蛋白酶D一同保溫。於不同時間取反應混合物的等分樣品進行SDS-PAGE分析，結果顯示，在沒有任何保護劑的情況下，bFGF很快被消化成小肽。相反，在肝素或硫酸肝素(1∶1W/W)存在下，用胃蛋白酶A處理bFGF(154/153)(底物bFGF對酶比例10∶1W/W;PH4.0;10℃)，則可使154/153胺基酸形式逐步並完全轉化成與我們的146/145胺基酸形式標準樣品共遷移的較低分子量形式。
電吸印到PDVF膜上後，在脈衝液相序列分析儀上對酶促消化產生的低分子量帶進行自動N末端序列分析。前三次循環得出一個單的同源序列Pro-Ala-Leu，其相當於已知146胺基酸形式的完整N末端。當延長形式的bFGF與肝素或硫酸肝素複合時，儘管bFGF分子上存在三個Leu-Pro位點，但並沒有檢測出其他序列，這表明用胃蛋白酶A消化只能特異地裂解Leu9-Pro10肽鍵。
可在用組織蛋白酶D消化後實現對如用胃蛋白酶A處理所得到的「肝素保護的」NH2末端延長之bFGF分子的控制的蛋白水解性裂解，但這一蛋白水解反應需要較長的時間，此可能是由於所用的酶製劑的比活性較低。當在PH7.5的相似條件下加入胰凝乳蛋白酶時，可在對保溫混合物進行凝膠電泳後測得分子量約14，000道爾頓的單一肽，而沒有存在146胺基酸形式之bFGF的證據。
在肝素-Sepharose柱上批量酶促加工bFGF用結合到肝素-Sepharose柱上的延長之bFGF的154/153混合物進行大批量加工，以進一步證實在溶液中和小批量反應中得到的結果。為此，將50mgbFGF(154/153)加到預先用檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液(pH4.0)平衡過的肝素-Sepharose柱上。4℃下使胃蛋白酶A的溶液連續通過柱3小時。然後在鹼性PH下用磷酸鹽緩衝液洗柱，以失活並除去酶。用加在磷酸鹽緩衝液(pH8.0)中的3MNaCl由柱上洗脫所得到的多肽。收集含bFGF部分並在Sephadex G25柱上脫鹽。
合併的各管經SDS-PAGE分析後，顯示出一條分子量相當於146/145bFGF標準品的單一帶。反相HPLC分析也出現單一峰。N末端序列分析得到一個相當於146胺基酸bFGF之正確的完整N末端，即Pro-Ala Leu-。C末端分析則顯示出bFGF分子之預期的羧基末端，即-Ala-Lys-Ser。因此，當bFGF同樣結合於肝素-Sepharose樹脂柱上時，胃蛋白酶A也能在Leu9-Pro10鍵上特異地裂解該分子，產生146胺基酸形式的同源序列。
對bFGF的體外生物學分析比較按所述蛋白水解方法得到的146胺基酸形式之bFGF混合物與154/153胺基酸形式之bFGF的生物學活性。用牛主動脈內皮細胞(BAEC)研究其誘導增殖反應及合成血纖維蛋白酶原激活劑這兩種活性。兩種檢測法均進一步證實酶促水解所得到的146胺基酸形式的bFGF與154/153胺基酸形式的bFGF相比，兩者在體外具有彼此相當的生物學活性。
序 列 列 示(1)SEQ ID NO∶1的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度155個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈形式單股(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶1Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly1 5 10 15Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu20 25 30Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg35 40 45Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu50 55 60Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn65 70 75 80Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys85 90 95Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr100 105 110
Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys115 120 125Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys130 135 140Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser145 150 155(2)SEQ ID No∶2的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度8個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈形式單股(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶2Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr1 5(3)SEQ ID No∶3的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度7個胺基酸(B)類型胺基酸
(C)鏈形式單股(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶3Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr1 5(4)SEQ ID No∶4的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度6個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈形式單股(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶4Ala Gly Ser Ile Thr Thr1 5(5)SEQ ID No∶5的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度5個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈形式單股(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶5Gly Ser Ile Thr Thr1 5(6)SEQ ID No∶6的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈形式單股(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶6Ser Ile Thr Thr權利要求
1.製備鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)的方法，其包括(ⅰ)使肝素或硫酸肝素與具有9-10Leu-Pro鏈的bFGF之間形成加合物；(ⅱ)用胃蛋白酶A或組織蛋白酶D處理該加合物，以裂解所說的鍵；以及(ⅲ)由加合物中釋放出如此得到的bFGF。
2.根據權利要求1的方法，其中步驟(ⅰ)中使用的是其中胺基酸序列不同僅在於有不同N末端的兩個或多個所說之bFGF的混合物。
3.根據權利要求2的方法，其中所說的混合物是由具有下列通式的bFGF組成的NH2-(AA)x-Leu-Pro-Y-CooH其中AA是任何胺基酸殘基，X是0或正整數，且Y代表(11-155)bFGF的胺基酸序列。
4.根據權利要求3的方法，其中(AA)x代表SEQ ID Nos，2至6中所示的序列、IleThrThr、ThrThr或Thr。
5.根據權利要求3的方法，其中所說的混合物是由(2-155)bFGF和(3-155)bFGF組成的。
6.根據前述權利要求中之任一項的方法，其中所有的或各bFGF均為人、小鼠或齧齒動物bFGF。
7.根據前述權利要求中之任一項的方法，其中在步驟(ⅰ)中肝素或硫酸肝素以及所有的或各bFGF是在緩衝的水溶液中提供的，且在步驟(ⅱ)中將胃蛋白酶A或組織蛋白酶D加入所得溶液中。
8.根據權利要求1至8中任一項的方法，其中在步驟(ⅰ)中肝素或硫酸肝素被固定在載體上以形成親和柱，將所說之bFGF的溶液加到該柱上，在步驟(ⅱ)中使胃蛋白酶A或組織蛋白酶D的溶液通過如此裝填的柱，且在步驟(ⅲ)中由柱上洗脫如此得到的截短的單一形式的bFGF。
9.根據前述權利要求中之任一項的方法，其進一步包括將如此得到的單一形式的bFGF與藥用載體或稀釋劑一起配製。
全文摘要
公開了製備bFGF的方法，其包括(i)使肝素或硫酸肝素與具有9-10Leu-Pro鍵的bFGF間形成加合物；(ii)用胃蛋白酶A或組織蛋白酶D處理該加合物，以裂解所說的鍵；以及(iii)由加合物中釋放出如此得到的bFGF。該方法可用於由較長形式的bFGF製備146個胺基酸形式的bFGF。其也可用於由bFGF的混合物中產生單一形式的bFGF，所說bFGF混合物中各bFGF之胺基酸序列的差異僅在於它們具有不同的N末端。
文檔編號C07K1/00GK1058597SQ91105269
公開日1992年2月12日 申請日期1991年8月2日 優先權日1990年8月2日
發明者P·蒙森, F·保羅, D·貝特貝德, P·薩密託斯 申請人:法米塔利亞·卡洛·埃巴有限責任公司