玉米ZmBES1/BZR1-1基因在提高植物產量中的應用

2024-04-12 14:26:05 1

玉米zmbes1/bzr1-1基因在提高植物產量中的應用
技術領域
1.本發明涉及基因工程領域，特別是涉及玉米zmbes1/bzr1-1基因在提高植物產量中的應用。


背景技術：

2.玉米、水稻等是我國重要的糧食作物，高產是研究人員在作物品種培育過程中最重要目標。近些年，利用基因工程手段改良農作物的農藝性狀已經是一種比較常見的技術手段，這也為農作物產量的提高提供了一種新的解決途徑。專利zl202010362305.2玉米zmbes1/bzr1-5基因在培育大籽粒植物中的應用中，公開了zmbes1/bzr1-5基因序列及其在調控籽粒發育中的作用。多年來，隨著人們對於基因了解的深入，將基因和傳統育種相結合培育高產品種已經是急需解決的問題，雖然已經有多種農作物基因水平增產研究的相關報導，但是在玉米、水稻等農作物的栽培種植上，一直還沒有高效增產基因的有效分離和應用相關報導。
3.然而，在現有的研究中針對玉米zmbes1/bzr1-1基因功能性分析尚未報導，也沒有利用該基因改善作物產量的方法。


技術實現要素：

4.本發明的目的是提供玉米zmbes1/bzr1-1基因在提高植物產量中的應用，以解決上述現有技術存在的問題，該基因可以明顯提高轉基因植物的產量。
5.為實現上述目的，本發明提供了如下方案：
6.本發明提供玉米zmbes1/bzr1-1基因在提高植物產量中的應用，所述玉米zmbes1/bzr1-1基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
7.進一步地，包括促進植物種子的粒長、粒寬和千粒重增加。
8.本發明還提供一種培育高產植物的方法，將玉米zmbes1/bzr1-1基因轉化入植物過量表達，獲得純合的轉基因植株，即為高產植株。
9.進一步地，所述將玉米zmbes1/bzr1-1基因轉化入植物過量表達具體包括：設計zmbes1/bzr1-1基因的擴增引物進行該基因的pcr擴增，利用擴增產物和載體構建包含zmbes1/bzr1-1基因的重組質粒，再將所述重組質粒轉化入植物中，進行zmbes1/bzr1-1基因過量表達。
10.進一步地，所述擴增引物的核苷酸序列如seq id no:2-3所示。
11.進一步地，所述重組質粒為pcambia2300-35s-zmbes1/bzr1-1-egfp或pcambia1300-35s-zmbes1/bzr1-1-egfp。
12.進一步地，所述pcambia2300-35s-zmbes1/bzr1-1-egfp的核苷酸序列如seq id no:6所示；所述pcambia1300-35s-zmbes1/bzr1-1-egfp的核苷酸序列如seq id no:9所示。
13.進一步地，所述植物包括擬南芥和水稻。
14.本發明公開了以下技術效果：
15.本發明從玉米幼苗葉片中分離出zmbes1/bzr1-1基因，並將該基因轉入擬南芥和水稻中培育出轉基因植株，通過實驗驗證發現，轉基因植株明顯能夠促進其種子的粒長、粒寬和千粒重，說明該基因能提高轉基因植物的產量，在培育高產植物領域有廣闊的應用前景。
附圖說明
16.為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
17.圖1為純合轉基因擬南芥種子；
18.圖2為轉基因擬南芥種子粒長粒寬，其中*表示p《0.05，**表示p《0.01；
19.圖3為轉基因水稻陽性pcr檢測；
20.圖4為轉基因水稻種子表型鑑定；
21.圖5為轉基因水稻種子粒長粒寬，其中*表示p《0.05，**表示p《0.01；
22.圖6為純合轉基因水稻千粒重，其中*表示p《0.05，**表示p《0.01。
具體實施方式
23.現詳細說明本發明的多種示例性實施方式，該詳細說明不應認為是對本發明的限制，而應理解為是對本發明的某些方面、特性和實施方案的更詳細的描述。
24.應理解本發明中所述的術語僅僅是為描述特別的實施方式，並非用於限制本發明。另外，對於本發明中的數值範圍，應理解為還具體公開了該範圍的上限和下限之間的每個中間值。在任何陳述值或陳述範圍內的中間值以及任何其他陳述值或在所述範圍內的中間值之間的每個較小的範圍也包括在本發明內。這些較小範圍的上限和下限可獨立地包括或排除在範圍內。
25.除非另有說明，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所述領域的常規技術人員通常理解的相同含義。雖然本發明僅描述了優選的方法和材料，但是在本發明的實施或測試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法和材料。本說明書中提到的所有文獻通過引用併入，用以公開和描述與所述文獻相關的方法和/或材料。在與任何併入的文獻衝突時，以本說明書的內容為準。
26.在不背離本發明的範圍或精神的情況下，可對本發明說明書的具體實施方式做多種改進和變化，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。由本發明的說明書得到的其他實施方式對技術人員而言是顯而易見的。本技術說明書和實施例僅是示例性的。
27.關於本文中所使用的「包含」、「包括」、「具有」、「含有」等等，均為開放性的用語，即意指包含但不限於。
28.實施例1基因克隆及載體構建
29.取五葉期玉米b73幼苗葉片，液氮速凍研磨，使用總rna提取試劑盒trizol(takara)並按照其說明書提取總rna。用primescript
tm
rtregeantkit試劑盒(takara公司)，以總rna為模板進行cdna的合成。利用primer5.0設計zmbes1/bzr1-1基因(id:
zm00001d046305)克隆引物，以b73cdna為模板，具體pcr引物如表1。使用primerstar(takara公司)高保真酶進行擴增，pcr擴增反應體系如表2，溫度循環程序為：94℃，3min；98℃，10s，最適退火溫度10s；72℃，20s；30個循環；72℃5min；4℃保持。擴增產物測序，其序列如seq id no：1所示。
30.表1zmbes1/bzr1-1克隆引物
[0031][0032]
表2pcr擴增反應體系
[0033][0034][0035]
1.轉化擬南芥載體pcambia2300-35s-zmbes1/bzr1-1-egfp構建
[0036]
根據雙子葉植物表達載體pcambia2300-35s-egfp多克隆位點，在其上遊引物引入bamhi酶切位點，下遊引物引入sali位點，具體序列如下：
[0037]
表3構建pcambia2300-35s-zmbes1/bzr1-1-egfp載體引物
[0038][0039]
按表2所示反應體系加樣，進行擴增。溫度循環程序為：94℃3min；98℃10s，最適退火溫度10s，72℃20s，30個循環；72℃5min；4℃保持。
[0040]
對pcr產物進行回收。將回收產物，pcambia2300-35s-egfp質粒進行雙酶切，按表4反應體系進行加樣。將酶切體系混勻，置於30℃水浴鍋中，酶切6～8h，酶切產物加入上樣緩衝液後，直接電泳，回收酶切產物，使用clonexpress ii one step cloning kit(諾唯贊)連接酶切載體和目的片段，反應體系如表5，反應條件：37℃30mins。
[0041]
表4雙酶切反應體系
[0042][0043]
表5連接體系
[0044][0045]
連接產物轉化大腸桿菌，並進行菌落pcr檢測。提取重組質粒經限制性內切酶酶切鑑定之後，重組質粒菌液送測序公司進行dna的序列測序鑑定，經測序正確的質粒pcambia2300-35s-zmbes1/bzr1-1-egfp(seq id no:6)將於下一步擬南芥轉化。
[0046]
2.轉化水稻載體pcambia1300-35s-zmbes1/bzr1-1-egfp構建
[0047]
根據單子葉植物表達載體pcambia1300-35s-egfp多克隆位點，在其上遊引物入hind iii酶切位點，下遊引物引入bamhi位點，具體序列如表6。利用primerstar(takara公司)高保真酶進行擴增，pcr擴增反應體系如表2。之後對pcr產物進行回收。
[0048]
表6構建pcambia1300-35s-zmbes1/bzr1-1-egfp載體引物
[0049][0050]
將表達載體pcambia1300-35s-egfp質粒進行雙酶切，按表4反應體系進行加樣。將酶切體系混勻，置於30℃水浴鍋中，酶切6～8h，酶切產物加入上樣緩衝液後，直接電泳，回收酶切產物，使用clonexpress ii one step cloning kit(諾唯贊)連接目的基因和載體，反應體系如表5，反應條件：37℃30mins。
[0051]
連接產物轉化大腸桿菌，並進行菌落pcr檢測。提取重組質粒經限制性內切酶酶切鑑定之後，組質粒菌液送測序公司進行dna的序列測序鑑定，經測序正確的質粒pcambia1300-35s-zmbes1/bzr1-1-egfp(seq id no:9)將於下一步水稻轉化。
[0052]
實施例2擬南芥、水稻轉化及陽性鑑定
[0053]
1.利用花絮侵染法轉化擬南芥
[0054]
探索玉米zmbes1/bzr1-1的功能，我們用農桿菌介導的花絮浸染法將pcambia2300-35s-zmbes1/bzr1-1-egfp載體轉化擬南芥哥倫比亞野生型col(wt)。
[0055]
1.1花序浸染法轉化
[0056]
(1)取含有重組質粒的農桿菌，在含有kana和rif的yep平板上劃線，28℃培養2～
3d。
[0057]
(2)挑取農桿菌單菌落接種在3ml含kana和rif的yep液體培養基中，28℃，200r/min，振蕩過夜培養。
[0058]
(3)在100ml液體yep培養基中(含kana和rif)，接種1ml過夜培養的起始農桿菌菌液，28℃振蕩培養至菌液od
600
值為1.2～1.5。
[0059]
(4)4℃5000r/min離心10min收集細胞，用5％蔗糖溶液懸浮菌體並調od
600
值至0.8～1.0，按1％～2％的比例加入表面活性劑silwetl-77。
[0060]
(5)用擬南芥專用營養土盆栽培養擬南芥野生型col，開花後修剪已形成果莢和已經開放的花，用上述侵染液浸泡花序1.5～2.0min，黑暗培養10h。
[0061]
(6)在適宜的條件下培養3～4周，收集種子，進行下一步篩選處理。
[0062]
1.2抗性培養基篩選
[0063]
(1)將收穫的侵染後種子，分裝至1.5ml的ep管，用500μl的70％酒精浸泡30s。
[0064]
(2)吸掉酒精後，用500μl的10％次氯酸鈉浸泡5～10min，期間不斷搖晃離心管以至種子與次氯酸鈉充分接觸。
[0065]
(3)用滅菌水清洗種子4～6次，待種子沉下後，棄上層ddh2o；200μl的0.1％瓊脂水懸浮種子。
[0066]
(4)將種子點播至含40mg/l的卡那黴素(kana)的1/2ms培養基中培養。
[0067]
(5)重複上述步驟，直至收穫t3代純合的陽性苗。
[0068]
1.3對獲得的陽性株系進行基因組pcr鑑定
[0069]
(1)取植物新鮮組織100mg，加入液氮充分碾磨。加入400μl緩衝液fp1和6μl的rnasea(10mg/ml)，漩渦振蕩1min，室溫放置10min。
[0070]
(2)加入130μl緩衝液fp2，充分混勻，渦旋振蕩1min，12000r/min(13400
×
g)離心5min，將上清轉移至新的離心管中。
[0071]
(3)可選步驟：將上清液再次12000r/min(13400
×
g)離心5min，將上清轉移至新的離心管中。
[0072]
(4)向上清液中加入0.7倍體積的異丙醇，充分混勻，此時會出現絮狀基因組dna。12000r/min(13400
×
g)離心2min，棄上清，保留沉澱。
[0073]
(5)加入600μl70％乙醇，渦旋振蕩5s，12000r/min(13400
×
g)離心2min，棄上清。
[0074]
(6)重複步驟(5)。
[0075]
(7)開蓋倒置，室溫5～10min，徹底晾乾殘餘的乙醇。
[0076]
(8)加入適量洗脫緩衝液te，65℃水浴10～60min溶解dna，期間顛倒混勻數次助溶，最終得到dna溶液。
[0077]
(9)使用pcr引物如表8，以提取的基因組dna為模板進行pcr檢測，程序為94℃，3min；94℃30s，最適退火溫度30s，72℃60s/kb，35個循環；72℃5min；4℃保存。
[0078]
表8轉基因擬南芥檢測引物
[0079][0080]
(10)收穫轉化的擬南芥t2代種子消毒後，播種於含有卡那黴素的1/2ms固體培養
基上，7～8d後，t2代轉基因株系w1-2和w1-4全部為綠色健壯的植株，鑑定為純合轉化體，而非純和轉化體則表現為3:1的分離(正常生長和黃化死亡植株所成的比例)。奠定為純合的轉基因株系w1-2和w1-4，其t3代種子用作進一步分析。
[0081]
2.水稻轉化
[0082]
將構建好的pcambia1300-35s-zmbes1/bzr1-1-egfp載體送未米生物公司(南京)轉化水稻野生型「日本晴」(nip)。
[0083]
2.1對獲得的陽性株系進行基因組pcr鑑定：
[0084]
(1)取植物新鮮組織100mg，加入液氮充分碾磨。加入400μl緩衝液fp1和6μl的rnasea(10mg/ml)，漩渦振蕩1min，室溫放置10min。
[0085]
(2)加入130μl緩衝液fp2，充分混勻，渦旋振蕩1min，12000r/min(13400
×
g)離心5min，將上清轉移至新的離心管中。
[0086]
(3)可選步驟：將上清液再次12000r/min(13400
×
g)離心5min，將上清轉移至新的離心管中。
[0087]
(4)向上清液中加入0.7倍體積的異丙醇，充分混勻，此時會出現絮狀基因組dna。12000r/min(13400
×
g)離心2min，棄上清，保留沉澱。
[0088]
(5)加入600μl70％乙醇，渦旋振蕩5s，12000r/min(13400
×
g)離心2min，棄上清。
[0089]
(6)重複步驟(5)。
[0090]
(7)開蓋倒置，室溫5～10min，徹底晾乾殘餘的乙醇。
[0091]
(8)加入適量洗脫緩衝液te，65℃水浴10～60min溶解dna，期間顛倒混勻數次助溶，最終得到dna溶液。
[0092]
(9)使用pcr引物如表9，以提取的基因組dna為模板進行pcr檢測，程序為94℃，3min；94℃30s，最適退火溫度30s，72℃60s/kb，35個循環；72℃5min；4℃保存。
[0093]
表9轉基因水稻檢測引物
[0094][0095]
(10)收穫轉化的水稻種子t2代，播種後檢測後代全為陽性株系的種子用作進一步分析。轉基因株系的鑑定方法同1.2的步驟(10)，經過卡那黴素篩選，純和轉基因株係為r1-8和r1-13。
[0096]
實施例3純和株系產量分析
[0097]
1.擬南芥種子表型鑑定
[0098]
將純合的轉基因擬南芥株系w1-2和w1-4和野生型(wt)用5％次氯酸鈉溶液消毒後，播種於含有1/2ms培養基上，15d後移栽至含有營養土：蛭石＝3:1土壤的50mm
×
50mm的花盆中，每盆播種4株，放在相同條件下培養直收種，測量種子粒長、粒寬。
[0099]
2.水稻種子表型鑑定
[0100]
將純合的轉基因水稻株系r1-8、r1-13和野生型(nip)播種於水田中，相同條件下培養直收種，測量種子粒長、粒寬和千粒重。
[0101]
3、結果分析
[0102]
3.1轉基因擬南芥產量分析
[0103]
通過抗性篩選，確定目的基因zmbes1/bzr1-1在擬南芥穩定表達，對純合轉基因擬南芥的種子粒長、粒寬分析(圖1)，結果表明過表達株系w1-2和w1-4種子的粒長極顯著增加，w1-2和w1-4種子粒寬顯著增大(圖2)。
[0104]
3.2轉基因水稻產量分析
[0105]
通過pcr對目的基因檢測，確定陽性株系(圖3)。對陽性株系的粒長、粒寬和千粒重分析(圖4)，結果表明過表達株系r1-8和r1-13的粒長極顯著增加，粒寬無明顯變化(圖5)。千粒重相比於對照nip顯著增加(圖6)。
[0106]
以上所述的實施例僅是對本發明的優選方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方案做出的各種變形和改進，均應落入本發明權利要求書確定的保護範圍內。