具有低糊化溫度的玉米在製備發酵產品中的用途的製作方法

2024-04-08 06:55:05

專利名稱：具有低糊化溫度的玉米在製備發酵產品中的用途的製作方法
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背景技術：
本發明涉及一種經改進的製備發酵產品的方法，該發酵產品以含有低糊化(gelatinzation)溫度的澱粉的玉米為原料。
種植玉米出於許多理由，包括其可用於食品和工業。乙醇(乙醇、穀物醇，EtOH)是一種澄清、無色的液體，具有獨特的、令人愉快的氣味，可用做汽車燃料以控制汙染。傳統的，玉米與其它農作物如糖甜菜和糖甘蔗共同使用，用於製備乙醇。
傳統上使用兩種方法之一加工玉米。溼磨方法包括在加工前浸泡或浸漬玉米以回收油，留下玉米粉。在幹磨方法中，整粒研磨並且隨後加入水以形成糊。在用玉米製備乙醇的任何方法中，都要用酶來處理所述的粉或糊以將玉米中的澱粉轉化為糖。然後用酵母發酵經酶處理後的糊或粉。酵母將糖轉化成乙醇和二氧化碳。一旦乙醇和二氧化碳被分離，如通過蒸餾，可加工餘下的未發酵的玉米，以回收其它的營養成份，也可以加工成動物飼料。
研究人員不斷地尋找更好的玉米基原料及製備高級乙醇的有效方法。現在令人驚奇地發現，含有低糊化溫度澱粉的玉米可以更有效、節能的用作製備發酵產品的原料。
發明概述本發明提供一種由含有低糊化溫度澱粉的玉米製備發酵產品的方法，該發酵產品如乙醇、檸檬酸、丁醇和氫。該方法包括將玉米與可發酵碳源的微生物混合以生產發酵產品。
本文中所用的糊化溫度是指使用差示掃描量熱法，通過實施例部分的實施例1所述的方法測量的起始糊化溫度(T0)。
除非另有說明，本文中使用的所有科技術語和縮寫的含義與本領域普通技術人員常規理解的含義相同。下文中描述了適用於本發明的方法和材料，但這些方法和材料不構成對本發明的限制。可以理解地，也可以使用類似或等同的其他方法和材料來實施本發明。通過以下關於本發明的技術方案及權利要求的描述，本發明的附加特徵及有益效果將更明晰。
發明詳述由多種品種玉米植物收穫的玉米種籽或粒(以下稱玉米粒)均可用於本發明。這些玉米植物的品種是如雜種、近交、轉基因植物、基因改良植物或特定種群。在一實施方案中，玉米來自蠟質玉米植物，該玉米植物的胚乳組織是隱性糖-2等位基因雜合的(一劑量(dose)或兩劑量)。在另一實施方案中，玉米來自蠟質玉米植物，該玉米植物的胚乳組織具有純合隱性糖-2等位基因的。其它實施例中的玉米是來自其胚乳組織是隱性糖-2等位基因、dull-糖2、dull-糖2-蠟質、直鏈澱粉extender-dull-蠟質、直鏈澱粉extender-糖2及其組合純合的玉米植物。所有這些品種均是本領域已知的，並且用於產生這些基因型玉米植物的玉米或種籽也是商業上可獲得的。
蠟質基因型(稱為wx)是本領域公知的，蠟質基因位於玉米第9號染色體的59位(參見M.G..Nueffer，L.Jones，and M.Zuber，「The Mutants of Maize」(CropScience Society of America，Madison，WI，1968)，第72-73頁)。蠟質基因型使玉米植物能夠產生主要或全部由支鏈澱粉組成的澱粉，蠟質基因型胚乳的表型或物理表現是不透明的、具有硬的蠟質質地。具體而言，蠟質基因型是那些其中存在粒狀結合澱粉合酶(GBSS)的突變體。常規的蠟質玉米出於許多目的而被種植，並且是可商購的。
已知糖-2基因型(稱為su2)可改變玉米胚乳的碳水化合物組成，並且糖-2基因位於第6號染色體(lbid)的(57)位。蠟質糖-2基因類型的雙穩性突變體也是已知的。其胚乳為糖-2等位基因純合的蠟質玉米在文獻中有述，所述文獻包括US4,428,972和4,615,888並且可以從National Starch and Chemical Company商購。
植物的基因型也可以通過易位、倒位、轉化由基因或染色體工程及其它方法來得到，由此得到本發明的澱粉的特性。另外，取自由上述基因組成的人工突變體和變異體生成的植物的澱粉也可以用於本發明，所述突變體和變異體可以通過已知的突變繁殖的標準方法來產生。
用於提取澱粉的植物的基因型可以通過標準繁殖技術得到。為了用通常的手段得到玉米中wxsu2基因型的雙隱性突變體，可以例如使蠟質突變體(wx)和糖-2突變體(su2)雜交，並且隨後使第一代單雜交體(Wx wx Su2 su2)自體授粉理論上可從分離的谷穗以15∶1的比例回收雙突變體。用於本發明的澱粉可以以近交系獲得，但更理想的是澱粉得自於雜種，所述雜種源自含有wxsu2雙突變體的近交繁殖體，一般是為了獲得較高的產量等因素。其胚乳具有一劑量隱性糖-2等位基因的玉米植物的田間生產可以通過使具有顯性糖-2等位基因的雌性蠟質玉米植物與具有隱性糖-2等位基因的雄性蠟質玉米植物在純合的條件下雜交來實施。典型的種植排列為一列雄性對7列雌性。通過本領域已知的各種手段如細胞質或遺傳手段將雌性列去雄或使雄性不育。其胚乳具有兩劑量隱性糖-2等位基因的玉米植物的田間生產可以通過使糖-2等位基因純合隱性的雌性蠟質玉米植物和具有顯性糖-2等位基因的雄性蠟質玉米植物雜交來實施。種植排列和使雌性植物雄性不育與一劑量生產類似。
用於本發明的玉米必須含有低糊化溫度澱粉。在一個實施方案中，該糊化溫度低於約60℃，在第二個實施方案中，該溫度低於約55℃和在第三個實施方案中，該溫度低於約50℃。
製備乙醇和其它發酵產品的方法是本領域公知的。通常乙醇是由含有可發酵的糖或可轉化為糖的組份的玉米粉或糊製成的。在一常規方法中，粉或糊在葡糖澱粉酶的存在下被糖化以得到水解澱粉和糖，和被酵母發酵得到乙醇。然後回收乙醇。玉米粉或糊在糖化前可以用α-澱粉酶液化。可以將蛋白酶在糖化過程中加至經液化的糊中和/或在發酵過程中加至水解澱粉和糖中以使酵母在更高的幹固體糊水平下進行酒精發酵。
玉米可以整粒使用；即該粒是未分解成其組成部分，如殼，胚乳、頂蓋(tipcap)、果皮(pericarp)和胚芽的方式使用，也可以以本領域已知的其相分離狀態使用。然而，必須剩餘有足夠發酵的澱粉，例如通過使用錘磨機或輾壓機，可以將整粒玉米研磨、破碎、碎裂、壓片或磨碎。在一實施方案中，經溶劑萃取的玉米粉被用於發酵產品的製備。在另一實施例中，玉米糊用於發酵產品。各種玉米和/或各種組成部分的混合物也可以被用於製備發酵產品。
液化通常是通過將水加至玉米，和使用鹼如鈣土(lime)將pH調至約6，然後加入α-澱粉酶使澱粉液化來實現。還可以加入氮酵母營養物。可注入蒸汽以將玉米加熱至約88-120℃以糊化和消毒澱粉。然後將澱粉保持在所用的將澱粉轉化成複合糖的澱粉酶的有效溫度，通常63-95℃約2-4小時。玉米組分通常約30wt％，但也可以更高的量。
然後通常在糖化前將玉米冷卻至葡糖澱粉酶的活性有效的溫度，如約60℃。例如通過使用硫酸，和加入葡糖澱粉酶將pH調節至對酶活性有效的pH，例如約4.4。可選擇地加入支鏈澱粉酶以水解1，6-鍵。糖化通常在6小時內完成。可選擇地，液化和糖化可同時完成。
然後將玉米常規冷卻至對酵母發酵有效的溫度，如32℃。在保持溫度和pH下，發酵一般進行約46-50小時。
通過本發明製備的發酵產品可以是本領域已知的任何發酵產品，包括但不限於乙醇、檸檬酸、丁醇、氫、乳酸、維生素、和可溶性糖。在一實施方案中，得到的發酵產品為乙醇，在另一方案中得到的發酵產品為檸檬酸。
通常，發酵後，通過蒸餾和脫水回收乙醇以使回收的乙醇具有大於99.9％的純度。可以加入少量的汽油以使乙醇變性。
培養所述或其它微生物的營養物包括，例如backset，酵母提取物，玉米浸液、澱粉、葡萄糖、乙醇、酮、和氮源蛋白腖、大豆粉、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、經提取的玉米粉或尿素。各種鹽如NaCl和硫酸銨，和痕量無素也可被包含在微生物的培養基中。在糖化過程中和/或在發酵過程中的水解的澱粉和糖中加入一些其它的酶也是有利的。這些酶的例子是纖維素酶、半纖維素酶、磷酸酶、外源和內源葡聚糖酶和木聚糖酶。
下面的實施方案是為了進一步說明本發明，並不構成對本發明的限制。
1.在由玉米製備發酵產品的方法中，其中玉米與能夠發酵碳源的微生物混合以產生發酵產品，改進之處在於包括使用含有糊化溫度低於約60℃的澱粉的玉米。
2.實施方案1的方法，其中玉米是來自其胚乳具有純合隱性的等位基因的蠟質玉米植物，所述等位基因選自糖2、糖2-蠟質、dull-糖2、dull-糖2-蠟質、直鏈澱粉extender-dull-蠟質，直鏈澱粉extender-糖2，及其組合。
3.實施方案2的方法，其中玉米來自其胚乳具有純合隱性糖-2等位基因的蠟質玉米植物。
4.實施方案1的方法，其中玉米是來自其胚乳具有雜合隱性一劑量糖-2等位基因的蠟質玉米植物。
5.實施方案1的方法，其中玉米是來自其胚乳具有兩劑量雜合隱性糖-2等位基因的蠟質玉米植物。
6.實施方案1的方法，其中澱粉的糊化溫度低於約55℃。
7.實施方案1的方法，其中澱粉的糊化溫度低於約50°。
8.實施方案1的方法，其中發酵產品選自乙醇、檸檬酸、丁醇、氫、乳酸、維生素和可溶性糖。
9.實施方案8的方法，其中發酵產品是乙醇。
10.實施方案8的方法，其中發酵產品是檸檬酸。
實施例以下實施例是為了進一步說明本發明，並不構成對本發明的限制。所用的所有百分數均基於重量/重量。
實施例1-各種玉米澱粉的糊化用差示掃描量熱法檢測具有0-3次隱性糖-2基因的蠟質澱粉的糊化特徵。稱取10g澱粉置於不鏽鋼盤中，以1份澱粉對2份水的比例加入水。然後將試樣從30℃加熱至102℃，加熱速率為10℃/分鐘。結果示於下表1中。
表1
實施例2-各種澱粉的DSC特徵Inouchi等(Starke 43(12)S468-472(1991)在它們的文章「DSC Characteristics ofGelatinization of Starches of Single-，Double-，and triple-Mutants and Their NormalCounterpart in the inbred Oh43 Maize(Zea Mays.L)Background」中表徵了各種澱粉。稱取澱粉置於鋁盤，並以1份澱粉對2份水的比例加入蒸餾水。然後將以2℃/分鐘的加熱速率加熱。結果示於下表2中。
表2
實施例3-用粉製備乙醇a.將由源自於蠟質玉米植物的玉米的玉米粉(45g)置於125ml燒瓶中，所述蠟質玉米植物具有純合隱性糖-2等位基因的。以1g/L加入酵母提取物以確保氮不受限。用10％的來自過夜酵母培養物的接種物(釀酒酵母的一種典型Altech乙醇酵母)接種培養物，並且在125rpm旋轉搖床上在30℃下溫育42小時。通過HPLC控制葡萄糖消耗和乙醇生成。
b.用由源自蠟質玉米植物的玉米的玉米粉重複實施例3a，所述蠟質玉米植物是隱性糖-2等位基因(一劑量)雜合的。
c.用由源自蠟質玉米植物的玉米的玉米粉重複實施例3a，所述蠟質玉米植物是隱性糖-2等位基因(兩劑量)雜合的。
乙醇生產類似於通過利用蠟質和臼齒玉米生長的酵母進行的乙醇生產，但輸入的能量更少。實施例2a所需的能量輸入最少。
實施例4-用粉製備乙醇a.研磨源自蠟質玉米植物的整玉米粒，所述蠟質玉米植物具有純合隱性糖-2等位基因的並且是商購的。液化是將1740gm玉米粉加至4500ml自來水中。向此漿液中加入0.99gmCaCl2·2H2O。然後將該漿液置於68℃下，及將pH調節至6.2-6.4。然後，在不斷攪拌的同時，將0.6ml酶Taka-Therm.RTM.II加至該漿液然後在68℃下溫育1小時。酶Taka-Therm.RTM.II是一種液態熱穩定細菌(地衣芽胞桿菌變種)α-澱粉酶，可購自Solvay Enzymes，Inc.。在溫育中未觀察至明顯的糊化。然後將該漿液置於加熱板上並在攪拌下加熱至沸騰。使該漿液沸騰5分鐘，然後置於90℃的水中溫育2小時。沸騰後將1.2ml Taka-Therm.RTM.II酶加至該漿液。將該漿液冷卻至25℃，並且用25％H2SO4將pH調至4.6-4.8。用自來水將固體含量(DS)調至20-21％。
將450gm步驟a(液化)得到的液體玉米粉加至500ml錐形瓶中使糖化和發酵同時進行。酶的大致量為0.25ml distillase L-200和0.3ml 2％酸性真菌蛋白酶溶液與0.8gm Fleishman’s麵包酵母(7gm箔包裝)一起被加至玉米粉。在旋轉燒瓶以混合酵母前，使乾酵母水合10分鐘。然後用Parafilm蓋好燒瓶並置於36℃水中發酵24小時。然後回收乙醇。
b.用由源自蠟質玉米植物的玉米得到的玉米粉重複實施例4a，所述蠟質玉米植物是隱性糖-2等位基因(一劑量)雜合的。
c.用由源自蠟質玉米植物的玉米得到的玉米粉重複實施例4a，所述蠟質玉米植物是隱性糖-2等位基因(兩劑量)雜合的。
乙醇生產類似於通過在蠟質和臼齒玉米生長的酶母進行的乙醇生產，但能量輸入減少。實施例4a的能量輸入最少。
實施例5-檸檬酸的製備a.經溶劑萃取的玉米粉含有豐富的可發酵澱粉，所述玉米粉是由源自蠟質玉米植物的玉米製備的，該蠟質玉米植物具有純合隱性糖-2等位基因的。將可溶糖轉化成適於發酵的糖的一種方法是水解澱粉分子。可以將玉米粉中的澱粉和蛋白轉化成適於發酵的單糖的酶包括澱粉酶、蛋白酶、纖維素酶(如木聚糖酶)、酯酶(如ferulase，乙醯酯酶)和木質素酶(ligninase)。用Retsch磨將玉米粉研磨至可通過1mm篩，及取300g與700ml含有0.5mlα澱粉酶的100℃的水混合併置於密封容器中。用鹼將pH調至5.9和攪拌45分鐘，及額外地加入α-澱粉酶。再經過45分鐘的溫育後，用酸將pH調至4.5。加入0.5ml葡糖澱粉酶(Optimax 7525)和0.5g蛋白酶(真菌蛋白酶5000)並在62℃下溫育約24小時。整個過程使用有機酸柱(Aminex HPX-87H離子分離柱，300mm×7.8mm，BioRad)，通過HPLC(Waters 2690分離器)控制澱粉的水解程度。
一旦澱粉經過了合適的酶處理，用常規已知的方法將溶液過濾和脫礦質。在浸罐發酵容器中用脫礦質水使得到的糖的固體含量為約120mg/l。浸罐方法也被稱為深層發酵。在該方法中向罐提供無菌空氣、營養成份和碳源、(經水解的澱粉)、和接種黑麴黴孢子。真菌孢子的濃度為約100個孢子/升培養液，其對應於10g-15g孢子/m3的濃度將真菌孢子加至營養液中，並通過真菌來實現檸檬酸的生成。黑麴黴菌株的實例是US2,492,667所述的ATCC1015和US5,081,025中所述的DSM5484。
經此接種後的肉湯培養基的溫育可以在已知的製備檸檬酸的條件下進行，如連續充氣和溫度控制。在發酵過程中，溫度保持在約32℃，用檸檬酸鈉將pH保持在約2-3，和加入無菌空氣以保持約50％的溶解氧含量。進行發酵直至發酵肉湯培養基的還原糖含量達到約1g/L，這可能需要數天來實現。兩種主要分離方法可用於回收檸檬酸，石灰-硫酸(Lime-Sulfuric Acid)方法和液體萃取方法。石灰-硫酸方法是通常使用的，並且是硫酸製備領域的技術人員所熟知的。用由源自蠟質玉米植物的玉米粉重複實施例5a，所述蠟質玉米植物是隱性糖-2等位基因(一劑量)雜合的。
用由源自蠟質玉米植物的玉米粉重複實施例5a，所述蠟質玉米植物是隱性糖-2等位基因(兩劑量)雜合的。
權利要求
1.由玉米製備發酵產品的方法，其中玉米與可發酵碳源的微生物混合以產生發酵產品，改進之處在於包括使用含有糊化溫度低於約60℃的澱粉的玉米。
2.如權利要求1所述的方法，其中玉米是源自其胚乳具有純合隱性等位基因的玉米植物，所述等位基因選自糖2、糖2-蠟質、dull-糖2、dull-糖2-蠟質、直鏈澱粉extender-dull-蠟質、直鏈澱粉extender-糖2及其組合。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中玉米源自其胚乳具有純合隱性糖-2等位基因的蠟質玉米植物。
4.如權利要求1或2所述的方法，其中玉米源自其胚乳具有一劑量雜合隱性糖-2等位基因的蠟質玉米植物。
5.如權利要求1或2所述的方法，其中玉米源自其胚乳具有兩劑量雜合隱性糖-2等位基因的蠟質玉米植物。
6.如權利要求1-5任一項所述的方法，其中所述澱粉的特徵在於糊化溫度低於約55°。
7.如權利要求6所述的方法，其中所述澱粉的特徵在於糊化溫度低於約50℃。
8.如權利要求1-7任一項所述的方法，其中所述發酵產品選自乙醇、檸檬酸、丁醇、氫、乳酸、維生素和可溶性糖。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述發酵產品是乙醇。
10.如權利要求8所述的方法，其中所述發酵產品是檸檬酸。
全文摘要
本發明提供一種由含有低糊化溫度澱粉的玉米、特別是由源自隱性糖－2等位基因純合或雜合的蠟質玉米植物的玉米製備發酵產品的方法，所述發酵產品如乙醇和檸檬酸。
文檔編號A23L1/105GK1883299SQ20061009986
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月21日 優先權日2005年6月22日
發明者B·奧斯特蘭德 申請人:國家澱粉及化學投資控股公司