耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶基因序列及編碼的多肽和製備方法
2024-04-07 19:19:05
專利名稱：耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶基因序列及編碼的多肽和製備方法
技術領域：
本發明涉及突變或遺傳工程，尤其涉及一種耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶基因序列及編碼的多肽和製備方法。
背景技術：
GTP(三磷酸鳥苷)環式水解酶(GTP-CH-I；E.C.3.5.4.16)，催化GTP轉化成為二氫新蝶呤三磷酸鹽，是四氫生物蝶呤生物合成反映過程中的一個限速酶，它的活性對於由四氫生物蝶呤抑制的反饋蛋白具有敏感性。在哺乳動物體內，二氫新蝶呤三磷酸鹽可以在6-丙酮四氫葉酸合成物以及墨蝶呤還原酶的一系列作用下，被轉化成為四氫生物蝶呤。
四氫生物蝶呤作為一種重要的協同因子，作用於氮氧化合成，丙三醇乙醚單氧酶，以及蝶呤需求性單氧酶。四氫生物蝶呤是酪氨酸羥化酶的協同因子，多巴胺生物合成的限速酶。在植物以及一種微生物中，這個蛋白酶產物作為第一媒介應用於四氫葉酸的生物合成。四氫生物蝶呤的實用性顯示出對這些蛋白酶活性的限制，以及因此而影響集中關鍵信號分子產生的速度(例如，氮氧化合物，去甲腎上腺素，腎上腺素，以及包含於血液中的複合胺)。
四氫生物蝶呤在哺乳動物細胞中的水平主要決定於三磷酸鳥苷環式水解酶的活性。三磷酸鳥苷環式水解酶基因的突變與幾種疾病相關，包括多巴性肌張力阻礙以及非典型性苯丙酮尿酸症。顯性遺傳的遺傳性肌張力障礙，也稱作多巴反應性肌張力障礙，是由三磷酸鳥苷環式水解酶基因突變，蛋白酶激活局部性疾病，以及低於正常20％的條紋型多巴胺水平引起的。哺乳動物體內的三磷酸鳥苷環式水解酶可以被四氫生物蝶呤所抑制，而且通過結合三磷酸鳥苷環式水解酶的反饋調節蛋白的聯合體，能夠被苯基丙氨酸激活。四氫生物蝶呤的抑制作用可以被三磷酸鳥苷環式水解酶反饋調節蛋白GFRP所調節，而且丙氨酸特異的四氫生物蝶呤依賴性抑制。
E.coli三磷酸鳥苷環式水解酶I的結構，老鼠肝臟6-丙酮四氫生物蝶呤合成酶，以及老鼠墨嘌呤還原酶已經被x-射線所鑑定；三磷酸鳥苷環式水解酶是一個環形的，D5-對稱性的十個類似物(homodecamer)。這十個等同的激活位點被定位在周邊，而且每個催化位點被定位在三個相鄰亞基的接觸面上。
雖然三磷酸鳥苷環式水解酶的反應機制在生物化學以及晶體學研究中已經被提出，但是這個複雜反應序列的細節仍然不得而知。在這個蛋白酶的活性位點處發現的一個重要的鋅離子，使我們清楚的鑑別這個反應成為可能。
騰衝嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tangcongensis)，是生活在我國雲南省騰衝縣的熱泉中的一種微生物，是一種嗜熱的真細菌(eubacteria)，最適生長溫度為75攝氏度，厭氧生長，革蘭氏染色反應呈陽性。它由中國科學院微生物所首先發現並進行了分類學上的分析。菌種保存在中國微生物保存中心MB4T(Chinese collection of microorganisms AS 1.2430T＝JCM 11007T)。該嗜熱厭氧菌是我國特有的一個物種，其體內所具有的耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶也具有自己特有的結構。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種分離的，編碼具有耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性的多肽的核苷酸序列。
本發明的目的之二是提供一種分離的具有耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性多肽。
本發明的另一目的還提供了嗜熱厭氧菌的三磷酸鳥苷環式水解酶重組載體、含有重組載體的宿主細胞，以及製備蛋白的方法。
本發明一方面提供一種能編碼具有耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性的多肽的核苷酸序列。所說的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO.2中的胺基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式，該修飾形式功能上相當或與三磷酸鳥苷環式水解酶相關。核苷酸序列具有SEQ ID NO.1的多核苷酸序列以及它的突變形式，突變類型包括缺失、無義、插入、錯義。
本發明另一方面提供了一種耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性的多肽。該多肽具有SEQ ID No.2中的胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
本發明提供的製備耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶的方法包括如下步驟1)分離出編碼耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶的核苷酸序列SEQ ID NO.1；2)構建含SEQ ID NO.1核苷酸序列的表達載體；3)將步驟2)中表達載體轉入宿主細胞，形成能生產耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶的重組細胞；4)培養步驟3)中的重組細胞；5)分離、純化得到耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶。
本發明涉及嗜熱厭氧菌的耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶基因的分離及表達。以騰衝嗜熱厭氧菌全基因組測序與分析為基礎，克隆分離了耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶基因。該基因對於製備用於生產耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶的轉基因微生物或動植物，並回收穫得該基因編碼的酶有用。另外，本發明還提供了具有耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性的多肽的胺基酸序列及功能等同體。同時，本發明還提供了製備，分離，純化具有耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性的多肽的方法。
圖1是測序文庫構建步驟流程圖；圖2是測序與數據分析流程圖。
具體實施例方式
本發明提供了分離的，編碼耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性的多肽的多聚核苷酸分子，該核苷酸分子是通過對騰衝嗜熱厭氧菌全基因組測序與分析而獲得的，具有SEQ.ID NO.1的核苷酸序列，它編碼具有188胺基酸的多肽，該多肽推測分子量為21219道爾頓。
本發明還提供一種重組載體，該載體包含本發明的分離的核苷酸分子，以及包含有重組載體的宿主細胞。同時，本發明包括構建該重組載體和宿主細胞的方法，以及用重組工程技術生產耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶的方法。
本發明進一步地提供了一種分離的耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶或多肽，它具有SEQ.ID NO.2胺基酸序列，或至少70％相似，更佳地，至少具有90％，95％，99％的相同。
在本發明中，「分離的」DNA是指該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，「耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶基因」指編碼具有耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ.ID NO.1的核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指該序列中有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於公知的密碼子的簡併性，所以與SEQ ID NO.1核苷酸序列同源性低至約70％的簡併序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的胺基酸序列。該術語還包括能在中度嚴謹條件下，更佳地在高度嚴謹條件下與SEQ ID NO.1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ IDNO.1核苷酸序列同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
在本發明中，「分離的」蛋白的多肽是指其至少佔樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按乾重或溼重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析，PAGE或HPLC法測量多肽的純度。分離的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組份。
在本發明中，「耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶」指具有耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括SEQ ID NO.2序列的變異體，這些變異體具有與天然耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶相同的功能。這些變異體包括(但不限於)若干個胺基酸的缺失，插入和/或取代，以及在C末段和/或N末端添加一個或數個胺基酸，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異。例如，為本領域所公知的，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末段和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶的活性片段和活性衍生物。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的各種質粒，粘粒，噬菌體及反轉錄病毒等。在生產本發明的耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶時，可以將耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶基因序列與表達調控序列相連，從而形成耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶表達載體。表達載體含有複製起始點和表達調控序列，啟動子，增強子和必要的加工信息位點。表達載體還必須含有可供選擇的標記基因，如a)提供對抗生素或其它毒性物質(氨苄青黴素，卡那黴素，氨甲蝶呤等)的抗性的蛋白質或b)互補營養缺陷型蛋白質或c)提供複合培養基中沒有的必需營養成分的蛋白質。各種不同宿主的合適標記基因是本領域中所熟知或生產廠商說明書註明的。這些表達載體可以用本領域技術人員公知的重組DNA技術製備，如可參考Sambrook等人，1989或Ausubel等人，1992。
重組表達載體可以用本領域熟知的方法引入宿主細胞，這些方法包括電轉化法，氯化鈣法，基因槍法等。將外源重組載體導入宿主細胞的過程稱為「轉化」。通過培養宿主細胞，誘導所需蛋白的表達，並通過本領域所熟知的蛋白分離技術，如柱層析等得到所需的蛋白質。也可採用固相技術等人工合成該蛋白質。
在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核細胞如大腸桿菌，枯草桿菌等。常用的真核細胞如酵母細胞，或各種動植物細胞。本發明的耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶基因全長序列或其片段通常可以用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增法，重組法，或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列來設計引物，用本領域技術人員已知的常規方法製備的嗜熱厭氧菌全基因組DNA為模板，擴增而得到有關序列。一旦獲得了有關序列，就可以將其克隆入有關載體，再轉入宿主細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到大批量的有關序列。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1構建測序文庫測序文庫的構建採用全基因組霰彈法(shotgun)進行。首先培養騰衝嗜熱厭氧菌，培養方法按(Yanfen Xue，2000)改進的MB培養基(Balch et al.，1979)，按Marmur(1961)方法收集細菌，提取總DNA。為了保證測序文庫構建的隨機性，最大程度地避免產生斷裂熱點的問題，採用多種方法、不同條件的建庫原則。先採用物理剪切方法(包括超聲波法及用Hydroshear Machine進行剪切)，其次根據該菌基因組特徵選用AluI進行隨機部分酶切。物理剪切時採用不同強度處理樣品，酶切時通過設置酶量梯度處理樣品。處理後的樣品經平末端處理後，採用電泳分部收集1.5-4kb DNA片段，與去磷酸化的經SmaI酶切的pUC18進行連接，連接產物通過電轉化E.coli DH5α構建了隨機測序的文庫。同時，為了便於以後重疊群(contig)的搭接還構建了長插入片段(10kb左右)的測序文庫(將基因組DNA以Sau3AI隨機部分酶切，電泳收集10kb左右的片段，與去磷酸化的經BamHI酶切的pUC18進行連接、構建文庫)。該文庫經兩個末端的測序在完成圖(finishing)的過程中可以得到contig之間的關係，並可以解決較大的洞(gap)對補洞造成的困難。建庫流程如(見圖1)。
實施例2基因組測序在完成騰衝嗜熱厭氧菌基因組的測序時，主要使用了兩種全自動測序儀A BI377和MegaBACE 1000。這兩種測序儀都是利用電泳原理進行測序(見圖2)，每次可完成96個樣品。ABI377是PE公司的產品，是ABI系列的一種。它屬於平板凝膠電泳測序儀。MegaBACE 1000是法瑪西亞公司的產品，屬於毛細管凝膠電泳測序儀。
實施例3Basecalling和測序質量監控所謂Basecalling是指從測序儀上得到的原始數據文件中得到正確的鹼基序列的過程。由於測序儀上得到的是A，T，G，C四種鹼基對應的不同波長的光的強度變化軌跡(trace)，需要用計算機採取一定的算法從中正確識別出不同的軌跡對應的鹼基。我們使用的是Phred軟體(Ewing B，Hillier L，1998)，原因是其結果更可靠，並且其結果輸出更便於同一軟體包中的其他程序進行進一步的分析。
Phred進行Basecalling的算法原理，是根據軌跡中各個峰的形狀，間距，以及信噪比等因素，判斷鹼基類型，同時對這個鹼基給出可信度信息，即鹼基的測序質量。在大規模測序中，測序質量的監控是十分重要的，它直接影響對測序的決策，包括文庫的構建，覆蓋率的大小。同時對測序實驗中可能出現的失誤能及時反饋。
實施例4序列拼接所謂序列拼接，就是把全基因組霰彈法，又稱鳥槍法隨機測序得到的樣品序列組裝成連續的contig，主要利用它們之間的重疊序列作參考。考慮到測序中存在載體的影響，需要先對樣品序列進行去載體處理。這裡所用的軟體cross_match和後面拼接所用的軟體Phrap都是美國Washington大學的軟體(Gordon D，Abajian C，1998)，其基本原理為Swith-Waterman算法(WatermanMS，1990)。這是一種動態算法，在考慮了兩兩序列之間的比較之後，可以得到一組序列的公有序列(consensus sequencè)。去除載體後的樣品序列再用Phrap進行拼接。在拼接時，鹼基的測序質量也被考慮了，所得到的公有序列各鹼基的可信度，由組成該公有序列的樣品的測序質量計算得到。
實施例5基因注釋在大體得到基因組的大部分序列(完成工作框架圖)後，就需要對基因組進行注釋，包括進行開讀框架(Open Reading Frame，ORF)的預測，基因功能的預測，以及特殊RNA片段的分析等。
第一步採用預設參數的GLIMMER2.0(Delcher，A.L.，Harmon，D.1999)和ORPHEUS(Frishman，D.1998)軟體預測基因編碼序列，然後所有預測的開讀框和非編碼區(intergenic region)都用BLAST軟體(Altschul，S.F.et al.1997)與NCBI的無冗餘蛋白資料庫(non-redundant protein database)比較來發現可能漏掉的基因。在判斷一個基因的起始點時，將參考各種相關信息，如序列同源性，核糖體結合位點，可能的信號肽序列和啟動子序列等。如果在一個開讀框內出現多個啟動子時，一般採用第一個啟動子作為基因的起始點。採用TransTerm軟體(Ermolaeva，M.D.2000)在非編碼區預測不依賴於Rho(ρ)因子的轉錄終止子。如果該終止子位於一個基因的下遊區的太遠處，則可能暗示一個小基因的丟失或測序錯誤人為地縮短了該基因，可作為進一步分析的參考。在確定移框突變和點突變時，主要根據與資料庫中的蛋白質的相似性來判斷。如果出現一個蛋白質對應於兩個彼此相鄰的編碼序列的情況，則被認為是一個無活性基因(假基因pseudogenes)，因為這說明這兩個編碼序列之間由於突變而產生異常中止現象，進而使基因失去活性。所有分析結果再用Artemis sequence viewer軟體(Rutherford，K.et al.2000)進行手工分析。一些明顯與其它編碼序列有重疊的開讀框，長度小於150鹼基對並且在已有資料庫中沒有同源性和其中沒有明顯的啟動子或終止區域的開讀框將被去除。
蛋白質的功能片段(motif)和功能區域(domain)分別採用與Pfam、PRINTS、PROSITE、ProDom和SMART資料庫進行比對分析，結果再用InterPro資料庫(Apweiler，R.et al.2001)進行匯總分析。根據NCBI的COGs資料庫(Tatusov，R.L.et al.2001)並且參照其他資料庫的查詢結果來確定蛋白質在COGs分類中的功能分類和可能的代謝途徑。用TMHMM軟體(Krogh，A.et al. 2001)來確認膜蛋白、ABC轉運蛋白和跨膜功能域。採用革蘭氏陰性菌為參數，用SIGNALP2.0軟體(Nielsen，H.et al.1999)分析信號肽區域。
(4)補洞在完成基因組的工作框架圖之後，就要進行更加困難的補洞工作，即完成整個基因組100％的測序，得到一個環形基因組。主要工作就是把前面得到的contig連接起來。主要方法包括A.利用測序中的正反向測序樣品信息在測序過程中，我們有意對某些樣品進行了雙向測序，即同時測序某個插入片段的兩端，再將所得序列與其他序列一起進行拼接。由於這一對序列在基因組上的關係一定，其之間的距離大致已知，根據這一信息，一可以確認某段contig是否可靠，二是當這一對序列分別位於不同的contig上時，可以確定這兩個contig的方向關係和位置關係，為進一步設計實驗提供參考。
B.長插入片段及Cosmid末端測序基於同樣的原理，我們可以構建不同長度的插入片段文庫，只對其兩端測序，然後拼接，分析其具體位置。這些文庫包括長度為9-12Kb的長插入片段庫和20-40Kb左右的Cosmid文庫。具體分析方法同上所述。
C.PCR和末端延伸Walking實驗根據A和B所提供的contig方向和位置關係，進一步的生物化學實驗就可以進行了。如設計一對引物進行PCR擴增，或以某一contig末端序列合成引物進行末端延伸(Walking)來補洞等。
實施例6三磷酸鳥苷環式水解酶的製備和提純根據實施例中基因注釋得到的三磷酸鳥苷環式水解酶全長編碼序列(SEQ IDN0.1)，設計能擴增出完整編碼閱讀框的引物，並在正反引物上分別引入限制性內切酶位點，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的測序文庫的質粒DNA為模板，經PCR擴增後，在保證閱讀框正確的前提下重組至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。再將重組載體轉化入大腸桿菌DH5α中(轉化方法為CaCL2法或電轉化法)。篩選鑑定的到含有表達載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-FolE。
挑取單菌落的工程菌DH5α-pGEX-2T-FolE於3ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中振搖培養37℃過夜，按1∶100的濃度吸取培養液於新的LB培養基(含100μg/ml氨苄青黴素)中培養約3小時，至OD600達0.5後，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續於37℃分別培養0，1，2，3小時。取培養時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉澱物中加入裂解液(2×SDS上樣緩衝液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉澱，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色後觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達所需蛋白的工程菌。
按上述方法誘導表達所需蛋白的工程菌後，將細菌離心沉澱，按每400ml菌加入20ml PBS飽和的50％穀胱甘肽Sepharose 4B，37℃振搖結合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉澱結合了所需蛋白的穀胱甘肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉澱加入100μl還原型穀胱甘肽洗脫液，室溫置10分鐘，上清即為洗脫的蛋白。重複洗脫兩次。洗脫的上清保存於-80℃，並進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在21219道爾頓處的蛋白質條帶即為三磷酸鳥苷環式水解酶。
序列表1.SEQ ID N0.1(1)序列特徵a.長度567鹼基對b.類型DNAc.鏈型雙鏈c.幾何結構線性(2)分子類型核苷酸(3)序列描述atgatagacaaagaaaagattaaaaaagctgtaagagagatacttgaagccataggcgaagaccccgatagggaggggctccttgagactcctgacagagtagccaggatgtacgaagaaattttttctggacttcacacagatgtaaaagacgttataaaaattttccaagaagatgagcatcaagagataatcctggtaaaagatattcccctttactctatgtgtgagcatcatcttcttccttttataggtgttgcccatgtggcataccttccaagaaaagggcgaattttaggcctttcaaaagttgctcgtatagtagacgttttatcaaaaaggcctcagctccaagaaaggctcactagtgaaattgcggataccataatggaagccgtcaatcctttgggagttgctgttgtcatagaggcagagcatctgtgcatgactatgaggggggttaaaaagccgggctctaaaactgttacctctgccctaaggggaatatttagaacggaccagaaagccagagcggaagtgatggctttgataaattccaagagatag2.SEQ ID NO.2(1)序列特徵a.長度188胺基酸b.類型多肽c.鏈型單鏈d.幾何結構立體(2)分子類型蛋白質(3)序列描述MIDKEKIKKAVREILEAIGEDPDREGLLETPDRVARMYEEIFSGLHTDVKDVIKIFQEDEHQEIILVKDIPLYSMCEHHLLPFIGVAHVAYLPRKGRILGLSKVARIVDVLSKRPQLQERLTSEIADTIMEAVNPLGVAVVIEAEHLCMTMRGVKKPGSKTVTSALRGIFRTDQKARAEVMALINSKR
權利要求
1.一種分離的DNA分子，其特徵在於它是編碼具有耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶蛋白活性的多肽的核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於所說的核苷酸序列編碼具有SEQ.ID NO.2中的胺基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式，該修飾形式功能上相當或與耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶相關。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於所說的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1的多核苷酸序列以及它的突變形式，突變類型包括缺失、無義、插入、錯義。
4.一種分離出的多肽，其特徵在於它具有耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性。
5.如權利要求4所述的多肽，其特徵在於它具有SEQ ID No.2中的胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
6.一種載體，其特徵在於它含有權利要求1中之DNA。
7.一種宿主細胞，其特徵在於它是用權利要求6所述載體轉化的原核細胞或真核細胞。
8.一種製備耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶的方法，其特徵在於該方法包括以下步驟1)分離出編碼耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶基因的核苷酸序列SEQ IDNO.1；2)構建含SEQ ID NO.1核苷酸序列的表達載體；3)將步驟2)中表達載體轉入宿主細胞，形成能生產耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶的重組細胞；4)培養步驟3)中的重組細胞；5)分離、純化得到耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶。
全文摘要
本發明公開了一種耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶基因及其編碼的多肽和製備方法。它涉及編碼具有活性或其功能等同變異體的分離的DNA和利用重組DNA技術以所述分離的DNA生產具有耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性的多肽或其功能等同變異體。以騰衝嗜熱厭氧菌全基因組測序與分析為基礎,克隆分離了耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶基因。該基因對於製備用於生產耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶的轉基因微生物或動植物,並回收穫得該基因編碼的酶有用。另外,本發明還提供了具有耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性的多肽的胺基酸序列及功能等同體。同時,本發明還提供了製備,分離,純化具有耐高溫三磷酸鳥苷環式水解酶活性的多肽的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1371998SQ01145569
公開日2002年10月2日 申請日期2001年12月27日 優先權日2001年12月27日
發明者包其鬱, 楊煥明, 張立敏, 汪建, 王光信 申請人:杭州華大基因研發中心