利用膠質類芽孢桿菌生產微生物多糖發酵液的方法
2024-04-07 14:49:05 2
專利名稱：利用膠質類芽孢桿菌生產微生物多糖發酵液的方法
技術領域：
本發明屬於微生物多糖的發酵，特別是指一種利用膠質類芽孢桿菌生產微生物多糖發酵液的方法。
背景技術：
膠凍樣類芽孢桿菌為土壤芽孢桿菌，其菌落圓形，無色，隆起，膠質粘稠，透明或半透明，邊緣整齊。在過去的幾十年中被作為微生物肥料的主要功能菌株被開發利用，其在農用微生物製劑領域發揮了重要作用。近年來隨著對膠質類芽孢桿菌研究的不斷深入，人們開始注意其胞外多糖的研究及應用。但熱點依然集中在對膠質芽孢桿菌產多糖成分的分析及多糖對矽酸鹽礦物的分解能力方面。對其多糖新的應用領域及優化工藝增加多糖產量方面的研究還較少。目前人們對微生物多糖產生的傳統工藝主要是轉接斜面法活化斜面菌·種，優化搖瓶發酵工藝參數等常規步驟，利用上述方法生產的發酵液中多糖的產量水平為3_5g/L。
發明內容
本發明的目的在於提供一種發酵液中的微生物多糖含量高的利用膠質類芽孢桿菌生產微生物多糖發酵液的方法。本發明的整體技術構思是
利用膠質類芽孢桿菌生產微生物多糖發酵液的方法，是將膠質類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus )ACCC10013接種於含有碳源及氮源的培養基進行發酵,包括如下工藝步驟
A、菌種熱刺激
在無菌條件下將試管斜面中的菌種孢子加入無菌水，振蕩洗下孢子製成孢子懸液並置於無菌容器中，將裝有孢子懸液的無菌容器置於沸水中，均勻加熱，1-10分鐘後將無菌容器取出並迅速冷卻；
B、發酵
BI、培養基的配製
配製培養基並滅菌，將其冷卻至30°C，培養基由如下質量百分數的組分組成
澱粉5%-20%，蔗糖5%-10%，硫酸銨O. 5%-5%，磷酸氫二鉀10%_20%，硫酸鎂5%_10%，三氯化鐵O. 01%-0· 5%，碳酸鈣O. 1%-5%，酵母膏O. 1%_3%，餘量為無菌水，pH=7. 5 ；
B2、培養
將步驟A中處理後的菌種接種於步驟B製備的培養基中，發酵周期為60小時，培養溫度30°C，接種量為菌種滅菌後培養基的質量百分比為8% ;風量調節為0-4小時通風比(通風比為發酵液體積每分鐘通入空氣的體積,下同。)為1:0. 2-0. 5VVM,4-12小時通風比為 1:0. 5-0. 7VVM，12-20 小時通風比為 1:0. 7-0. 9VVM，20-36 小時通風比為 1:1. 1-1. 5VVM,28-36小時通風比為1:0. 5-0. 7VVM，36-60小時通風比為1:0. 3-0. 5VVM，結束培養，在培養36小時之後補料流加表面活性劑十二烷基磺酸鈉I-IOml。本發明中的具體技術內容還有
無菌容器可以選用包括但不局限於試管或其他便於加熱的容器，為便於無菌容器的加熱，優選的技術方案是，步驟A中的無菌容器選用試管。均勻加熱可以採用多種現有方式，均不脫離本發明的實質，其中較為優選的技術方案是，步驟A中的均勻加熱採用邊加熱邊振蕩的方式進行。將無菌容器取出並迅速冷卻是採用冷水將無菌容器冷卻。步驟B中裝料量為50升小罐裝料38升。
本發明所具備的實質性特點和顯著的技術進步在於
I、將熱刺激後的菌種用結晶紫染色，塗片，鏡檢發現弱菌及一些較弱的芽孢減少了，芽孢較整齊，著色較深，在50升小罐上進行發酵的表現是芽孢萌發快，生長延遲期縮短，減少了總的發酵時間，且菌體生長同步性好有利於後邊的工藝控制，比如表面活性劑的加入。2、膠質類芽孢桿菌在營養貧乏時產生大量的莢膜，其能達到菌體大小的5-10倍，本發明在發酵過程中採取了波段培養的方法，即在培養的前期給菌種很好的生長環境以提高其生物量，在發酵培養的後期，嚴格控制溶氧並加入表面活性劑，創造營養貧乏的環境同時改變細胞膜的通透性使其在發酵液大量積累多糖，以達到提高多糖產量的目的。3、發酵結束後，測定多糖含量。檢測方法為蒽酮比色法，其含量最高可達7. 5g/L，與目前報導工藝比較可提高產糖量10-50%。4、發酵產生的發酵液用sevag法進行初步的提取分離之後進行紫外掃描檢測，檢測發現其基本不含核酸和蛋白質。並初步測得其含有豐富的羥基和羧基，而且此多糖的粘度高，與黃原膠粘度相仿，且其具有很好的假塑性和懸浮性，將其應用到高檔陶瓷製作上，發現很少量的此多糖可以產生很好的作用，提高陶瓷表面的光潔度，提高成品率，提升產品檔次，能產生很好的經濟效益。但相對於黃原膠此多糖的發酵時間短，發酵後期對氧的需求較少，減少了由於發酵液粘度增加引起的通氣攪拌電能消耗，省去特殊的設備要求。可這為膠質芽孢桿菌產多糖的應用開創了很好的領域。另外，由於其具有的高粘度，假塑性和懸浮性等特性，其還可以在石油勘探，礦物浮選方面也有很好的應用前景。
具體實施例方式以下結合本發明的實施例作進一步及描述，但不作為對本發明的限定，本發明的保護範圍以權利要求記載的內容為準，任何依據說明書作出的等效技術手段替換，均不脫離本發明的保護範圍。實施例I
利用膠質類芽孢桿菌生產微生物多糖發酵液的方法，是將膠質類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus ) ACCC10013接種於含有碳源及氮源的培養基進行發酵，包括如下工藝步驟
A、菌種熱刺激
在無菌條件下將試管斜面中的菌種孢子加入無菌水，振蕩洗下孢子製成孢子懸液並置於無菌容器中，將裝有孢子懸液的無菌容器置於沸水中，均勻加熱，I分鐘後將無菌容器取出並迅速冷卻；B、發酵
BI、培養基的配製
配製培養基並滅菌，將其冷卻至30°C，培養基由如下質量百分數的組分組成
澱粉5%，蔗糖5%，硫酸銨0. 5%，磷酸氫二鉀10%，硫酸鎂5%，三氯化鐵0. 01%,碳酸鈣0. 1%，酵母膏0. 1%，餘量為無菌水，pH=7. 5 ；
B2、培養
將步驟A中處理後的菌種接種於步驟B製備的培 養基中，發酵周期為60小時，培養溫度30°C，接種量為菌種滅菌後培養基的質量百分比為8% ;風量調節為0-4小時通風比為1:0. 2VVM, 4-12小時通風比為1:0. 5VVM，12-20小時通風比為1:0. 7VVM, 20-36小時通風比為1:1. 1VVM，28-36小時通風比為1:0. 5VVM，36-60小時通風比為1:0. 3VVM，結束培養，在培養36小時之後補料流加表面活性劑十二烷基磺酸鈉1ml。步驟A中的無菌容器選用試管。步驟A中的均勻加熱採用邊加熱邊振蕩的方式進行。將無菌容器取出並迅速冷卻是採用冷水將無菌容器冷卻。步驟B中裝料量為50升小罐裝料38升。發酵結束後，採用蒽酮比色法測定發酵液中的多糖含量。其含量可達6. 85g/L。實施例2
本實施例中步驟A中將無菌容器均勻加熱10分鐘後，將無菌容器取出並迅速冷卻；
B、發酵
BI、培養基的配製
配製培養基並滅菌，將其冷卻至30°C，培養基由如下質量百分數的組分組成
澱粉20%，蔗糖10%，硫酸銨5%，磷酸氫二鉀20%，硫酸鎂10%，三氯化鐵0. 5%，碳酸鈣5%，酵母膏3%，餘量為無菌水，pH=7. 5 ；
B2、培養
將步驟A中處理後的菌種接種於步驟B製備的培養基中，發酵周期為60小時，培養溫度30°C，接種量為菌種滅菌後培養基的質量百分比為8% ;風量調節為0-4小時通風比為I:. 5VVM，4-12小時通風比為I: 0. 7VVM, 12-20小時通風比為1: 0. 9VVM，20-36小時通風比為I: I. 5VVM, 28-36小時通風比為I: 0. 7VVM, 36-60小時通風比為I: 0. 5VVM，結束培養，在培養36小時之後補料流加表面活性劑十二烷基磺酸鈉10ml。其餘內容同實施例I。發酵結束後，採用蒽酮比色法測定發酵液中的多糖含量。其含量可達7. 2g/L。實施例3
本實施例的步驟將裝有孢子懸液的無菌容器置於沸水中均勻加熱，8分鐘後將無菌容器取出並迅速冷卻；
B、發酵
BI、培養基的配製
配製培養基並滅菌，將其冷卻至30°C，培養基由如下質量百分數的組分組成
澱粉15%，蔗糖8%，硫酸銨3%，磷酸氫二鉀15%，硫酸鎂8%，三氯化鐵0. 3%，碳酸鈣3%，酵母膏1%，餘量為無菌水，pH=7. 5 ；B2、培養
將步驟A中處理後的菌種接種於步驟B製備的培養基中，發酵周期為60小時，培養溫度30°C，接種量為菌種滅菌後培養基的質量百分比為8% ;風量調節為0-4小時通風比為I: 0. 3VVM，4-12小時通風比為1:0. 6 VVM, 12-20小時通風比為1:0. 8VVM，20-36小時通風比為1:1. 3VVM，28-36小時通風比為1:0. 6VVM，36-60小時通風比為1:0. 4VVM，結束培養，在培養36小時之後補料流加表面活性劑十二烷基磺酸鈉8ml。其餘內容同實施例I。發酵結束後，採用蒽酮比色法測定發酵液中的多糖含量。其含量可達7. 5g/L。實施例4
本實施例的步驟將裝有孢子懸液的無菌容器置於沸水中均勻加熱，6分鐘後將無菌容 器取出並迅速冷卻；
B、發酵
BI、培養基的配製
配製培養基並滅菌，將其冷卻至30°C，培養基由如下質量百分數的組分組成
澱粉8%，蔗糖6%，硫酸銨1%，磷酸氫二鉀13%，硫酸鎂7%，三氯化鐵0. 1%，碳酸鈣1%，酵母膏0. 5%，餘量為無菌水，pH=7. 5 ；
B2、培養
將步驟A中處理後的菌種接種於步驟B製備的培養基中，發酵周期為60小時，培養溫度30°C，接種量為菌種滅菌後培養基的質量百分比為8% ;風量調節為0-4小時通風比為1:0. 3VVM, 4-12小時通風比為1:0. 6VVM, 12-20小時通風比為1:0. 8VVM, 20-36小時通風比為1:1. 3VVM，28-36小時通風比為1:0. 6VVM，36-60小時通風比為1:0. 5VVM，結束培養，在培養36小時之後補料流加表面活性劑十二烷基磺酸鈉3ml。其餘內容同實施例I。發酵結束後，採用蒽酮比色法測定發酵液中的多糖含量。其含量可達7. Og/L。實施例5
本實施例的步驟將裝有孢子懸液的無菌容器置於沸水中均勻加熱，3分鐘後將無菌容器取出並迅速冷卻；
B、發酵
BI、培養基的配製
配製培養基並滅菌，將其冷卻至30°C，培養基由如下質量百分數的組分組成
澱粉18%，蔗糖9%，硫酸銨0. 6%，磷酸氫二鉀18%，硫酸鎂9%，三氯化鐵0. 07%,碳酸鈣0. 9%，酵母膏0. 8%，餘量為無菌水，pH=7. 5 ；
B2、培養
將步驟A中處理後的菌種接種於步驟B製備的培養基中，發酵周期為60小時，培養溫度30°C，接種量為菌種滅菌後培養基的質量百分比為8% ;風量調節為0-4小時通風比為1:0. 4VVM，4-12小時通風比為1:0. 6VVM, 12-20小時通風比為1:0. 85VVM，20-36小時通風比為1:1. 45VVM，28-36小時通風比為1:0. 6VVM，36-60小時通風比為1:0. 35VVM，結束培養，在培養36小時之後補料流加表面活性劑十二烷基磺酸鈉9ml。其餘內容同實施例I。
發酵結束後，採用蒽酮比色法測定發酵液中的多糖含量。其含量 可達6. 95g/L。
權利要求
1.利用膠質類芽孢桿菌生產微生物多糖發酵液的方法，是將膠質類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus )ACCC10013接種於含有碳源及氮源的培養基進行發酵,其特徵在於包括如下工藝步驟 A、菌種熱刺激 在無菌條件下將試管斜面中的菌種孢子加入6ml無菌水，振蕩洗下孢子製成孢子懸液並置於無菌容器中，將裝有孢子懸液的無菌容器置於沸水中，均勻加熱，ι- ο分鐘後將無菌容器取出並迅速冷卻； B、發酵 BI、培養基的配製 配製培養基並滅菌，將其冷卻至30°C，培養基由如下質量百分數的組分組成 澱粉5%-20%，蔗糖5%-10%，硫酸銨O. 5%-5%，磷酸氫二鉀10%_20%，硫酸鎂5%_10%，三氯化鐵O. 01%-0· 5%，碳酸鈣O. 1%-5%，酵母膏O. 1%_3%，餘量為無菌水，pH=7. 5 ； B2、培養 將步驟A中處理後的菌種接種於步驟B製備的培養基中，發酵周期為60小時，培養溫度30°C，接種量為菌種滅菌後培養基的質量百分比為8% ;風量調節為0-4小時通風比為 1:0. 2-0. 5VVM,4-12 小時通風比為 1:0. 5-0. 7VVM, 12-20 小時通風比為 1:0. 7-0. 9VVM,20-36小時通風比為1:1. 1-1. 5VVM，28-36小時通風比為1:0. 5-0. 7VVM, 36-60小時通風比為1:0. 3-0. 5VVM，結束培養，在培養36小時之後補料流加表面活性劑十二烷基磺酸鈉I-IOml。
2.根據權利要求I所述的利用膠質類芽孢桿菌生產微生物多糖發酵液的方法，其特徵在於所述的步驟A中的無菌容器選用試管。
3.根據權利要求I所述的利用膠質類芽孢桿菌生產微生物多糖發酵液的方法，其特徵在於所述的步驟A中的均勻加熱採用邊加熱邊振蕩的方式進行。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的利用膠質類芽孢桿菌生產微生物多糖發酵液的方法，其特徵在於所述的將無菌容器取出並迅速冷卻是採用冷水將無菌容器冷卻。
5.根據權利要求I所述的利用膠質類芽孢桿菌生產微生物多糖發酵液的方法，其特徵在於所述的步驟B中裝料量為50升小罐裝料38升。
全文摘要
本發明屬於微生物多糖的發酵，特別是指一種利用膠質類芽孢桿菌生產微生物多糖發酵液的方法。是將膠質類芽孢桿菌接種於含有碳源及氮源的培養基進行發酵，通過菌種熱刺激和在發酵過程中添加表面活性劑等方式優化生產工藝，本發明解決了現有技術存在的發酵液中多糖的產量低的問題，具有發酵液中多糖產量高、菌體生長好、發酵周期短等優點。
文檔編號C12R1/01GK102952834SQ20121042510
公開日2013年3月6日 申請日期2012年10月31日 優先權日2012年10月31日
發明者陳文杰, 章淑豔, 魏亞新, 李軍, 秦豔梅, 趙從波, 韓濤, 王雲鵬, 古述江, 劉麗娜 申請人:河北省微生物研究所