特異性結合ANGPTL3和PCSK9的抗原結合分子及其醫藥用途的製作方法

2024-04-15 16:45:05 1

特異性結合angptl3和pcsk9的抗原結合分子及其醫藥用途
技術領域
1.本披露屬於生物技術領域，更具體地，本披露涉及抗原結合分子及其應用。


背景技術：

2.這裡的陳述僅提供與本披露有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。
3.前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(pcsk9)是一種前蛋白轉化酶，屬於分泌的枯草桿菌酶家族的蛋白酶k亞族。該編碼蛋白是作為可溶性酶原合成的，在內質網中經過自身催化分子內加工。實驗結果顯示，pcsk9促進ldl受體的降解從而增加血漿中ldl膽固醇含量，而ldl受體介導肝內的ldl胞吞過程，後者是從循環系統清除ldl的主要途徑。因此，pcsk9成為了一個極具潛力的，新的降血脂靶標。
4.angptl3(angiopoietin-like protein 3)是一個在肝臟合成並分泌到血液循環系統中的蛋白，該蛋白由460個胺基酸組成，包括一個信號肽、一個螺旋捲曲結構域(coiled-coil domain)和一個纖維蛋白原樣結構域(fibrinogen-related domain)。angptl3是脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，lpl)和內皮脂酶(endothelial lipase，el)的抑制蛋白，可以通過與lpl或el結合抑制其酶活性，使得lpl不能水解乳糜及vldl等組分中的甘油三酯，從而使得血液循環中甘油三酯水平顯著增高。而如果發明一個阻斷型抗體結合angptl3蛋白後，阻斷了angptl3蛋白與lpl的結合，從而解除對lpl酶活的抑制，則可使血漿中的甘油三酯被降解。因此，angptl3也是降甘油三酯、降膽固醇的重要靶點。


技術實現要素：

5.本披露提供了一種抗原結合分子，其既能與angptl3抗原特異性結合，也能與pcsk9抗原特異性結合。
6.在一些實施方式中，如上所述的抗原結合分子，其包含至少一個特異性結合angptl3的抗原結合模塊1和至少一個特異性結合pcsk9的抗原結合模塊2。在一些實施方式中，所述特異性結合angptl3的抗原結合模塊1包含重鏈可變區a-vh和輕鏈可變區a-vl，所述a-vh包含a-hcdr1、a-hcdr2和a-hcdr3，所述a-vl包含a-lcdr1、a-lcdr2和a-lcdr3，其中：
7.(i)所述a-hcdr1、a-hcdr2和a-hcdr3分別包含seq id no：13中的hcdr1、hcdr2和hcdr3的胺基酸序列，和所述a-lcdr1、a-lcdr2和a-lcdr3分別包含seq id no：14中的lcdr1、lcdr2和lcdr3的胺基酸序列，或
8.(ii)所述a-hcdr1、a-hcdr2和a-hcdr3分別包含seq id no：11中的hcdr1、hcdr2和hcdr3的胺基酸序列，和所述a-lcdr1、a-lcdr2和a-lcdr3分別包含seq id no：12中的lcdr1、lcdr2和lcdr3的胺基酸序列，或
9.(iii)所述a-hcdr1、a-hcdr2和a-hcdr3分別包含seq id no：9中的hcdr1、hcdr2和hcdr3的胺基酸序列，和所述a-lcdr1、a-lcdr2和a-lcdr3分別包含seq id no：10中的lcdr1、lcdr2和lcdr3的胺基酸序列；和/或
10.所述特異性結合pcsk9的抗原結合模塊2包含重鏈可變區k-vh和輕鏈可變區k-vl，
所述k-vh包含k-hcdr1、k-hcdr2和k-hcdr3，所述k-vl包含k-lcdr1、k-lcdr2和k-lcdr3，其中，所述k-hcdr1、k-hcdr2和k-hcdr3分別包含seq id no：216中的hcdr1、hcdr2和hcdr3的胺基酸序列，和所述k-lcdr1、k-lcdr2和k-lcdr3分別包含seq id no：217中的lcdr1、lcdr2和lcdr3的胺基酸序列；在一些實施方式中，所述特異性結合pcsk9的抗原結合模塊2包含重鏈可變區k-vh和輕鏈可變區k-vl，所述k-vh包含k-hcdr1、k-hcdr2和k-hcdr3，所述k-vl包含k-lcdr1、k-lcdr2和k-lcdr3，其中，所述k-hcdr1、k-hcdr2和k-hcdr3分別包含seq id no：40、42至50中任一條重鏈可變區中的hcdr1、hcdr2和hcdr3的胺基酸序列，和所述k-lcdr1、k-lcdr2和k-lcdr3分別包含seq id no：41、51至57中任一條輕鏈可變區中的lcdr1、lcdr2和lcdr3的胺基酸序列；
11.在一些實施方式中，如上所述的抗原結合分子，所述a-hcdr1、a-hcdr2、a-hcdr3、a-lcdr1、a-lcdr2、a-lcdr3、k-hcdr1、k-hcdr2、k-hcdr3、k-lcdr1、k-lcdr2、k-lcdr3、hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3是根據kabat、imgt、chothia、abm或contact編號規則定義的。在一些實施方式中，所述a-hcdr1、a-hcdr2、a-hcdr3、a-lcdr1、a-lcdr2、a-lcdr3、k-hcdr1、k-hcdr2、k-hcdr3、k-lcdr1、k-lcdr2、k-lcdr3、hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3是根據kabat編號規則定義的；在一些實施方式中，如上所述的抗原結合分子，所述a-hcdr1、a-hcdr2、a-hcdr3、a-lcdr1、a-lcdr2、a-lcdr3、k-hcdr1、k-hcdr2、k-hcdr3、k-lcdr1、k-lcdr2、k-lcdr3、hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3是根據imgt編號規則定義的；在一些實施方式中，如上所述的抗原結合分子，所述a-hcdr1、a-hcdr2、a-hcdr3、a-lcdr1、a-lcdr2、a-lcdr3、k-hcdr1、k-hcdr2、k-hcdr3、k-lcdr1、k-lcdr2、k-lcdr3、hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3是根據chothia編號規則定義的；在一些實施方式中，如上所述的抗原結合分子，所述a-hcdr1、a-hcdr2、a-hcdr3、a-lcdr1、a-lcdr2、a-lcdr3、k-hcdr1、k-hcdr2、k-hcdr3、k-lcdr1、k-lcdr2、k-lcdr3、hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3是根據abm編號規則定義的；在一些實施方式中，如上所述的抗原結合分子，所述a-hcdr1、a-hcdr2、a-hcdr3、a-lcdr1、a-lcdr2、a-lcdr3、k-hcdr1、k-hcdr2、k-hcdr3、k-lcdr1、k-lcdr2、k-lcdr3、hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3是根據contact編號規則定義的。
12.在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，所述k-hcdr1、k-hcdr2、k-hcdr3、k-lcdr1、k-lcdr2和k-lcdr3是根據kabat編號規則定義的，所述k-hcdr1包含seq id no：58的胺基酸序列，所述k-hcdr2包含seq id no：59的胺基酸序列，所述k-hcdr3包含seq id no：218的胺基酸序列(例如包含seq id no：60至66任一胺基酸序列)，所述k-lcdr1包含seq id no：219的胺基酸序列(例如包含seq id no：67至70任一胺基酸序列)，所述k-lcdr2包含seq id no：71的胺基酸序列，和所述k-lcdr3包含seq id no：72的胺基酸序列；和
13.所述a-hcdr1、a-hcdr2、a-hcdr3、a-lcdr1、a-lcdr2和a-lcdr3是根據kabat編號規則定義的，其中，
14.(i)所述a-hcdr1包含seq id no：24的胺基酸序列，所述a-hcdr2包含seq id no：28的胺基酸序列，所述a-hcdr3包含seq id no：26的胺基酸序列，所述a-lcdr1包含seq id no：27的胺基酸序列，所述a-lcdr2包含seq id no：22的胺基酸序列，和所述a-lcdr3包含seq id no：23的胺基酸序列，或
15.(ii)所述a-hcdr1包含seq id no：24的胺基酸序列，所述a-hcdr2包含seq id no：
25的胺基酸序列，所述a-hcdr3包含seq id no：26的胺基酸序列，所述a-lcdr1包含seq id no：21的胺基酸序列，所述a-lcdr2包含seq id no：22的胺基酸序列，和所述a-lcdr3包含seq id no：23的胺基酸序列，或
16.(iii)所述a-hcdr1包含seq id no：18的胺基酸序列，所述a-hcdr2包含seq id no：19的胺基酸序列，所述a-hcdr3包含seq id no：20的胺基酸序列，所述a-lcdr1包含seq id no：15的胺基酸序列，所述a-lcdr2包含seq id no：16的胺基酸序列，和所述a-lcdr3包含seq id no：17的胺基酸序列。
17.在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，所述特異性結合angptl3的抗原結合模塊1，其a-vh具有：包含seq id no：24的胺基酸序列的a-hcdr1、包含seq id no：28的胺基酸序列的a-hcdr2和包含seq id no：26的胺基酸序列的a-hcdr3，並且a-vl具有：包含seq id no：27的胺基酸序列的a-lcdr1、包含seq id no：22的胺基酸序列的a-lcdr2和包含seq id no：23的胺基酸序列的a-lcdr3；和
18.所述特異性結合pcsk9的抗原結合模塊2，其k-vh具有：包含seq id no：58的胺基酸序列的k-hcdr1、包含seq id no：59的胺基酸序列的k-hcdr2和包含seq id no：64的胺基酸序列的k-hcdr3，並且其k-vl具有：包含seq id no：67的胺基酸序列的k-lcdr1、包含seq id no：71的胺基酸序列的k-lcdr2和包含seq id no：72的胺基酸序列的k-lcdr3。
19.在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，其中：(i)所述a-vh包含與seq id no：37具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的胺基酸序列，並且所述a-vl包含與seq id no：14具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的胺基酸序列；或所述a-vh包含與seq id no：13具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的胺基酸序列，並且所述a-vl包含與seq id no：14具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的胺基酸序列；或所述a-vh包含seq id no：11具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的胺基酸序列，並且所述a-vl包含與seq id no：12具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的胺基酸序列；或所述a-vh包含seq id no：9具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的胺基酸序列，並且所述a-vl包含與seq id no：10具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的胺基酸序列；和/或
20.(ii)所述k-vh包含與seq id no：216具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的胺基酸序列，並且所述k-vl包含與seq id no：217具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的胺基酸序列；在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，所述k-vh包含與seq id no：40、42至50中任一條具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的胺基酸序列，並且所述k-vl包含與seq id no：41、51至57中任一條具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的胺基酸
序列；
21.在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，其中：所述特異性結合angptl3的抗原結合模塊1，其a-vh包含seq id no：37或seq id no：13的胺基酸序列，並且a-vl包含seq id no：14的胺基酸序列；和所述特異性結合pcsk9的抗原結合模塊2，其k-vh包含seq id no：45的胺基酸序列，並且k-vl包含seq id no：56或seq id no：57的胺基酸序列。在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，其中：所述特異性結合angptl3的抗原結合模塊1，其a-vh包含seq id no：13的胺基酸序列，並且a-vl包含seq id no：14的胺基酸序列；和所述特異性結合pcsk9的抗原結合模塊2，其k-vh包含seq id no：45的胺基酸序列，並且k-vl包含seq id no：57的胺基酸序列。在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，其中：所述特異性結合angptl3的抗原結合模塊1，其a-vh包含seq id no：37的胺基酸序列，並且a-vl包含seq id no：14的胺基酸序列；和所述特異性結合pcsk9的抗原結合模塊2，其k-vh包含seq id no：45的胺基酸序列，並且k-vl包含seq id no：56的胺基酸序列。
22.在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，其中所述抗原結合分子包含2個特異性結合angptl3的抗原結合模塊1、2個特異性結合pcsk9的抗原結合模塊2，以及fc區；在一些實施方式中，所述特異性結合angptl3抗原結合模塊1為scfv，所述特異性結合pcsk9抗原結合模塊2為fab，所述特異性結合angptl3的scfv直接或通過連接子融合至特異性結合pcsk9的fab的n端，所述fc的n端與特異性結合pcsk9的fab的重鏈的c端融合；或所述特異性結合pcsk9抗原結合模塊2為scfv，所述特異性結合angptl3抗原結合模塊1為fab，所述特異性結合pcsk9的scfv直接或通過連接子融合至特異性結合angptl3的fab的n端，所述fc的n端與特異性結合angptl3的fab的重鏈的c端融合。
23.在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，所述抗原結合分子包含如下所述第一鏈和第二鏈：
24.(i)具有式(a)所示結構的第一鏈和具有式(b)所示結構的第二鏈，
25.(a)[a-vh]-[連接子1]-[a-vl]-[連接子2]-[k-vh]-ch，
[0026]
(b)[k-vl]-[cl]；或
[0027]
(ii)具有式(c)所示結構的第一鏈和具有式(b)所示結構的第二鏈，
[0028]
(c)[a-vl]-[連接子1]-[a-vh]-[連接子2]-[k-vh]-ch，
[0029]
(b)[k-vl]-[cl]；或
[0030]
(iii)具有式(d)所示結構的第一鏈和具有式(e)所示結構的第二鏈，
[0031]
(d)[k-vh]-[連接子1]-[k-vl]-[連接子2]-[a-vh]-ch，
[0032]
(e)[a-vl]-[cl]；或
[0033]
(iv)具有式(f)所示結構的第一鏈和具有式(e)所示結構的第二鏈，
[0034]
(f)[k-vl]-[連接子1]-[k-vh]-[連接子2]-[a-vh]-ch，
[0035]
(e)[a-vl]-[cl]；
[0036]
在一些實施方式中，所述式(a)、(c)、(d)和(f)中，其中的連接子1和連接子2是相同或不同的肽連接子；在一些實施方案中，所述肽連接子各自獨立地具有l
1-(ggggs)n-l2的結構，其中，l1是鍵、a、gs、ggs或gggs(seq id no：116)，n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，l2是鍵、g、gg、ggg或gggg(seq id no：117)，並且所述肽連接子不是鍵。在一些實施方案中，所
述肽連接子的長度為3-15個胺基酸殘基。在一些實施方案中，所述肽連接子各自獨立地具有(ggggs)n的結構，其中n是1、2或3；在一些實施方式中，所述連接子為seq id no：211-213任一所示的連接子。在一些實施方案中，所述抗原結合分子具有兩條第一鏈、兩條第二鏈。
[0037]
在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，其中所述抗原結合分子包含重鏈恆定區ch和輕鏈恆定區cl；在一些實施方式中，所述重鏈恆定區選自人igg1和igg4重鏈恆定區，所述輕鏈恆定區cl選自人κ或λ輕鏈恆定區；在一些實施方案中，所述重鏈恆定區的fc區包含一個或更多個胺基酸取代，所述的胺基酸取代能夠減少fc區與fc受體的結合。在一些實施方案中，所述的胺基酸取代能夠減少其與fcγ受體的結合。在一些實施方案中，所述fc區是人igg1fc區，在一些實施方案中，所述igg
1 fc區在234和235位置的胺基酸殘基為a，編號依據為eu索引。在一些實施方式中，所述重鏈恆定區包含seq id no：29或220的胺基酸序列，所述輕鏈恆定區cl包含seq id no：30的胺基酸序列。
[0038]
在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，其中所述抗原結合分子包含：(i)與seq id no：140、144至146、150、151、154至166任一具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，和與seq id no：141具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈；或(ii)與seq id no：142、147至149、152、153任一具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，和與seq id no：143具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈；
[0039]
在一些實施方式中，所述抗原結合分子包含：seq id no：166的胺基酸序列的第一鏈，和seq id no：141的胺基酸序列的第二鏈。
[0040]
在一些實施方式中，其中所述抗原結合分子包含一個特異性結合angptl3的抗原結合模塊1、一個特異性結合pcsk9的抗原結合模塊2和fc區，所述fc區包含能夠相互締合的第一亞基fc1和第二亞基fc2；在一些實施方式中，(i)所述特異性結合angptl3的抗原結合模塊1是fab；所述特異性結合pcsk9的抗原結合模塊2是經替換的fab，其包含k-vh、k-vl、titin鏈和obscurin鏈，所述titin鏈和obscurin鏈能夠形成二聚體；所述k-vh的c端直接或通過連接子融合至titin鏈的n端和所述k-vl的c端直接或通過連接子融合至obscurin鏈的n端，或所述k-vh的c端直接或通過連接子融合至obscurin鏈的n端和所述k-vl的c端直接或通過連接子融合至titin鏈的n端；或(ii)所述特異性結合pcsk9的抗原結合模塊2是fab；所述特異性結合angptl3的抗原結合模塊1是經替換的fab，其包含a-vh、a-vl、titin鏈和obscurin鏈，所述titin鏈和obscurin鏈能夠形成二聚體；所述a-vh的c端直接或通過連接子融合至titin鏈的n端和所述a-vl的c端直接或通過連接子融合至obscurin鏈的n端，或所述a-vh的c端直接或通過連接子融合至obscurin鏈的n端和所述a-vl的c端直接或通過連接子融合至titin鏈的n端；在一些實施方式中，所述titin鏈的c端或obscurin鏈的c端直接或通過連接子融合至fc1的n端，所述fab的重鏈的c端直接或通過連接子融合至fc2的n端。
[0041]
在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，其中，所述titin鏈包含seq id no：73的胺基酸序列或其變體，其中所述seq id no：73的變體相比seq id no：73，具有選自由3w、8c、11i、13l、20c、22m/22c、25s、26c、39t、40s、42k、45s、47e、49g、56s、58e、60s、
64t、66s/66k、70r、75v、77s、79t、81r、82m、83d和84l組成的組中的一個或更多個胺基酸殘基取代；和所述obscurin鏈包含seq id no：92的胺基酸序列或其變體，或包含seq id no：93的胺基酸序列或其變體；其中所述seq id no：92的變體相比seq id no：92，具有選自由2e、3c、7k/7r、9c、11l、12s、13y/13s、14t、17e、20l、22m/22s、25s、30d、32p/32f、34e、36t、41k、42l、44i、45t、48v、53l、58v、62e/62k/62h、66c、67q/67t、69s、76s、82h、88c、89l、92e、93c、94g和97g組成的組中的一個或更多個胺基酸殘基取代；所述seq id no：93的變體相比seq id no：93，具有選自由6e、26s、74c、77s、84c和86c組成的組中的一個或更多個胺基酸殘基取代。
[0042]
在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中，所述seq id no：73的變體具有選自以下任一項所述的胺基酸殘基取代：
[0043]
8c、25s和39t，
[0044]
20c、25s和39t，
[0045]
25s、26c和39t，
[0046]
22c、25s和39t，
[0047]
8c、25s、39t、66s和77s，
[0048]
8c、25s、39t、66k、70r、79t和81r，
[0049]
3w、8c、11i、13l、22m、25s、39t和82m，
[0050]
8c、11i、25s、39t、66k、79t和81r，
[0051]
8c、25s、39t、40s、42k、45s、47e、49g、56s、58e、75v、83d和84l，
[0052]
8c、25s、39t、47e、49g、56s、58e和75v，
[0053]
8c、25s、39t、56s、58e和75v，
[0054]
8c、25s、39t、56s、58e、66s和77s，
[0055]
8c、11i、25s、39t、60s、64t、66k、79t和81r，
[0056]
8c、11i、20c、25s、39t、60s、64t、66k、79t和81r，
[0057]
8c、11i、25s、26c、39t、60s、64t、66k、79t和81r。
[0058]
在一些實施方案中，所述seq id no：73的變體相比seq id no：73，其n端具有kagir的胺基酸序列。
[0059]
在一些實施方案中，所述seq id no：73的變體相比seq id no：73，僅具有上述任一項的胺基酸殘基取代。在一些實施方案中，所述seq id no：73的變體包含與seq id no：73具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性的胺基酸序列。
[0060]
在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中，所述seq id no：92的變體具有選自以下任一項所述的胺基酸殘基取代：
[0061]
88c，
[0062]
3c，
[0063]
9c，
[0064]
25s、76s和88c，
[0065]
25s、76s和3c，
[0066]
25s、76s和9c，
[0067]
7k、25s、62k、76s和88c，
[0068]
7k、25s、62h、76s和88c，
[0069]
7r、25s、62k、76s和88c，
[0070]
7r、25s、62h、76s和88c，
[0071]
11l、25s、62k、76s和88c，
[0072]
11l、25s、62h、76s和88c，
[0073]
12s、13y、14t、22s、25s、62k、76s和88c，
[0074]
2e、11l、17e、25s、30d、32p、34e、36t、44i、45t、58v、62e、67q、69s、76s、88c和97g，
[0075]
11l、20l、22m、25s、53l、62k、76s和88c，
[0076]
11l、25s、41k、45t、62k、67q、69s、76s、88c和89l；
[0077]
11l、25s、42l、45t、62k、67t、69s、76s、88c、92e和94，
[0078]
11l、12s、13y、22s、25s、42l、45t、62k、67q、69s、76s、88c、92e和94g，
[0079]
25s、32f、41k、45t、48v、62k、67q、69s、76s、88c和89l，
[0080]
13s、25s、32f、41k、45t、48v、62k、67q、69s、76s、82h、88c和89l，
[0081]
3c、13s、25s、32f、41k、45t、48v、62k、67q、69s、76s、82h、88c和89l，
[0082]
9c、13s、25s、32f、41k、45t、48v、62k、67q、69s、76s、82h、88c和89l，
[0083]
13s、32f、41k、45t、48v、62k、67q、69s、82h、88c和89l，
[0084]
3c、13s、32f、41k、45t、48v、62k、67q、69s、82h、88c和89l，
[0085]
9c、13s、32f、41k、45t、48v、62k、67q、69s、82h、88c和89l，
[0086]
13s、25s、32f、41k、45t、48v、62k、66c、67q、69s、76s、82h、88c、89l和93c，
[0087]
3c、13s、25s、32f、41k、45t、48v、62k、66c、67q、69s、76s、82h、88c、89l和93c，
[0088]
9c、13s、25s、32f、41k、45t、48v、62k、66c、67q、69s、76s、82h、88c、89l和93c。
[0089]
在一些實施方案中，所述seq id no：92的變體相比seq id no：92，其n端具有dqpqf的胺基酸序列。
[0090]
在一些實施方案中，所述seq id no：92的變體相比seq id no：92，僅具有上述任一項的胺基酸殘基取代。在一些實施方案中，所述seq id no：92的變體包含與seq id no：92具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性的胺基酸序列。
[0091]
在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中，所述seq id no：93的變體具有選自以下任一項所述的胺基酸殘基取代：
[0092]
6e和74c，
[0093]
6e和84c，
[0094]
6e和86c，
[0095]
6e、26s、77s和74c，
[0096]
6e、26s、77s和84c，和
[0097]
6e、26s、77s和86c。
[0098]
在一些實施方案中，所述seq id no：93的變體相比seq id no：93，僅具有上述任一項的胺基酸殘基取代。在一些實施方案中，所述seq id no：93的變體包含與seq id no：93具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性的胺基酸序列。
[0099]
在一些實施方式中，所述titin鏈包含選自由seq id no：73至seq id no：91組成的組中的任一條胺基酸序列，所述obscurin鏈包含選自由seq id no：92至seq id no：132
組成的組中的任一條胺基酸序列；在一些實施方式中，所述titin鏈包含seq id no：89的胺基酸序列，所述obscurin鏈包含seq id no：124的胺基酸序列。
[0100]
在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，所述抗原結合分子包含fc區，所述fc區優選為igg fc區，更優選為igg
1 fc區。在一些實施方案中，所述fc區包含能夠相互締合的第一亞基fc1和第二亞基fc2，所述fc1和fc2各自獨立地具有一個或更多個減少fc區同源二聚化的胺基酸取代。在一些實施方案中，(i)所述fc1具有根據杵臼技術的凸起結構，和所述fc2具有根據杵臼技術的孔結構；優選地，所述fc1在366位置的胺基酸殘基為w；和所述fc2在366位置的胺基酸殘基為s、在368位置的胺基酸殘基為a、和在407位置的胺基酸殘基為v，所述胺基酸殘基位置依據eu索引編號；和/或(ii)所述第一亞基fc1和第二亞基fc2之間具有工程化二硫鍵，優選地，所述fc1在354位置的胺基酸殘基為c；和所述fc2在349位置的胺基酸殘基為c，所述胺基酸殘基位置依據eu索引編號；更優選地，所述fc1在354位置的胺基酸殘基為c、在356位置的胺基酸殘基為e、在358位置的胺基酸殘基為m和在366位置的胺基酸殘基為w；並且所述fc2在349位置的胺基酸殘基為c、在356位置的胺基酸殘基為e、在358位置的胺基酸殘基為m、在366位置的胺基酸殘基為s、在368位置的胺基酸殘基為a和在407位置的胺基酸殘基為v，所述胺基酸殘基位置依據eu索引編號。在一些實施方案中，(i)所述fc2具有根據杵臼技術的凸起結構，和所述fc1具有根據杵臼技術的孔結構；優選地，所述fc2在366位置的胺基酸殘基為w；和所述fc1在366位置的胺基酸殘基為s、在368位置的胺基酸殘基為a、和在407位置的胺基酸殘基為v，所述胺基酸殘基位置依據eu索引編號；和/或(ii)所述第一亞基fc2和第二亞基fc1之間具有工程化二硫鍵，優選地，所述fc2在354位置的胺基酸殘基為c；和所述fc1在349位置的胺基酸殘基為c，所述胺基酸殘基位置依據eu索引編號；更優選地，所述fc2在354位置的胺基酸殘基為c、在356位置的胺基酸殘基為e、在358位置的胺基酸殘基為m和在366位置的胺基酸殘基為w；並且所述fc1在349位置的胺基酸殘基為c、在356位置的胺基酸殘基為e、在358位置的胺基酸殘基為m、在366位置的胺基酸殘基為s、在368位置的胺基酸殘基為a和在407位置的胺基酸殘基為v，所述胺基酸殘基位置依據eu索引編號。在一些實施方式中，所述fc區的第一亞基包含seq id no：138的胺基酸序列，第二亞基包含seq id no：139的胺基酸序列。
[0101]
在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，所述抗原結合分子包含如下所述第一鏈、第二鏈、第三鏈、第四鏈：
[0102]
(i)具有式(a1)所示結構的第一鏈、具有式(b1)所示結構的第二鏈、具有式(c1)所示結構的第三鏈和具有式(d1)所示結構的第四鏈，
[0103]
(a1)[a-vh]-[連接子1]-[titin鏈]-[fc1]，
[0104]
(b1)[k-vh]-[ch1]-[fc2]，
[0105]
(c1)[a-vl]-[連接子2]-[obscurin鏈]，
[0106]
(d1)[k-vl]-[cl]；或
[0107]
(ii)具有式(a2)所示結構的第一鏈、具有式(b1)所示結構的第二鏈、具有式(c2)所示結構的第三鏈和具有式(d1)所示結構的第四鏈，
[0108]
(a2)[a-vh]-[連接子1]-[obscurin鏈]-[fc1]，
[0109]
(b1)[k-vh]-[ch1]-[fc2]，
[0110]
(c2)[a-vl]-[連接子2]-[titin鏈]，
[0111]
(d1)[k-vl]-[cl]；或
[0112]
(iii)具有式(a3)所示結構的第一鏈、具有式(b3)所示結構的第二鏈、具有式(c3)所示結構的第三鏈和具有式(d3)所示結構的第四鏈，
[0113]
(a3)[k-vh]-[連接子1]-[titin鏈]-[fc1]，
[0114]
(b3)[a-vh]-[ch1]-[fc2]，
[0115]
(c3)[k-vl]-[連接子2]-[obscurin鏈]，
[0116]
(d3)[a-vl]-[cl]；或
[0117]
(iv)具有式(a4)所示結構的第一鏈、具有式(b3)所示結構的第二鏈、具有式(c4)所示結構的第三鏈和具有式(d3)所示結構的第四鏈，
[0118]
(a4)[k-vh]-[連接子1]-[obscurin鏈]-[fc1]，
[0119]
(b3)[a-vh]-[ch1]-[fc2]，
[0120]
(c4)[k-vl]-[連接子2]-[titin鏈]，
[0121]
(d3)[a-vl]-[cl]；
[0122]
在一些實施方案中，所述式(a1)、式(a2)、式(a3)、式(a4)、式(c1)、式(c2)、式(c3)、式(c4)的連接子是相同或不同的肽連接子；在一些實施方案中，所述肽連接子各自獨立地具有l
1-(ggggs)n-l2的結構，其中，l1是鍵、a、gs、ggs或gggs(seq id no：116)，n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，l2是鍵、g、gg、ggg或gggg(seq id no：117)，並且所述肽連接子不是鍵。
[0123]
在一些實施方案中，所述肽連接子的長度為3-15個胺基酸殘基。在一些實施方案中，所述肽連接子各自獨立地具有(ggggs)n的結構，其中n是1、2或3。
[0124]
在一些實施方案中，所述連接子為seq id no：211-213任一所示的連接子。
[0125]
在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，其包含：a)與seq id no：206、208或209具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：204具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：210具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：141具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；或b)與seq id no：167具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：168具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：169具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：143具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；或c)與seq id no：170具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：171具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：172具有至少90％(例如至少
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：141具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；或d)與seq id no：173具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：174具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：175具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：143具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；或e)與seq id no：176具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：177具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：178具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：141具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；或f)與seq id no：203具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：176具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：195或197具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：141具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；或g)與seq id no：200或202具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：176具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：195具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：141具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；或h)與seq id no：190、191、192或193具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：176具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：185具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：141具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；或i)與seq id no：191或193具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：176具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％
或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：187具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：141具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；或j)與seq id no：184、186、188或189具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：171具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：185具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：141具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；或k)與seq id no：186或189具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：171具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：187具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：141具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；或l)與seq id no：194、196、198或199具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：171具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：195具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：141具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；或m)與seq id no：196或199具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：171具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：197具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：141具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；或n)與seq id no：179、180、182或183具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：171具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：178具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：141具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；或o)與seq id no：201具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同
一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：176具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：195或197具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：141具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；或；p)與seq id no：188或191具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：204具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：205具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：141具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；或；q)與seq id no：206或208具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第一鏈，與seq id no：204具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第二鏈，與seq id no：207具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第三鏈，和與seq id no：141具有至少90％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的胺基酸序列的第四鏈；在一些實施方式中，所述的抗原結合分子，其包含seq id no：208的胺基酸序列的第一鏈，包含seq id no：204的胺基酸序列的第二鏈，包含seq id no：210的胺基酸序列的第三鏈，和包含seq id no：141的胺基酸序列的第四鏈。
[0126]
在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子具有以下一種或更多種功能：
[0127]
a.針對angptl3和/或pcsk9的高親和力。在一些實施方式中，所述的抗原結合分子以小於1.0e-10(例如小於8.0e-11m、小於7.0e-11m、小於6.0e-11m、5.0e-11m、4.0e-11m或更小)的kd值與人angptl3結合，和/或，所述的抗原結合分子以小於1.0e-8(例如小於9.0e-9m、小於7.0e-9m、小於6.0e-9m、5.0e-9m、4.0e-9m、3.0e-9m、2.0e-9m或更小)的kd值與人pcsk9結合；所述kd值是通過biacore方法測定的。具體測試方法見測試例1；
[0128]
b.阻斷angptl3對lpl酶的活性作用。具體測試方法見測試例2；或
[0129]
c.有效降脂效果；在一些實施方式中，所述抗原結合分子能降低tg，tc，non-hdl-c和/或ldl-c水平；具體測試方法見測試例4或5。
[0130]
在一些實施方式中，本披露提供一種藥物組合物，其含有：治療有效量的如上任一項所述的抗原結合分子，以及一種或更多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑；在一些實施方式中，所述的藥物組合物中還包含至少一種第二治療劑。
[0131]
在一些實施方式中，本披露提供分離的核酸，其編碼如上任一項所述的抗原結合分子。
[0132]
在一些實施方式中，本披露提供一種宿主細胞，其包含前述的核酸。
[0133]
在一些實施方式中，本披露提供一種治療疾病的方法，所述方法包括向受試者施
用前面任一項所述的抗原結合分子或藥物組合物的步驟。
[0134]
在另一個方面，本披露還提供前面任一項所述的抗原結合分子或藥物組合物在製備治療或預防疾病的藥物中的用途。
[0135]
在另一個方面，本披露還提供用作藥物的前述任一項所述的抗原結合分子或組合物。所述藥物用於治療或預防疾病。
[0136]
在一些實施方式中，前面任一項所述疾病是所述疾病或病症為angptl3和/或pcsk9相關的疾病或病症；在一些實施方式中，所述疾病或病症為高膽固醇血症、高脂血症或動脈粥樣硬化疾病。
附圖說明
[0137]
圖1：p8bg抗體對sd(sprague dawley，斯潑累格
·
多雷)大鼠血清甘油三酯的影響；
[0138]
圖2：p3g抗體對sd大鼠血清甘油三酯的影響；
[0139]
圖3：抗angptl3抗體對hfd(high-fat-diet，高脂飲食)小鼠血漿甘油三酯的影響；
[0140]
圖4：抗angptl3抗體對hfd小鼠血漿低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，ldl-c)的影響；
[0141]
圖5：抗angptl3抗體對hfd小鼠血漿總膽固醇的影響；
[0142]
圖6：抗angptl3抗體對apoe小鼠(載脂蛋白e(apolipoprotein e，apoe)基因敲除小鼠)血漿甘油三酯的影響；
[0143]
圖7：抗angptl3抗體對apoe小鼠血漿高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol，hdl-c)的影響；
[0144]
圖8：抗angptl3抗體在小鼠體內藥代動力學實驗結果；
[0145]
圖9：抗angptl3抗體在食蟹猴體內的藥代動力學實驗結果。
[0146]
圖10a-h為特異性結合angptl3和pcsk9的雙特異性抗體結構示意圖，其中，圖10a為format2.1結構示意圖、10b為format2.2結構示意圖、圖10c為format2.3結構示意圖、圖10d為format2.4結構示意圖、圖10e為format5.1結構示意圖、圖10f為format5.2結構示意圖，圖10g為format5.3結構示意圖，圖10h為format5.1結構示意圖；
[0147]
圖11：抗體降低aav-hpcsk9過表達鼠模的ldl-c實驗結果；
[0148]
圖12：抗體降低轉基因鼠模型tg水平的實驗結果；
[0149]
圖13：抗體降低轉基因鼠模型tc水平的實驗結果；
[0150]
圖14：抗體降低轉基因鼠模型non-hdl-c水平的實驗結果。
具體實施方式
[0151]
術語
[0152]
本文所用的術語只是為了描述實施方案的目的，並非旨在進行限制。除非另外定義，本文所用的全部技術術語和科學術語具有與本披露所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同意義。
[0153]
除非上下文另外清楚要求，否則在整個說明書和權利要求書中，應將詞語「包含」、「具有」、「包括」等理解為具有包含意義，而不是排他性或窮舉性意義；也即，「包括但不僅限
於」的意義。除非另有說明，「包含」包括了「由
……
組成」。例如，對於包含seq id no：24的胺基酸序列的a-hcdr1，其明確的包含胺基酸序列如seq id no：24所示的a-hcdr1。
[0154]
本披露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如j.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
[0155]
術語「和/或」，例如「x和/或y」應當理解為意指「x和y」或「x或y」並且應當被用來提供對兩種含義或任一含義的明確支持。
[0156]
術語「胺基酸」是指天然存在的和合成的胺基酸，以及以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來修飾的那些胺基酸，例如羥脯氨酸、γ-羧基穀氨酸和o-磷酸絲氨酸。胺基酸類似物是指與天然存在的胺基酸具有相同基本化學結構(即與氫、羧基、氨基和r基團結合的α碳)的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶。此類類似物具有修飾的r基團(例如，正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物是指具有與胺基酸的一般化學結構不同的結構，但是以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的化學化合物。
[0157]
術語「胺基酸突變」包括胺基酸取代，缺失，插入和修飾。可以進行取代、缺失、插入和修飾的任意組合來實現最終構建體，只要最終構建體擁有期望的特性，例如降低或對fc受體的結合。胺基酸序列缺失和插入包括在多肽鏈的氨基端和/或羧基端的缺失和插入。具體的胺基酸突變可以是胺基酸取代。在一個實施方式中，胺基酸突變是非保守性的胺基酸取代，即將一個胺基酸用具有不同結構和/或化學特性的另一種胺基酸替換。胺基酸取代包括由非天然存在的胺基酸或由20種天然胺基酸的衍生物(例如4-羥脯氨酸、3-甲基組氨酸、鳥氨酸、高絲氨酸、5-羥賴氨酸)替換。可以使用本領域中公知的遺傳或化學方法生成胺基酸突變。遺傳方法可以包括定點誘變、pcr，基因合成等。預計基因工程以外的改變胺基酸側鏈基團的方法，如化學修飾也可能是可用的。本文中可使用各種名稱來指示同一胺基酸突變。本文中，可採用位置+胺基酸殘基的方式表示特定位點的胺基酸殘基，例如366w，則表示在366位點上的胺基酸殘基為w。t366w則表示第366位點上的胺基酸殘基由原來的t突變為了w。
[0158]
術語「抗原結合分子」以最廣義使用，涵蓋各種特異性結合抗原的分子，包括但不限於抗體、其他具有抗原結合活性的多肽以及兩者融合而成的抗體融合蛋白。示例性的，本文中的抗原結合分子是雙特異性抗原結合分子(例如：雙特異性抗體)。術語「雙特異性抗原結合分子」指能夠對兩個不同抗原或同一抗原的至少兩個不同抗原表位特異性結合的抗原結合分子。
[0159]
術語「抗體」以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單克隆抗體，多克隆抗體；單特異性抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，全長抗體和抗體片段(或抗原結合片段，或抗原結合部分)，只要它們展現出期望的抗原結合活性。「天然抗體」指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然igg抗體是約150,000道爾頓的異四聚糖蛋白，由二硫鍵結合的兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈構成。從n至c端，每條重鏈具有一個可變區(vh)，又稱作可變重域、重鏈可變區，接著是三個恆定域(ch1、ch2和ch3)。類似地，從n至c端，每條輕鏈具有一個可變區(vl)，又稱作可變輕域，或輕鏈可變域，接著是一個恆定輕域(輕鏈恆定區、cl)。
[0160]
術語「雙特異性抗體」指能夠對兩個不同抗原或同一抗原的至少兩個不同抗原表位特異性結合的抗體(包括抗體或其抗原結合片段，如單鏈抗體)。現有技術已公開了各種結構的雙特異性抗體，根據igg分子的完整性可分為igg樣雙特異性抗體和抗體片段型雙特異性抗體，根據抗原結合區域的數量可分為二價、三價、四價或更多價的雙特異性抗體，根據結構左右是否對稱可分為對稱結構雙特異性抗體和不對稱結構雙特異性抗體。其中，基於抗體片段的雙特異性抗體，例如缺乏fc片段的fab片段，其通過將2個或多個fab片段結合在一個分子中形成雙特異性抗體，其具有較低的免疫原性，且分子量小，具有較高的腫瘤組織滲透性，該類型的典型的抗體結構如f(ab)2、scfv-fab、(scfv)2-fab等雙特異性抗體；igg樣雙特異性抗體(例如具有fc片段)，這類抗體相對分子量較大，fc片段有助於抗體後期的純化，並提高其溶解性、穩定性，fc部分還可能會與受體fcrn結合，增加抗體血清半衰期，典型的雙特異性抗體結構模型如kih、crossmab、triomab quadroma、fcδadp、art-ig、bimab、biclonics、beat、duobody、azymetric、xmab、2:1tcbs、1fab-igg tdb、fynomab、two-in-one/daf、scfv-fab-igg、dart-fc、lp-dart、codv-fab-tl、hlk-bite、f(ab)2-crossmab、igg-(scfv)2、bs4ab、dvd-ig、tetravalent-dart-fc、(scfv)4-fc、codv-ig、mab2、f(ab)4-crossmab等雙特異性抗體(參見aran f.labrijn等，nature reviews drug discovery volume 18，pages585
–
608(2019)；chen s1等，j immunol res.2019 feb 11；2019:4516041)。
[0161]
術語「可變區」或「可變域」指抗原結合分子中結合抗原的域。本文中，特異性結合angptl3的抗原結合模塊1中的重鏈可變區標示為a-vh，輕鏈可變區標示為a-vl；特異性結合pcsk9的抗原結合模塊2中的重鏈可變區標示為k-vh，輕鏈可變區標示為k-vl。vh和vl各包含四個保守的框架區(fr)和三個互補決定區(cdr)。其中，術語「互補決定區」或「cdr」指可變結構域內主要促成與抗原結合的區域；「框架」或「fr」是指除cdr殘基之外的可變結構域殘基。vh包含3個cdr區：hcdr1、hcdr2和hcdr3；vl包含3個cdr區：lcdr1、lcdr2和lcdr3。本文中，a-vh中的3個cdr區分別標示為a-hcdr1、a-hcdr2和a-hcdr3；a-vl中的3個cdr區分別標示為a-lcdr1、a-lcdr2和a-lcdr3；k-vh中的3個cdr區分別標示為k-hcdr1、k-hcdr2和k-hcdr3；k-vl中的3個cdr區分別標示為k-lcdr1、k-lcdr2和k-lcdr3。每個vh和vl由從氨基末端排到羧基末端按以下順序排列的三個cdr和四個fr構成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。單個vh或vl可能足以賦予抗原結合特異性。
[0162]
可以通過各種公知方案來確定cdr的胺基酸序列邊界，例如：「kabat」編號規則(參見kabat等(1991)，「sequences of proteins of immunological interest」，第5版，public health service，national institutes of health，bethesda，md)、「chothia」編號規則、「abm」編號規則、「contact」編號規則(參見martin,acr.protein sequence and structure analysis of antibody variable domains[j].2001)和immunogentics(imgt)編號規則(lefranc，m.p.等，dev.comp.immunol.，27，55-77(2003)；front immunol.2018 oct 16；9:2278)等；各種編號系統之間的對應關係是本領域技術人員熟知的。本披露的編號規則如下表1-1中所示。
[0163]
表1-1.cdr編號系統之間的關係
[0164]
cdrimgtkabatabmchothiacontacthcdr127-3831-3526-3526-3230-35
hcdr256-6550-6550-5852-5647-58hcdr3105-11795-10295-10295-10293-101lcdr127-3824-3424-3424-3430-36lcdr256-6550-5650-5650-5646-55lcdr3105-11789-9789-9789-9789-96
[0165]
除非另有說明，本披露實施例中的可變區和cdr序列均適用「kabat」編號規則。
[0166]
術語「抗體片段」指不同於完整抗體的分子，其包含完整抗體的部分，所述部分與完整抗體所結合的抗原相結合。抗體片段的實例包括但不限於fv、fab、fab』、fab
』‑
sh、f(ab
′
)2、單域抗體、單鏈fab(scfab)、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scfv)；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。fab指由免疫球蛋白的vh和ch1(fab重鏈)與vl和cl(fab輕鏈)組成的蛋白質；fv指由免疫球蛋白的vh與vl組成的抗原結合域。本披露中，在一些實施方案中，所述第一fab具有fab的結構；而在經替換的fab中，ch1與cl被titin鏈和obscurin鏈替代。
[0167]
術語「fc區」或「片段可結晶區」用於定義抗體重鏈的c末端區域，包括天然fc區和改造的fc區。在一些實施方式中，fc區包含了相同或不同的兩個亞基。在一些實施方式中，人igg重鏈的fc區定義為從cys226位置處的胺基酸殘基或從pro230延伸至其羧基末端。用於本文所述抗體的合適天然序列fc區包括人igg1、igg2(igg2a、igg2b)、igg3和igg4。除非另有說明，fc區的編號規則為eu索引。
[0168]
術語「titin鏈」是指titin蛋白中一段長度為78-118個胺基酸的包含titin ig-樣152結構域的肽段或其功能變體，所述titin鏈能夠與obscurin ig-樣1或obscurin-樣ig-樣1結構域結合形成二聚化複合物。術語「obscurin鏈」是指obscurin蛋白上一段長度為87-117個胺基酸的包含obscurin ig-樣1結構域的肽段或其功能變體，或obscurin-樣1蛋白上一段長度為78-118個胺基酸的包含obscurin-樣ig-樣1結構域的肽段或其功能變體，所述obscurin鏈能夠與titin ig-樣152結構域結合形成二聚化複合物。本披露的titin鏈與obscurin鏈可用於替換fab中的ch1和cl，形成經替換的fab(fab-s)。該替換不影響抗原結合分子與抗原的結合。
[0169]
術語「嵌合」抗體指抗體中的重和/或輕鏈的一部分自特定的來源或物種衍生，而重和/或輕鏈的剩餘部分自不同來源或物種衍生的抗體。
[0170]
術語「人源化」抗體是保留非人抗體的反應性同時在人中具有較低免疫原性的抗體。例如，可以通過保留非人cdr區並用其人對應物(即，恆定區以及可變區的框架區部分)替換抗體的其餘部分來實現。
[0171]
術語「親和力」是指分子(例如，抗體)的單個結合部位與其結合配體(例如，抗原)之間非共價相互作用的總體的強度。除非另外指明，如本文所用，「結合親和力」是指內部結合親和力，其反映出結合對(例如，抗體與抗原)的成員之間1:1相互作用。分子x對其配體y的親和力通常可以由平衡解離常數(kd)表示。親和力可以通過本領域已知的常規方法(包括本文所述的那些)測量。術語「kassoc」或「ka」指特定抗體-抗原相互作用的締合速率，而如本文所使用的術語「kdis」或「kd」意在是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。如本文所使用的，術語「kd」指平衡解離常數，其獲得自kd與ka的比率(即kd/ka)並且表示為摩爾濃度(m)。可以使用本領域已知的方法測定抗體的kd值，例如：用於測定抗體kd的方法包括使
用生物傳感系統例如系統測量表面等離子體共振，或通過溶液平衡滴定法(set)測量溶液中的親和力。
[0172]
術語「效應子功能」指那些可歸於抗體fc區(天然序列fc區或胺基酸序列變體fc區)且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應子功能的例子包括：c1q結合和補體依賴性細胞毒性；fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)；吞噬作用；細胞表面受體(例如b細胞受體)下調；和b細胞活化。
[0173]
術語「單克隆抗體」指基本上均質的抗體的群，即在該群中包含的抗體分子的胺基酸序列是相同的，除了可能少量存在的天然突變以外。相比之下，多克隆抗體製劑通常包含在其可變結構域具有不同胺基酸序列的多種不同抗體，其通常特異性針對不同表位。「單克隆」表示從基本上均質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不應解釋為要求通過任何特定方法來生產抗體。在一些實施方式中，本披露提供的抗體是單克隆抗體。
[0174]
術語「抗原」是指能夠由諸如抗原結合蛋白(例如抗體)的選擇性結合劑結合，且另外能夠用於動物中以產生能夠結合該抗原的抗體的分子或分子部分。抗原可具有一個或更多個能夠與不同的抗原結合蛋白(例如抗體)相互作用的表位。「活化性t細胞抗原」指在t淋巴細胞，特別是細胞毒性t淋巴細胞的表面上表達的抗原，其在與抗原結合分子相互作用後能誘導t細胞活化。「靶細胞抗原」指靶細胞表面上呈現的抗原，所述靶細胞例如腫瘤中的細胞如癌細胞或腫瘤基質的細胞。
[0175]
術語「表位」指能夠與抗體或其抗原結合片段特異性結合的抗原上的區域(area或region)。表位可以由連續胺基酸串(線性表位)形成或包含非連續胺基酸(構象表位)，例如因抗原的摺疊(即通過蛋白質性質的抗原的三級摺疊)而變成空間接近。構象表位和線性表位的差別在於：在變性溶劑的存在下，抗體對構象表位的結合喪失。通常表位包含處於獨特空間構象的至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，或8-10個胺基酸。篩選結合特定表位的抗體(即那些結合相同表位的)可以使用本領域例行方法來進行，例如但不限於丙氨酸掃描，肽印跡(見meth.mol.biol.248(2004)443-463)，肽切割分析，表位切除，表位提取，抗原的化學修飾(見prot.sci.9(2000)487-496)，和交叉阻斷(見「antibodies」，harlow and lane(cold spring harbor press,cold spring harb.,ny))。
[0176]
術語「能夠特異性結合」、「特異性結合」或「結合」是指相比其他抗原或表位，抗體能夠以更高的親和力結合至某個抗原或該抗原內的表位。通常，抗體以約1
×
10-7
m或更小(例如約1
×
10-8
m或更小)的平衡解離常數(kd)結合抗原或抗原內的表位。在一些實施方式中，抗體與抗原結合的kd為該抗體結合至非特異性抗原(例如bsa、酪蛋白)的kd的10％或更低(例如1％)。可使用已知的方法來測量kd，例如通過facs或表面等離子體共振測定法所測量的。然而，特異性結合至抗原或抗原內的表位的抗體可能對其它相關的抗原具有交叉反應性，例如，對來自其它物種(同源)(諸如人或猴，例如食蟹獼猴(macaca fascicμlaris)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(pan troglodytes)(chimpanzee，chimp))或狨猴(callithrix jacchus)(commonmarmoset，marmoset)的相應抗原具有交叉反應性。
[0177]
術語「抗原結合模塊」指特異性結合目標抗原的多肽分子。抗原結合模塊包括如本文所述的抗體及其片段。具體的抗原結合模塊包括抗體的抗原結合域，其包含抗體重鏈可變區和抗體輕鏈可變區。術語「特異性結合angptl3的抗原結合模塊」是指能夠以足夠的親和力結合angptl3的模塊。在某些實施例中，特異性結合angptl3的抗原結合模塊具有以下
的平衡解離常數(kd)：《約1μm、《約100nm或《約10nm或更小，其是通過biacore方法測量的。在某些實施例中，特異性結合angptl3的抗原結合模塊結合來自不同物種的angptl3中的保守表位。術語「特異性結合pcsk9的抗原結合模塊」是指能夠以足夠的親和力結合pcsk9的模塊，使得含有該模塊的分子可用作靶向pcsk9的診斷劑和/或治療劑。在某些實施例中，特異性結合pcsk9的抗原結合模塊具有以下的平衡解離常數(kd)：《約1μm、《約100nm、《約10nm或更小，其是通過biacore方法測量的。在某些實施例中，特異性結合pcsk9的抗原結合模塊結合來自不同物種的pcsk9中的保守表位。抗原結合模塊包括如本文定義的抗體片段，例如fab，經替換的fab或scfv。
[0178]
術語「連接子」指連接兩個多肽片段的連接單元。在本文中，同一結構式中出現的連接子可以是相同或不同的。連接子可以是肽連接子，其包含一個或更多個胺基酸，典型的約1-30個、2-24個或3-15個胺基酸。應用於本文的連接子可以是相同或不同的。當
「‑」
出現在結構式中，其表示兩側的單元直接通過共價鍵連接。當術語「鍵」出現在結構單元，其表示該單元沒有胺基酸，單元兩側的單元直接連接。
[0179]「tm」是溶解變性溫度(內源螢光)。當蛋白質變性(加熱或變性劑作用)時，三級結構打開，芳香族胺基酸微環境發生變化，導致發射螢光光譜改變。本披露中，tm1是指螢光變化到最大值的一半時的溫度。
[0180]「tonset」是變性起始溫度。意指蛋白質開始變性時的溫度，即螢光值開始變化時的溫度。
[0181]「tagg」是聚集起始溫度。通過靜態光散射，在266nm和473nm兩個波長下檢測聚集體，監測到樣品開始聚集時的溫度。tagg 266指的是266nm下監測到聚集起始溫度。
[0182]
術語「抗體依賴性細胞的細胞毒性」、「抗體依賴性細胞介導的細胞毒性」或「adcc」是誘導細胞死亡的機制，該機制依賴於抗體包被靶細胞與具有裂解活性的效應細胞(諸如自然殺傷細胞(nk)、單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞)經由效應細胞上表達的fcγ受體(fcγr)發生的相互作用。例如，nk細胞表達fcγriiia，而單核細胞表達fcγri、fcγrii和fcγriiia。本文提供的抗體的adcc活性可使用體外測定，使用表達抗原的細胞作為靶細胞和nk細胞作為效應細胞進行評定。根據從裂解的細胞中釋放的標記物(例如放射性底物、螢光染料或天然胞內蛋白)來檢測細胞裂解。
[0183]
術語「抗體依賴性細胞吞噬作用」(「adcp」)是指通過吞噬細胞(諸如巨噬細胞或樹突狀細胞)的內化作用消除抗體包被的靶細胞的機制。
[0184]
術語「補體依賴性細胞毒性」或「cdc」是指誘導細胞死亡的機制，其中靶結合抗體的fc效應域結合併激活補體成分c1q，c1q繼而激活補體級聯，從而導致靶細胞死亡。補體的激活也可導致補體成分沉積在靶細胞表面上，這些補體成分通過結合白細胞上的補體受體(例如，cr3)來促進cdc。
[0185]
術語「核酸」在本文中可與術語「多核苷酸」互換使用，並且是指呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有與參考核酸相似的結合特性，並且以類似於參考核苷酸的方式代謝。此類類似物的實例包括但不限於硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-o-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(pna)。「分離的」核酸指已經與其天然環境的組分分開的核酸分子。分離的核酸包括在下述
細胞中含有的核酸分子，所述細胞通常含有該核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置的染色體位置處。編碼所述抗原結合分子的分離的核酸指編碼抗體重鏈和輕鏈(或其片段)的一個或更多個核酸分子，包括在單一載體或分開的載體中的這樣的一個或更多個核酸分子，和存在於宿主細胞中一個或更多個位置的這樣的一個或更多個核酸分子。除非另有說明，否則特定的核酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體(例如，簡併密碼子取代)和互補序列以及明確指明的序列。具體地，如下詳述，簡併密碼子取代可以通過產生如下序列而獲得，在這些序列中，一個或更多個所選的(或全部)密碼子的第三位被混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代。
[0186]
術語「多肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用，指胺基酸殘基的聚合物。該術語適用於胺基酸聚合物，其中一個或更多個胺基酸殘基是相應天然存在的胺基酸的人工化學模擬物，以及適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。除非另外說明，否則特定的多肽序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體。
[0187]
術語序列「同一性」指，當對兩條序列進行最佳比對時，必要時引入間隙，以獲取最大序列同一性百分比，且不將任何保守性取代視為序列同一性的一部分，兩條序列的胺基酸/核酸在等價位置相同的程度(百分比)。為測定序列同一性百分比，比對可以通過本領域技術已知的技術來實現，例如使用公開可得到的計算機軟體，諸如blast、blast-2、align、align-2或megalign(dnastar)軟體。本領域技術人員可確定適用於測量比對的參數，包括在所比較的序列全長上達成最大比對所需的任何算法。
[0188]
術語「融合」或「連接」是指部件(例如抗原結合模塊和fc結構域)直接地或經由連接子共價連接。
[0189]
術語「載體」意指能夠轉運與其連接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一種類型的載體是「質粒」，其是指環狀雙鏈dna環，其中可以連接附加的dna區段。另一種類型的載體是病毒載體，例如腺相關病毒載體(aav或aav2)，其中另外的dna區段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可以在引入宿主細胞中後整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複製。術語「表達載體」或「表達構建體」是指適用於對宿主細胞進行轉化且含有指導及/或控制(連同宿主細胞一起)與其可操作地連接的一個或更多個異源編碼區的表達的核酸序列的載體。表達構建體可以包括但不限於影響或控制轉錄、翻譯且在存在內含子時影響與其可操作地連接的編碼區的rna剪接的序列。
[0190]
術語「宿主細胞」,「宿主細胞系」,和「宿主細胞培養物」可互換使用，並且指已經導入外源核酸的細胞，包括此類細胞的後代。宿主細胞包括「轉化體」和「經轉化的細胞」，其包括原代的經轉化的細胞及自其衍生的後代，而不考慮傳代的次數。後代在核酸內容物上可以與親本細胞不完全相同，而是可以含有突變。本文中包括具有與在初始轉化細胞中篩選或選擇的相同功能或生物學活性的突變體後代。宿主細胞包括原核和真核宿主細胞，其中真核宿主細胞包括但不限於哺乳動物細胞、昆蟲細胞系植物細胞和真菌細胞。哺乳動物宿主細胞包括人、小鼠、大鼠、犬、猴、豬、山羊、牛、馬和倉鼠細胞，包括但不限於中國倉鼠卵巢(cho)細胞、nso、sp2細胞、hela細胞、幼倉鼠腎(bhk)細胞、猴腎細胞(cos)、人肝細胞癌細胞(例如，hep g2)、a549細胞、3t3細胞和hek-293細胞。真菌細胞包括酵母和絲狀真菌細胞，包
括例如巴氏畢赤酵母(pichiapastoris)、芬蘭畢赤酵母(pichia finlandica)、海藻畢赤酵母(pichia trehalophila)、科克拉馬畢赤酵母(pichia koclamae)、膜狀畢赤酵母(pichia membranaefaciens)、小畢赤酵母(pichia minuta)(ogataea minuta、pichia lindneri)、仙人掌畢赤酵母(pichiaopuntiae)、耐熱畢赤酵母(pichia thermotolerans)、柳畢赤酵母(pichia salictaria)、pichia guercuum、皮傑普畢赤酵母(pichia pijperi)、具柄畢赤酵母(pichia stiptis)、甲醇畢赤酵母(pichia methanolica)、畢赤酵母屬、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、釀酒酵母屬、多形漢遜酵母(hansenμla polymorpha)、克魯維酵母屬、乳酸克魯維酵母(kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(candida albicans)、構巢麴黴(aspergillus nidμlans)、黑麴黴(aspergillus niger)、米麴黴(aspergillus oryzae)、裡氏木黴(trichoderma reesei)、勒克氏菌(chrysosporium lucknowense)、鐮刀菌屬(fusarium sp.)、禾穀鐮刀菌(fusarium gramineum)、菜鐮刀菌(fusarium venenatum)、小立碗蘚(physcomitrella patens)和粗糙脈孢菌(neurospora crassa)。畢赤酵母屬、任何釀酒酵母屬、多形漢遜酵母(hansenμla polymorpha)、任何克魯維酵母屬、白色念珠菌(candida albicans)、任何麴黴屬、裡氏木黴(trichoderma reesei)、勒克黴菌(chrysosporium lucknowense)、任何鐮刀菌屬、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)和粗糙脈孢菌(neurospora crassa)。
[0191]
如在本技術中所使用的，表述「細胞」、「細胞系」和「細胞培養物」可以互換使用，並且所有這樣的名稱均包括子代。因而，詞語「轉化體」和「轉化的細胞」包括原代受試者細胞和來源於其的培養物，而與傳代的次數無關。還應理解的是，由於有意或無意的突變，使得並非所有子代均具有完全相同的dna內容物。包括與篩選出其的原始轉化細胞具有相同功能或生物活性的突變子代。
[0192]「任選」或「任選地」意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。
[0193]
術語「藥物組合物」表示含有一種或多種本文所述的抗體或抗原結合分子與其他化學組分的混合物，所述其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。
[0194]
術語「藥學上可接受的載體」指藥學配製劑中與活性成分不同的,且對受試者無毒的成分。藥學可接受載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
[0195]
術語「受試者」或「個體」包括人類和非人類動物。非人動物包括所有脊椎動物(例如哺乳動物和非哺乳動物)例如非人靈長類(例如，食蟹猴)、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除非指出時，否則所述術語「患者」或「受試者」在本文中可互換地使用。如本文所使用的，術語「食蟹猴(cyno)」或「食蟹猴(cynomolgus)」是指食蟹猴(macaca fascicμlaris)。在某些實施方案中，個體或受試者是人。
[0196]「施用」或「給予」，當其應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。
[0197]
術語「樣本」是指從受試者分離的類似流體、細胞、或組織的採集物，以及存在於受試者體內的流體、細胞或組織。示例性樣本為生物流體，諸如血液、血清和漿膜液、血漿、淋巴液、尿液、唾液、囊液、淚液、排洩物、痰、分泌組織和器官的黏膜分泌物、陰道分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它體腔的流體、由支氣管灌洗液收集的流體、滑液、與受試者
或生物來源接觸的液體溶液，例如細胞和器官培養基(包括細胞或器官條件培養基)、灌洗液等，組織活檢樣本、細針穿刺、手術切除的組織、器官培養物或細胞培養物。
[0198]「治療(treatment或treat)」和「處理」(及其語法變型)指試圖改變所治療個體的天然過程的臨床幹預，並且可以為了預防或者在臨床病理學的過程期間實施。治療的期望效果包括但不限於預防疾病的發生或再發生，減輕症狀，減輕/減少疾病的任何直接或間接病理後果，預防轉移，降低疾病進展速率，改善或減輕疾病狀態，和消退或改善的預後。在一些實施方案中，使用本披露的抗體來延遲疾病的形成或減緩疾病的進展。
[0199]「有效量」一般是足以降低症狀的嚴重程度及/或頻率、消除這些症狀及/或潛在病因、預防症狀及/或其潛在病因出現及/或改良或改善由疾病狀態引起或與其相關的損傷(例如肺病)的量。在一些實施例中，有效量是治療有效量或預防有效量。「治療有效量」是足以治療疾病狀態或症狀、尤其與該疾病狀態相關的狀態或症狀，或者以其他方式預防、阻礙、延遲或逆轉該疾病狀態或以任何方式與該疾病相關的任何其他不理想症狀的進展的量。「預防有效量」是當給予受試者時將具有預定預防效應，例如預防或延遲該疾病狀態的發作(或復發)，或者降低該疾病狀態或相關症狀的發作(或復發)可能性的量。完全治療或預防效未必在給予一個劑量之後便發生，可能在給予一系列劑量之後發生。因而，治療或預防有效量可以一次或多次給予的方式給予。「治療有效量」和「預防有效量」可取決於多種因素變化：諸如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重，以及治療劑或治療劑組合在個體中引發期望的應答的能力。有效治療劑或治療劑組合的示例性指標包括例如患者改善的健康狀況。
[0200]
本披露的抗原結合分子
[0201]
本披露提供了抗原結合分子，在一些實施方式中，其具有諸多有利的特性，例如對angptl3和pcsk9的結合特異性、藥物代謝動力學特性和/或成藥性(如產率、純度和穩定性等)。
[0202]
示例性的抗原結合分子
[0203]
在一個方面，本披露提供了一種抗原結合分子，其包含至少一個特異性結合angptl3的抗原結合模塊和至少一個特異性結合pcsk9的抗原結合模塊。特別的，本披露的抗原結合分子具有以下一種或更多種功能：
[0204]
a.針對angptl3和/或pcsk9的高親和力。在一些實施方式中，所述的抗原結合分子以小於1.0e-10(例如小於8.0e-11m、小於7.0e-11m、小於6.0e-11m、5.0e-11m、4.0e-11m或更小)的kd值與人angptl3結合，和/或，所述的抗原結合分子以小於1.0e-8(例如小於9.0e-9m、小於7.0e-9m、小於6.0e-9m、5.0e-9m、4.0e-9m、3.0e-9m、2.0e-9m或更小)的kd值與人pcsk9結合；所述kd值是通過biacore方法測定的。具體測試方法見測試例1；
[0205]
b.阻斷angptl3對lpl酶的活性作用。具體測試方法見測試例2；或
[0206]
c.有效降脂效果；在一些實施方式中，所述抗原結合分子能有效降低tg，tc，non-hdl-c和/或ldl-c水平；具體測試方法見測試例4或5。
[0207]
在一些實施方式中，所述的抗原結合分子，其包含至少一個特異性結合angptl3的抗原結合模塊1和至少一個特異性結合pcsk9的抗原結合模塊2；其中，所述特異性結合angptl3的抗原結合模塊1包含重鏈可變區a-vh和輕鏈可變區a-vl，所述a-vh包含a-hcdr1、a-hcdr2和a-hcdr3，所述a-vl包含a-lcdr1、a-lcdr2和a-lcdr3，所述特異性結合pcsk9的抗
原結合模塊2包含重鏈可變區k-vh和輕鏈可變區k-vl，所述k-vh包含k-hcdr1、k-hcdr2和k-hcdr3，所述k-vl包含k-lcdr1、k-lcdr2和k-lcdr3；其中
[0208]
在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，所述k-hcdr1、k-hcdr2、k-hcdr3、k-lcdr1、k-lcdr2和k-lcdr3是根據kabat編號規則定義的，其k-hcdr1如seq id no：58所示，k-hcdr2如seq id no：59所示，k-hcdr3如seq id no：60至66任一所示，k-lcdr1如seq id no：67至70任一所示，k-lcdr2如seq id no：71所示，和k-lcdr3如seq id no：72所示；和
[0209]
所述a-hcdr1、a-hcdr2、a-hcdr3、a-lcdr1、a-lcdr2和a-lcdr3是根據kabat編號規則定義的，其中，
[0210]
(i)所述a-hcdr1如seq id no：24所示，所述a-hcdr2如seq id no：28所示，所述a-hcdr3如seq id no：26所示，所述a-lcdr1如seq id no：27所示，所述a-lcdr2如seq id no：22所示，和所述a-lcdr3如seq id no：23所示，或
[0211]
(ii)所述a-hcdr1如seq id no：24所示，所述a-hcdr2如seq id no：25所示，所述a-hcdr3如seq id no：26所示，所述a-lcdr1如seq id no：21所示，所述a-lcdr2如seq id no：22所示，和所述a-lcdr3如seq id no：23所示，或
[0212]
(iii)所述a-hcdr1如seq id no：18所示，所述a-hcdr2如seq id no：19所示，所述a-hcdr3如seq id no：20所示，所述a-lcdr1如seq id no：15所示，所述a-lcdr2如seq id no：16所示，和所述a-lcdr3如seq id no：17所示。
[0213]
在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，其中：(i)所述a-vh如seq id no：37所示，並且所述a-vl如seq id no：14所示；或所述a-vh如seq id no：13所示，並且所述a-vl如seq id no：14所示；或所述a-vh包含seq id no：11所示，並且所述a-vl如seq id no：12所示；或所述a-vh包含seq id no：9所示，並且所述a-vl如seq id no：10所示；和/或
[0214]
(ii)所述k-vh如seq id no：216所示，並且所述k-vl如seq id no：217所示；在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，所述k-vh如seq id no：40、42至50中任一條所示，並且所述k-vl如seq id no：41、51至57中任一條所示。
[0215]
抗原結合分子的變體
[0216]
在某些實施方案中，涵蓋本文中提供的抗原結合分子的胺基酸序列變體。例如，可以期望改善抗體的結合親和力和/或其它生物學特性。可以通過將合適的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或者通過肽合成來製備抗體的胺基酸序列變體。此類修飾包括例如對抗原結合分子的胺基酸序列內的殘基的刪除、和/或插入、和/或取代。可以進行刪除、插入、和取代的任何組合以得到最終的構建體，只要最終的構建體擁有期望的特徵，例如抗原結合特性。
[0217]
取代、插入、和刪除變體
[0218]
在某些實施方案中，提供了具有一處或多處胺基酸取代的抗原結合分子變體。取代誘變感興趣的位點包括cdr和fr。保守取代在表1-2中在「優選的取代」的標題下顯示。更實質的變化在表2中在「例示性取代」的標題下提供，並且如下文參照胺基酸側鏈類別進一步描述的。可以將胺基酸取代引入感興趣的抗體中，並且對產物篩選期望的活性，例如保留/改善的抗原結合，降低的免疫原性，或改善的adcc或cdc。
[0219]
表1-2.胺基酸的取代
[0220][0221][0222]
依照常見的側鏈特性，胺基酸可以如下分組:
[0223]
(1)疏水性的：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
[0224]
(2)中性，親水性的：cys，ser，thr，asn，gln；
[0225]
(3)酸性的：asp，glu；
[0226]
(4)鹼性的：his，lys，arg；
[0227]
(5)影響鏈取向的殘基：gly，pro；
[0228]
(6)芳香族的：trp，tyr，phe。
[0229]
非保守取代會需要用這些類別之一的成員替換另一個類別的成員。
[0230]
一類取代變體涉及取代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或更多個cdr殘基。一般地，經選擇用於進一步研究的所得變體相對於親本抗體會具有某些生物學特性(例如升高的親和力，降低的免疫原性)的改變(例如改善)，和/或會基本上保留親本抗體的某些生物學特性。一種例示性的取代變體是親和力成熟的抗體，可以例如使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術(如本文所述的那些技術)，便利地產生所述抗體。簡言之，將一個或更
多個cdr殘基突變，並將變體抗體在噬菌體上展示，並對其篩選特定的生物學活性(例如結合親和力)。可以對cdr做出改變(例如取代)，例如以改善抗體親和力。可以對cdr「熱點」，即在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變的密碼子所編碼的殘基，和/或接觸抗原的殘基做出此類改變，同時對所得的變體vh或vl測試結合親和力。在親和力成熟的一些實施方案中，通過多種方法(例如易錯pcr、鏈改組、或寡核苷酸指導的誘變)的任一種，將多樣性引入所選擇用於成熟的可變基因中。然後，創建次級文庫。然後，篩選文庫以鑑定具有期望的親和力的任何抗體變體。另一種引入多樣性的方法涉及cdr定向的方法，其中將幾個cdr殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。可以例如使用丙氨酸掃描誘變或建模來特異性鑑定涉及抗原結合的cdr殘基。特別地，經常靶向hcdr3和lcdr3。
[0231]
在某些實施方案中，取代、插入或缺失可以在一個或更多個cdr內發生，只要此類變化不實質性降低抗體結合抗原的能力。例如，可以對cdr做出保守變化(例如保守取代，如本文中提供的)，其不實質性降低結合親和力。此類變化可以例如在cdr中的抗原接觸殘基外部。在上文提供的變體vh和vl序列的某些實施方案中，每個cdr是未改變的，或者含有不超過1、2或3處胺基酸取代。
[0232]
一種可用於鑑定抗體中可以作為誘變靶位的殘基或區域的方法稱作「丙氨酸掃描誘變」。在這種方法中，鑑定一個殘基或靶殘基組(例如帶電荷的殘基，諸如arg、asp、his、lys和glu)，並且用中性或帶負電荷的胺基酸(例如，ala或聚丙氨酸)替換以確定該抗體與抗原的相互作用是否受影響。可以在對初始取代顯示功能敏感性的胺基酸位置引入進一步的取代。此外，可通過研究抗原-抗體複合物的晶體結構來鑑定抗體與抗原間的接觸點。這些接觸殘基及鄰近殘基可以作為取代候選物被打靶或消除。可以篩選變體以確定它們是否含有期望的特性。
[0233]
胺基酸序列插入包括長度範圍為1個殘基至含有100或更多個殘基的多肽的氨基和/或羧基端融合，和單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的例子包括具有n端甲硫氨醯基殘基的抗體。抗體分子的其它插入變體包括抗體的n或c端與酶或延長抗體的血清半衰期的多肽的融合物。
[0234]
fab的改造
[0235]
在一個方面，本披露的抗原結合分子中，所述特異性結合angptl3的抗原結合模塊是fab，所述特異性結合pcsk9的抗原結合模塊是經替換的fab，所述經替換的fab包含重鏈可變區、輕鏈可變區、titin鏈和obscurin鏈。在經替換的fab中，fab原有的ch1和cl被titin鏈和obscurin鏈所替換。在一個方面，本披露的抗原結合分子中，所述特異性結合pcsk9的抗原結合模塊是fab，所述特異性結合angptl3的抗原結合模塊是經替換的fab，所述經替換的fab包含重鏈可變區、輕鏈可變區、titin鏈和obscurin鏈。在經替換的fab中，fab原有的ch1和cl被titin鏈和obscurin鏈所替換。
[0236]
fc區的改造
[0237]
在一個方面，本披露的抗原結合分子的fc區包含一個或更多個胺基酸取代，所述一個或更多個胺基酸取代減少其與fc受體的結合，例如其與fcγ受體的結合，並且降低或消除效應子功能。天然igg fc區，具體地是igg
1 fc區或igg
4 fc區，可能導致本披露的抗原結合分子靶向表達fc受體的細胞，而不是表達抗原的細胞。本披露改造的fc區表現出降低的對fc受體的結合親和力和/或降低的效應子功能。在一些實施方案中，改造的fc區與天然
fc區相比，對fc受體的結合親和力下降50％、80％、90％或95％以上。在一些實施方案中，所述的fc受體是fcγ受體。在一些實施方案中，所述fc受體是人fcγ受體，例如fcγri、fcγriia、fcγriib、fcγriiia。在一些實施方案中，改造的fc區與天然fc區相比，對補體，如c1q的結合親和力也降低。在一些實施方案中，改造的fc區與天然fc區相比，對新生兒fc受體(fcrn)的結合親和力不降低。在一些實施例中，改造的fc區具有降低的效應子功能，所述降低的效應子功能可以包括但不限於以下中的一個或更多個：降低的補體依賴性細胞毒性(cdc)、降低的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)、降低的抗體依賴性細胞吞噬(adcp)、減少的細胞因子分泌、減少的免疫複合物介導的抗原呈遞細胞的抗原攝取、減少的與nk細胞的結合、減少的與巨噬細胞的結合、減少的與單核細胞的結合、減少的與多形核細胞的結合、減少的直接信號傳導誘導性細胞凋亡、降低的樹突細胞成熟或減少的t細胞引發。對於igg
1 fc區，在238、265、269、270、297、327和329等位置的胺基酸殘基取代可降低的效應子功能。在一些實施方案中，所述fc區是人igg
1 fc區，並且在234和235位置的胺基酸殘基為a，編號依據為eu索引。對於igg
4 fc區，在228等位置的胺基酸殘基取代可降低的效應子功能。
[0238]
抗原結合分子可包含與fc區的兩個亞基融合的不同抗原結合模塊，因此可能導致不期望的同源二聚化。為了提高產率和純度，因此在本發明的抗原結合分子的fc區中引入促進異源二聚化的修飾將是有利的。在一些實施方式中，本披露的fc區包含根據杵臼(knob-into-hole，kih)技術的改造，該方法涉及在第一亞基的界面處引入凸起結構(knob)以及在第二亞基的界面處引入孔結構(hole)；或者在第二亞基的界面處引入凸起結構(knob)以及在第一亞基的界面處引入孔結構(hole)。使得所述凸起結構可以定位在孔結構中，促進異源二聚體的形成並抑制同源二聚體的產生。凸起結構是通過用較大側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)取代來自第一亞基的界面的小胺基酸側鏈而構建的。而孔結構是通過用較小的胺基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)取代大胺基酸側鏈而在第二亞基的界面中創建的。凸起結構和孔結構通過改變編碼多肽的核酸來製備。在一些實施方案中，可選的胺基酸取代如下表所示：
[0239]
表1-3.kih突變組合
[0240][0241]
除了杵臼技術外，用於修飾多特異性抗體的重鏈的ch3結構域以實現異源二聚化的其他技術也是本領域中已知的，例如wo96/27011、wo98/050431、ep1870459、wo2007/110205、wo 007/147901、wo2009/089004、wo2010/129304、wo2011/90754、wo2011/143545、wo2012/058768、wo2013/157954和wo 013/096291。
[0242]
抗原結合分子還可包含二硫鍵改造，例如fc區的第一亞基包含354c突變和第二亞基包含349c突變，使fc區的第一亞基和第二亞基之間產生工程化二硫鍵，促進fc區第一亞基和第二亞基的形成異源二聚化。
[0243]
抗原結合分子的fc區還可進一步引入其它的胺基酸改造，例如降低免疫原性的同種異型胺基酸殘基突變。在一些實施方案中，igg1的fc引入356e和358m突變。
[0244]
fc區的c末端可以是以胺基酸殘基pgk結束的完整c末端；也可以是縮短的c末端，例如在所述縮短的c末端中已經去除了一個或兩個c末端胺基酸殘基。在一個優選的方面中，重鏈的c末端是以pg結束的縮短的c末端。因此，在一些實施方式中，完整抗體的組合物可以包括去除了所有k447殘基和/或g446+k447殘基的抗體群體。在一些實施方式中，完整抗體的組合物可以包括沒有去除k447殘基和/或g446+k447殘基的抗體群體。在一些實施方式中，完整抗體的組合物具有帶有和不帶有k447殘基和/或g446+k447殘基的抗體混合物的抗體群體。
[0245]
重組方法
[0246]
抗原結合分子可以使用重組方法來產生。對於這些方法，提供編碼抗原結合分子的一個或更多個分離的核酸。
[0247]
在天然抗體、天然抗體片段或具有同源二聚體重鏈的雙特異性抗體的情況下，需要兩個核酸，一個用於輕鏈或其片段，一個用於重鏈或其片段。此類核酸編碼包含抗體vl的胺基酸序列和/或包含抗體vh的胺基酸序列(例如抗體的輕鏈和/或重鏈)。這些核酸可以在相同的表達載體上或在不同的表達載體上。
[0248]
在具有異二聚體重鏈的雙特異性抗體的情況下，需要四個核酸，一個用於第一輕鏈，一個用於包含第一異源單體fc區多肽的第一重鏈，一個用於第二輕鏈，並且一個用於包含第二異源單體fc區多肽的第二重鏈。這四個核酸可包含在一個或更多個核酸分子或表達載體中，通常這些核酸位於兩個或三個表達載體上，即一個載體可包含這些核酸中的多於一個。
[0249]
在一個實施方案中，本披露提供了編碼如前所述的抗體的分離的核酸。此類核酸可以給自獨立的編碼前述的任一多肽鏈。在另一方面中，本披露提供了包含此類核酸的一種或多種載體(例如表達載體)。在另一方面中，本披露提供了包含此類核酸的宿主細胞。在一個實施方案中，提供製備抗原結合分子的方法，其中所述方法包括，在適合抗體表達的條件下，培養包含編碼所述抗體的核酸的宿主細胞，如上文所提供的，和任選地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收所述抗體。
[0250]
為了重組產生抗原結合分子，將編碼蛋白的核酸分離並插入一個或更多個載體中，用於在宿主細胞中進一步克隆和/或表達。此類核酸可以使用常規程序容易地分離和測序(例如通過使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)，或者通過重組方法產生或通過化學合成獲得。
[0251]
用於克隆或表達編碼抗體的載體的適當宿主細胞包括本文描述的原核或真核細胞。例如，抗體可在細菌中產生，特別是當抗體不需要糖基化和fc效應子功能時。在表達後，抗體可以在可溶級分中從細菌細胞糊狀物分離，並且可進一步純化。
[0252]
除了原核生物以外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母也是用於編碼抗體的載體的合適的克隆或表達宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途徑已經「人源化」，導致產生具有
部分或完全人糖基化模式的抗體。適於表達(糖基化)抗體的合適的宿主細胞也可源自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)；無脊椎動物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經鑑定了許多杆狀病毒株，其可與昆蟲細胞聯合使用，特別是用於草地貪夜蛾(spodoptera frugiperda)細胞的轉染；還可利用植物細胞培養物作為宿主，例如us5959177、us 6040498、us6420548、us 7125978和us6417429；也可將脊椎動物細胞用作宿主，例如適應於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞系。適宜的哺乳動物宿主細胞系的其它例子是經sv40轉化的猴腎cvl系(cos-7)；人胚腎系(293或293t細胞)；幼倉鼠腎細胞(bhk)；小鼠塞託利(sertoli)細胞(tm4細胞)；猴腎細胞(cv1)；非洲綠猴腎細胞(vero-76)；人宮頸癌細胞(hela)；犬腎細胞(mdck)；水牛鼠(buffalo rat)肝細胞(brl3a)；人肺細胞(w138)；人肝細胞(hep g2)；小鼠乳房腫瘤(mmt 060562)；tri細胞；mrc 5細胞；和fs4細胞。其它適宜的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(cho)細胞，包括dhfr-cho細胞；以及骨髓瘤細胞系，如y0、ns0和sp2/0。關於適合產生抗體的某些哺乳動物宿主細胞系的綜述參見例如yazaki，p.和wu，a.m.，methods in molecμlar biology，vol.248，lo，b.k.c.(編)，humana press，totowa，nj(2004)，第255-268頁。
[0253]
免疫綴合物
[0254]
本披露還提供免疫綴合物，其包含與一種或多種細胞毒性劑綴合的抗原結合分子，所述一種或多種細胞毒性劑為諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源的蛋白質毒素、酶活性毒素，或它們的片段)、或放射性同位素。
[0255]
診斷與治療組合物
[0256]
在某些實施方案中，本披露提供的抗原結合分子可用於檢測生物學樣品中angptl3或pcsk9的存在。在用於本文時，術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。在某些實施方案中，生物學樣品包含細胞或組織，諸如腫瘤組織。
[0257]
在一個實施方案中，提供了在診斷或檢測方法中使用的抗原結合分子。在又一方面，提供了檢測生物學樣品中angptl3或pcsk9的存在的方法。在某些實施方案中，該方法包括在適宜條件下使生物學樣品與抗原結合分子接觸，並檢測是否在檢測試劑與抗原之間形成複合物。此類方法可以是體外或體內方法。在一個實施方案中，使用抗原結合分子來選擇適合治療的受試者，例如angptl3或pcsk9是用於選擇患者的生物標誌物。
[0258]
在某些實施方案中，提供了經標記的抗原結合分子。標記物包括但不限於直接檢測的標記物或模塊(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光、和放射性標記物)，和間接檢測的模塊(例如，經由酶反應或分子相互作用間接檢測的模塊，諸如酶或配體)。
[0259]
在另外的方面，提供包含所述抗原結合分子的藥物組合物，例如，用於以下任何治療方法。在一個方面，藥物組合物包含本文提供的任何抗體和藥學上可接受的載體。在另一個方面，藥物組合物包含本文提供的任何抗體和至少一種另外的治療劑。
[0260]
本披露所述的抗原結合分子的藥物組合物通過以下製備：將具有所需純度的此類抗體與一種或更多種任選的藥學上可接受的載體混合，所述藥物組合物為凍幹組合物或水溶液的形式。用於體內施用的配製劑一般是無菌的。無菌性可容易地實現，例如通過穿過無菌濾膜過濾。
[0261]
治療方法與施用途徑
[0262]
本文提供的任何抗原結合分子可用於治療方法。
[0263]
在又一個方面，本披露提供抗原結合分子在藥物的製造或製備中的用途。在一個實施方案中，所述藥物用於治療angptl3和/或pcsk9相關疾病，例如高表達angptl3和/或pcsk9的疾病，例如高膽固醇血症、高脂血症或動脈粥樣硬化。並且所述藥物是以對上述疾病的有效量的形式存在的。在一些實施方式中，所述有效量是單位日劑量或單位周劑量。在一個此類實施方案中，所述用途進一步包括向受試者施用有效量的至少一種另外的治療劑(例如一種、兩種、三種、四種、五種或六種另外的治療劑)。根據任意以上實施方案的「受試者」可以是人。
[0264]
在又一個的方面，提供包含所述抗原結合分子的藥物組合物，例如，其用於以上任何製藥用途或治療方法。在另一個實施方案中，藥物組合物還包含至少一種另外的治療劑。
[0265]
本披露的抗原結合分子可單獨使用或與其他試劑聯合用於治療。例如，本披露的抗體可與至少一種另外的治療劑共同施用。
[0266]
本披露的抗原結合分子(和任何另外的治療劑)可通過任何合適的手段施用，包括腸胃外、肺內和鼻內，並且如果需要局部治療，則病灶內施用。腸胃外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。給藥可以通過任何適當的途徑，例如，通過注射，諸如靜脈內或皮下注射，這部分取決於施用是短期的還是長期的。本文考慮多種給藥時間方案，包括但不限於，單次或在多個時間點多次施用，推注施用和脈衝輸注。
[0267]
本披露的抗原結合分子將以符合良好醫療實踐的方式配製、給藥和施用。在此背景下考慮的因素包括所治療的具體病症、所治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床狀況、病症的起因、試劑的遞送部位、施用方法、施用時間安排以及醫學從業者已知的其他因素。抗原結合分子無需但任選地與目前用於預防或治療所述病症的一種或更多種試劑一起配製。此類其它試劑的有效量取決於藥物組合物中存在的抗原結合分子的量、病症或治療的類型以及上文討論的其它因素。這些通常以與本文所述相同的劑量和施用路徑使用，或以本文所述劑量的約1至99％使用，或以任何劑量使用，並通過經驗/臨床確定為合適的任何途徑使用。
[0268]
為了預防或治療疾病，本披露的抗原結合分子(當單獨使用或與一種或更多種其他另外的治療劑組合使用時)的適當的劑量將取決於待治療的疾病的類型，治療分子的類型，疾病的嚴重性和病程，是為預防還是治療目的施用，之前的治療，患者的臨床病史和對治療分子的響應，和主治醫師的判斷。治療分子恰當地以一次或經過一系列治療施用於患者。取決於疾病的類型和嚴重性，示例性的單位日劑量為50μg-5g。
[0269]
製品
[0270]
在本披露的另一方面中，提供一種製品，所述製品包含可用於治療、預防和/或診斷上述病症的材料。該製品包含容器和在容器上或與容器聯合的標籤或包裝插頁(package insert)。合適的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、注射器、iv溶液袋等。容器可以自各種材料諸如玻璃或塑料形成。容器裝有單獨或與另一種組合物組合有效治療，預防和/或診斷疾患的組合物，並且可具有無菌的存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或管形瓶)。組合物中的至少一種活性試劑是本披露的抗原結合分子。標籤或包裝插頁指示使用該組合物是來治療選擇的病況。此外，製品可以包含：(a)其中裝有組合物的第一容器，其中所述組合物包含本披露的抗原結合分子；和(b)其中裝有組合物的第二容器，其中所述組合物包含另外的細胞毒性劑或其他方面的治療劑。本披露的該實施方案
中的製品可進一步包含包裝插頁，所述包裝插頁指示所述組合物可以用於治療特定病況。備選地，或另外地，製品可進一步包含第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含藥學上可接受的緩衝液。從商業和用戶立場，它可進一步包括所需的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。
[0271]
實施例與測試例
[0272]
以下結合實施例和測試例進一步描述本披露，但這些實施例和測試例並非限制著本披露的範圍。本披露實施例和測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子克隆手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
[0273]
實施例1.特異性結合angptl3的抗原結合分子
[0274]
特異性結合angptl3的分子可以來源於任意適宜的抗體，包括來源於pct/cn2021/073239申請文本(通過援引完整收入本文)中所述的抗angptl3抗體，例如p8bg。特異性結合angptl3的分子也包括p8bg的變體p8bg1。
[0275]
實施例1.1angptl3抗原設計及表達
[0276]
以人angptl3蛋白(uniprot號：q9y5c1)、小鼠angptl3蛋白(uniprot號：q9r182)、食蟹猴angptl3蛋白(uniprot號：a0a2k5udc5)、大鼠angptl3蛋白(uniprot號：f7fhp0)作為本披露angptl3的模板，設計本披露涉及的抗原及檢測用蛋白，在angptl3蛋白基礎上融合不同的標籤，分別克隆到ptt5載體上(biovector，cat#:102762)，在293細胞中瞬時轉染表達、然後純化，獲得編碼本披露抗原及檢測用蛋白。
[0277]
1、人全長angptl3：人-angptl3(17-460)-his，可用於免疫和檢測，其胺基酸序列如下：
[0278][0279]
注釋：單下劃線部分為信號肽序列，斜體字部分為his序列，粗體字部分為人angptl3全長蛋白的第17至第460位胺基酸。
[0280]
2、人angptl3胞外區：人angptl3(17-170)-flag-his，可用於免疫和檢測，其胺基酸序列如下：
[0281][0282]
注釋：單下劃線部分為信號肽，雙下劃線部分為連接肽，斜體部分為flag和his，粗體字部分為人angptl3全長蛋白的第17至第170位胺基酸。
[0283]
3、人angptl3胞外區(人angptl3(17-170))與小鼠igg2afc段(縮寫：mfc)的融合蛋白：人angptl3(17-170)-mfc，可用於檢測，其胺基酸序列如下：
[0284][0285]
注釋：下劃線部分為信號肽，斜體部分為小鼠igg2afc，粗體字部分為人angptl3全長蛋白的第17至第170位胺基酸。
[0286]
4、人angptl3胞外區(人angptl3(17-220))與小鼠igg2afc段的融合蛋白：人angptl3(17-220)-mfc，用於免疫和檢測，其胺基酸序列如下：
[0287][0288]
注釋：下劃線部分為信號肽，斜體部分為小鼠igg2afc，粗體字部分為人angptl3全長蛋白的第17至第220位胺基酸。
[0289]
5、小鼠全長angptl3：小鼠angptl3(17-455)-his，用於免疫和檢測，其胺基酸序列如下：
[0290][0291][0292]
注釋：下劃線部分為信號肽，斜體部分為his序列，粗體字部分為小鼠angptl3全長蛋白的第17至第455位胺基酸。
[0293]
6、小鼠angptl3胞外區(mouse-angptl3(17-220))與小鼠igg2afc段的融合蛋白：小鼠angptl3(17-220)-mfc，用於免疫，其胺基酸序列如下：
[0294][0295]
注釋：下劃線部分為信號肽，斜體部分為小鼠igg2afc，粗體字部分為小鼠angptl3全長蛋白的第17至第220位胺基酸。
[0296]
7、食蟹猴全長angptl3：食蟹猴angptl3(17-460)-his，用於檢測，其胺基酸序列如下：
[0297]
[0298][0299]
注釋：下劃線部分為信號肽，斜體部分為his序列，粗體字部分為食蟹猴angptl3全長蛋白的第17至第460位胺基酸。
[0300]
8、大鼠全長angptl3：大鼠angptl3(17-455)-his，用於檢測，其胺基酸序列如下：
[0301][0302]
注釋：劃橫線部分為信號肽，斜體部分為his序列，粗體字部分為大鼠angptl3全長蛋白的第17至第455位胺基酸。
[0303]
實施例1.2angptl3抗原蛋白、雜交瘤抗體、重組抗體的純化
[0304]
一、帶his標籤的重組蛋白或帶flag-his標籤的重組蛋白的純化
[0305]
將細胞表達樣品高速離心去除細胞和不溶雜質，收集上清並加入咪唑至終濃度為5mm。用含有5mm咪唑的pbs溶液平衡鎳柱，衝洗2-5倍柱體積。將細胞上清上柱。用含有5mm咪唑的pbs溶液衝洗柱子，至a280讀數降至基線。然後用pbs+10mm咪唑衝洗層析柱，除去非特異結合的雜蛋白，並收集流穿液。再用含有300mm咪唑的pbs溶液洗脫目的蛋白，並收集洗脫峰。
[0306]
收集的洗脫液用superdex凝膠過濾柱進行進一步精純，分管收集。所得到的樣品經過sds-page，肽圖，lc-ms鑑定為正確後分裝備用。得到帶his標籤的重組蛋白或帶flag-his標籤的重組蛋白。
[0307]
二、雜交瘤抗體或帶mfc標籤的重組蛋白的純化
[0308]
將樣品高速離心去除細胞及不溶性雜質，留上清。使用1
×
pbs平衡protein a親和柱，衝洗2-5倍柱體積。將離心後的細胞表達上清樣品上柱。用1
×
pbs衝洗柱子，至a280讀數降至基線。用1
×
pbs衝洗柱子。用0.1m乙酸(ph3.5-4.0)洗脫目的蛋白，並收集，之後立即用1m tris-hcl(ph 7.0)調節洗脫蛋白ph至中性，最後透析或者濃縮換液至1
×
pbs緩衝液中。收集樣品，經電泳、肽圖、lc-ms鑑定正確後分裝備用。得到帶mfc標籤的重組蛋白或雜交瘤抗體。
[0309]
三、抗體、帶fc標籤的重組蛋白的純化
[0310]
將樣品高速離心去除細胞及不溶性雜質，留上清。使用1
×
pbs平衡protein g親和柱，衝洗2-5倍柱體積。將離心後的細胞表達上清樣品上柱。用1
×
pbs衝洗柱子，至a280讀數降至基線。用1
×
pbs衝洗柱子。用乙酸(ph 3.0)洗脫目的蛋白，並收集，之後立即用1m tris-hcl(ph 7.0)調節洗脫蛋白ph至中性，最後透析或者濃縮換液至1
×
pbs緩衝液中。收集樣品經電泳、肽圖、lc-ms鑑定正確後分裝備用。得到抗體或者帶hfc標籤的重組蛋白。
[0311]
實施例1.3抗angptl3抗體的製備
[0312]
一、通過噬菌體庫篩選抗angptl3人源抗體
[0313]
人源噬菌體單鏈抗體庫進行包裝濃縮，將噬菌體庫(10
12
～10
13
/pfu)懸浮於1ml 2％mpbs(含有2％脫脂奶粉的pbs)中，並加入100μl m-280鏈黴親和素(invitrogen cat no.11206d)，置於轉臺上反覆翻轉，室溫封閉1小時。將管子置於磁力架上2分鐘，去除dynabeads，噬菌體庫轉移至新的管子中。向封閉後的噬菌體庫中加入2μg/ml生物素標記的人angptl3(17-460)-his，置於轉臺上反覆翻轉1小時。同時取100μl dynabeads懸浮於1ml 2％mpbs中，置於轉臺上反覆翻轉，室溫封閉1小時。將管子置於磁力架上2分鐘，吸去封閉液。將封閉後的dynabeads加入到噬菌體庫和人angptl3(17-460)-his混合液中，置於轉臺上反覆翻轉15分鐘。將管子置於磁力架上2分鐘，吸去混合液。用1ml pbst(含0.1％tween-20的pbs)洗dynabeads 10次，再加入0.5ml 1mg/ml胰蛋白酶(sigma cat no.t1426-250mg)，置於轉臺上反覆翻轉孵育15分鐘，進行洗脫，將洗脫下來的噬菌體感染大腸桿菌tg1塗平板，隨機挑取單克隆，用於噬菌體elisa。
[0314]
將克隆接種於96孔深孔板(nunc cat no.260251)37度培養16～18小時。取少量接種至另一個96孔深孔板，至od600達到0.5左右，加入m13k07輔助噬菌體(neb cat no.n0315s)進行包裝。4000g離心10分鐘去除菌體，吸取培養液進行angptl3結合elisa檢測。陽性克隆菌種凍存保種並送測序公司測序。其中，測得陽性克隆p3、p8對應的胺基酸序列如下：
[0315]
》p3重鏈可變區序列：
[0316][0317]
》p3輕鏈可變區序列：
[0318][0319]
》p8重鏈可變區序列：
[0320]
[0321]
》p8輕鏈可變區序列：
[0322][0323]
備註：序列中下劃線部分為根據kabat編號系統確定的cdr序列，斜體為fr序列。
[0324]
二、抗angptl3抗體的突變
[0325]
以p8抗體的三維結構為基礎，將p8重鏈可變區的第55位胺基酸殘基(自然順序編號)由d突變為e，將p8輕鏈可變區的第34位胺基酸殘基(自然順序編號)由g突變為v，得到新的抗體分子p8b，p8b的胺基酸序列如下：
[0326]
》p8b重鏈可變區序列：
[0327][0328]
》p8b輕鏈可變區序列：
[0329][0330]
備註：序列中下劃線部分為根據kabat編號系統確定的cdr序列，斜體為fr序列。
[0331]
表2.抗angptl3抗體分子的cdr序列
[0332]
[0333][0334]
三、抗angptl3抗體的構建和表達
[0335]
設計引物pcr搭建抗體vh/vk基因片段，再與表達載體phr(帶信號肽及恆定區基因(ch1-fc/cl)片段)進行同源重組，構建抗體全長表達載體vh-ch1-fc-phr/vk-cl-phr。抗體的重鏈恆定區可選自人igg1、igg2、igg4及其變體的恆定區，輕鏈恆定區可選自人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。示例性的，抗體重鏈恆定區選自序列如seq id no：29所示的人igg4-yte變體，輕鏈恆定區選自序列如seq id no：30所示的人κ鏈的恆定區。
[0336]
人igg4-yte變體重鏈恆定區序列：
[0337]
astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0338]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no：29
[0339]
人κ鏈輕鏈恆定區序列：
[0340]
rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0341]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no：30
[0342]
示例性地，上述輕鏈/重鏈恆定區與前述p3、p8、p8b的可變區組合形成完整的抗angptl3抗體：p3g、p8g、p8bg，抗體的輕鏈/重鏈序列如下：
[0343]
》p3g重鏈序列：
[0344][0345]
》p3g輕鏈序列：
[0346][0347]
》p8g重鏈序列：
[0348][0349][0350]
》p8g輕鏈序列：
[0351][0352]
》p8bg重鏈序列：
[0353][0354]
》p8bg輕鏈序列：
[0355][0356]
實施例1.4抗angptl3抗體結合angptl3蛋白的elisa實驗
[0357]
抗angptl3抗體通過與angptl3蛋白結合來抑制或者幹擾angptl3蛋白的至少一種活性。用elisa實驗檢測抗angptl3抗體與angptl3抗原的結合活性。angptl3蛋白(人angptl3(17-170)-mfc)通過與包被在酶標板中的羊抗鼠igg結合從而固定到96孔酶標板中，根據抗體加入後信號的強弱判斷抗體和angptl3的結合活性。同時用生物素標記試劑盒(東仁化學，lk03)標記的帶his標籤的angptl3蛋白(小鼠angptl3(17-455)-his、食蟹猴angptl3(17-460)-his、大鼠angptl3(17-455)-his)通過與包被在酶標板中的鏈黴親和素結合從而固定到96孔酶標板中，根據抗體加入後信號的強弱判斷抗體和angptl3的結合活性。
[0358]
用ph7.4的pbs(上海源培,b320)緩衝液將羊抗鼠igg(sigma,m3534-1ml)稀釋至2μg/ml濃度，以50μl/孔的體積加入96孔酶標板(corning,cls3590-100ea)中，於37℃孵育箱中放置3小時或4℃放置過夜(16-18小時)。棄去液體後，加入用pbs稀釋的5％脫脂牛奶(bd，232100)封閉液250μl/孔，37℃孵育箱孵育3小時或4℃放置過夜(16-18小時)進行封閉。封
閉結束後，棄去封閉液，並用pbst緩衝液(ph7.4pbs含0.05％吐溫-20)洗板3次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液(ph7.4pbs含1％bsa)稀釋至0.5μg/ml人angptl3(17-170)-mfc(序列如seq id no：3)置37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後，棄去酶標板中的反應液，用pbst洗板3次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體，放於37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後用pbst洗板3次，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的羊抗人二抗(jackson immuno research,109-035-003)，37℃孵育1小時。用pbst洗板3次後，加入50μl/孔tmb顯色底物(kpl,52-00-03)，於室溫孵育2-5分鐘(min)，加入50μl/孔1mh2so4終止反應，用versamax酶標儀在450nm處讀取吸收值，計算抗angptl3抗體對angptl3抗原蛋白的結合的ec50值。實驗結果見表3。
[0359]
用ph7.4的pbs(上海源培,b320)緩衝液將鏈黴親和素(sigma,s4762-5mg)稀釋至3μg/ml濃度，以50μl/孔的體積加入96孔酶標板(corning,cls3590-100ea)中，於37℃孵育箱中放置3小時或4℃放置過夜(16-18小時)。棄去液體後，加入用pbs稀釋的5％脫脂牛奶(bd，232100)封閉液250μl/孔，37℃孵育箱孵育3小時或4℃放置過夜(16-18小時)進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用pbst緩衝液(ph7.4pbs含0.05％吐溫-20)洗板3次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液(ph7.4pbs含1％bsa)稀釋至0.5μg/ml的生物素標記的小鼠angptl3(17-455)-his(序列如seq id no：5)、食蟹猴angptl3(17-460)-his(序列如seq id no：7)、大鼠angptl3(17-455)-his(序列如seq id no：8)，置37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後，棄去酶標板中的反應液，用pbst洗板3次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體，放於37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後用pbst洗板3次，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的hrp標記的羊抗鼠二抗(jackson immuno research,115-035-003)或者是羊抗人二抗(jackson immuno research,109-035-003)或者小鼠hrp/抗m13偶聯的二抗(義翹神州，cat no.11973-mm05-100，用於噬菌體篩選)，37℃孵育1小時。用pbst洗板3次後，加入50μl/孔tmb顯色底物(kpl,52-00-03)，於室溫孵育2-5分鐘(min)，加入50μl/孔1mh2so4終止反應，用versamax酶標儀在450nm處讀取吸收值，計算抗angptl3抗體對angptl3抗原蛋白的結合的ec50值。實驗結果見表3，實驗結果顯示，本披露的抗angptl3抗體能夠結合不同種屬的angptl3蛋白。
[0360]
表3.抗angptl3抗體與不同種屬angptl3蛋白結合elisa實驗
[0361][0362]
實施例1.5抗angptl3抗體與angptl3抗原蛋白的htrf結合實驗
[0363]
htrf實驗同樣被用來檢測抗angptl3抗體與抗原的結合活性。用生物素標記試劑盒(東仁化學，lk03)標記的帶his標籤的angptl3(人angptl3(17-460)-his，小鼠angptl3(17-455)-his，食蟹猴angptl3(17-460)-his,大鼠angptl3(17-455)-his)與htrf試劑streptavidin-tb cryptata(cisbio，610satla)結合，抗體加入後，抗體會分別與htrf試劑
pab抗小鼠igg-xl665(cisbio，61pamxla)以及血管生成素樣蛋白3結合，信號的強弱被用於判斷抗體和血管生成素樣蛋白3的結合活性。
[0364]
用稀釋液(ph7.4pbs含1％bsa)配置4μg/ml的生物素標記的人angptl3(17-460)-his(序列如seq id no：1所示)，小鼠angptl3(17-455)-his(序列如seq id no：5所示)，食蟹猴angptl3(17-460)-his(序列如seq id no：7所示)，大鼠angptl3(17-455)-his(序列如seq id no：8所示)，5μl/孔加入到384孔板中(perkinelmer，optiplate-384)，然後加入5μl/孔的htrf試劑streptavidin-tb cryptata以及pab抗鼠igg-xl665的混合液，最後加入10μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體，放在25℃孵育1小時。用pherastar fs(bmg labtech)在htrf模塊讀取數值，計算抗angptl3抗體對血管生成素樣蛋白3的結合ec50值。實驗結果見表4，實施結果表明，本披露的抗體對人、小鼠、食蟹猴、大鼠等種屬的angptl3抗原均具有良好的結合活性。
[0365]
表4.抗angptl3抗體與angptl3蛋白的htrf結合實驗
[0366][0367][0368]
實施例1.6抗angptl3抗體抑制lpl的酶活實驗
[0369]
lpl的酶活檢測實驗用來檢測抗angptl3抗體阻斷angptl3蛋白對lpl酶抑制作用的活性。
[0370]
用稀釋緩衝液(ph7.4pbs+2mg/ml bsa)稀釋牛lpl(sigma,l2254-5ku)到12.5單位,25μl/孔加入到96孔板中(corning，3603)，然後加入25μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體，再加入25μl/孔濃度為27.6μg/ml的angptl3蛋白(人angptl3(17-170)-flag-his(序列如seq id no：2)、小鼠angptl3(17-455)-his(序列如seq id no：5)、食蟹猴angptl3(17-460)-his(序列如seq id no：7)、大鼠angptl3(17-455)-his(序列如seq id no：8)，將96孔板在振蕩器上振蕩混勻，37℃培養箱中孵育30min。最後加入25μl/孔用稀釋緩衝液稀釋的20μm的底物(sigma,30058-10mg-f)，將96孔板在振蕩器上振蕩混勻，37℃培養箱中孵育30min。在flexstation3酶標儀以ex535/em612讀數。用graphpad prism 5軟體處理濃度和對應螢光值數據，並計算ic50。實驗結果見表5，實施結果表明，本披露的抗體具有良好的lpl酶抑制作用。
[0371]
表5.抗angptl3抗體阻斷不同種屬angptl3抑制lpl的活性實驗結果
[0372][0373]
實施例1.7抗angptl3抗體與angptl3蛋白的biacore檢測實驗
[0374]
用biacore測定待測抗angptl3抗體和人、猴、大鼠及小鼠angptl3的親和力。方法如下：
[0375]
分別用protein a生物傳感晶片(cat.#29127556,ge)親和捕獲一定量的待測抗體，然後於晶片表面流經一定濃度的人、猴、大鼠及小鼠的angptl3抗原(人-angptl3(rd，3829-an)、小鼠angptl3(17-455)-his(序列如seq id no：5)、食蟹猴angptl3(17-460)-his(序列如seq id no：7)、大鼠angptl3(17-455)-his(序列如seq id no：8))。利用biacore t200儀器實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線。在每個循環解離完成後，使用ph1.5的甘氨酸-鹽酸再生溶液(cat.#br-1003-54,ge)將生物晶片洗淨再生。試驗運行緩衝液為1
×
hbs-ep緩衝溶液(cat.#br-1001-88，ge)。試驗得到的數據用ge biacore t200評估軟體3.0版本以(1:1)langmuir模型進行擬合，得出親和力數值。實驗結果見表6，實驗結果表明，本披露的抗angptl3抗體能與人、食蟹猴、大鼠及小鼠的angptl3抗原以高親和力結合。
[0376]
表6.抗angptl3抗體與angptl3蛋白的biacore檢測實驗結果
[0377][0378]
實施例1.8抗angptl3抗體大鼠體內藥效評價
[0379]
一、p8bg抗體在大鼠體內降脂實驗
[0380]
實驗用sd大鼠於實驗室環境適應性飼養1周(4周齡sd大鼠，spf，100g左右，雄性，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。合格證號：20170005013017，scxk(滬)2017-0005)，給予12/12小時光/暗周期調節，溫度23
±
1℃，溼度40～50％，動物均給予標準滅菌鼠飼料，自由進食飲水。在實驗開始前7天，動物禁食4h後眼眶採血，3500rpm離心15min，取血清。利用advia 2400化學系統(siemens)測定血清脂質濃度(甘油三酯)。將大鼠按甘油三酯水平分6組(非相關同型人igg蛋白(higg，以下同)作為陰性對照組、evinacumab(序列結構參見who drug information,vol.29,no.3,2015中的evinacumab序列)3.5mpk組、evinacumab7mpk組、p8bg3.5mpk組、p8bg1.75mpk組、p8bg7mpk組)，每組6隻大鼠，皮下注射給藥一次，於注射後第1天、第5天、第9天、第13天和第16天將各組大鼠禁食4小時後採血分離血清，用advia 2400化學系統(siemens)測定血清脂質濃度(甘油三酯)。實驗數據表示為平均值
±
標準差(mean
±
sem)，並graphpad prism5軟體作圖，採用ttest進行統計學分析。
[0381]
實驗結果見圖1及表7所示，與陰性對照組相比，給藥1天後，各治療組甘油三酯均下降，除了evinacumab3.5 mpk組，其餘各組均有統計差異，實驗過程中，p8bg7 mpk組的甘油三酯最大下降83.7％，p8bg3.5 mpk組甘油三酯最大下降81.8％，p8bg1.75 mpk組甘油三酯最大下降68.7％；給藥5天後，p8bg3.5mpk組、p8bg1.75mpk組、p8bg7mpk組組甘油三酯下降仍有統計差異，而evinacumab3.5mpk組、evinacumab7mpk組無統計差異；給藥9天後，p8bg7 mpk組和p8bg3.5 mpk組仍有統計差異。這說明，同一劑量下p8bg比evinacumab的降甘油三酯效果更好也更為持久。而且實驗過程中各組動物體重正常。
[0382]
表7.p8bg抗體對大鼠血清甘油三酯的影響
[0383][0384]
備註：max inh％表示相對於陰性對照組tg的最大降脂百分比，mpk表示mg/kg，
[0385]
二、p3g抗體在大鼠體內降脂實驗
[0386]
實驗用sd大鼠於實驗室環境適應性飼養1周(4周齡sd大鼠，spf，雄性，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。合格證號：20170005013017，scxk(滬)2017-0005)，給予12/12小時光/暗周期調節，溫度23
±
1℃，溼度40～50％，動物均給予標準滅菌鼠飼料，自由進食飲水。在實驗開始前7天，動物禁食4h後眼眶採血，3500rpm離心15min，取血清。利用advia2400化學系統(siemens)測定血清脂質濃度(甘油三酯)。將大鼠按甘油三酯水平分4組(higg陰性對照組、evinacumab3.5mpk組、p3g3.5mpk組、p3g7mpk組)，每組6隻大鼠，皮下注射給藥一次，於注射後第1天、第5天、第9天和第13天將各組大鼠禁食4小時後採血分離血清，用advia2400化學系統(siemens)測定血清脂質濃度(甘油三酯)。實驗數據表示為平均值
±
標準差(mean
±
sem)，並用graphpad prism5軟體作圖，採用ttest進行統計學分析。
[0387]
實驗結果見圖2所示，與higg陰性對照組相比，給藥1天後各組甘油三酯均下降，且p3g3.5mpk組、p3g7mpk組甘油三酯降幅大於evinacumab 3.5mpk組；給藥9天後，p3g3.5mpk組和p3g7mpk組血清脂質濃度仍低於陽性對照。
[0388]
實施例1.9在高脂高膽固醇餵養c57bl/6小鼠中測定抗angptl3抗體對血漿脂質濃度的體內效應
[0389]
c57bl/6小鼠按5隻/籠飼養(4周齡c57bl/6小鼠，spf，16-18g左右，雄性，購自上海卡文斯實驗動物有限責任公司。合格證號：201913812，scxk(蘇)2016-0010)，於實驗室環境適應性飼養4周，給予12/12小時光/暗周期調節，溫度23
±
1℃，溼度40～50％，動物均給予普通飼料餵養，自由進食飲水。預採血5天後將普通飼料換成高脂高膽固醇飼料(d12079b，購自：江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司)餵養小鼠，直到實驗結束。在實驗開始前8天為動物禁食，禁食4小時後眼眶採血，8000rpm離心2min，收集血漿。利用advia2400化學系統(siemens)測定血漿脂質濃度。將小鼠按甘油三酯水平分為4組(higg陰性對照組、evinacumab25mpk組、p8bg25mpk組、p8bg5mpk組)，每組11隻，皮下給藥，每周注射一次，共給
藥8次。於實驗開始後第2周，3周，5周，7周，9周，10周和11周時，將各組小鼠禁食4小時後眼眶採血並收集血漿。利用advia2400化學系統(siemens)測定血漿脂質濃度(甘油三酯(tg)、總膽固醇(tc)以及ldl膽固醇(ldl-c))。實驗數據表示為平均值
±
標準差(mean
±
sem)，並用graphpad prism5軟體作圖，採用ttest進行統計學分析。
[0390]
實驗結果見表8至表10和圖3-5所示，與higg陰性對照組相比，實驗第2周、3周、5周及7周後p8bg 25 mpk組的tg、tc及ldl-c均顯著下降；evinacumab25 mpk及p8bg5 mpk組在實驗3周，5周及7周後tg、tc及ldl-c下降。實驗9周後，與higg陰性對照組相比，只有p8bg25 mpk和p8bg5 mpk兩組甘油三酯顯著下降。與evinacumab25 mpk組相比，實驗第2周，第3周，第9周，p8bg25 mpk組的甘油三酯及總膽固醇均顯著下降；與evinacumab25 mpk組相比，實驗第2周、第9周，p8bg25 mpk組的ldl-c顯著下降。在第一至第11周的整個實驗周期中，evinacumab25 mpk組tg最低降至40.5
±
2.3，與開始tg相比下降了32.60％；而p8bg25 mpk組tg最低降至21.1
±
1.3，與開始tg相比下降了64.90％。這說明，p8bg抗體比evinacumab的降血脂效果更為有效且持久。
[0391]
表8.抗angptl3抗體對c57bl/6小鼠血漿tg的影響
[0392][0393]
備註：max inh％表示相對於開始tg的最大降脂百分比
[0394]
表9.抗angptl3抗體對c57bl/6小鼠血漿ldl的影響
[0395][0396]
備註：max inh％表示相對於陰性對照組ldl的最大降脂百分比
[0397]
表10.抗angptl3抗體對c57bl/6小鼠血漿tc的影響
[0398][0399]
備註：max inh％表示相對於陰性對照組tc的最大降脂百分比
[0400]
實施例1.10.在apoe小鼠中測定抗angptl3抗體對血漿脂質濃度的體內效應
[0401]
apoe小鼠按2隻/籠飼養(8周齡apoe小鼠，spf，22g左右，雄性，購自上海卡文斯實驗動物有限責任公司。合格證號：201917260，scxk(蘇)2016-0010)，於實驗室環境適應性飼養4周，給予12/12小時光/暗周期調節，溫度23
±
1℃，溼度40～50％，動物均給予高脂飼料(d12108c)餵養，自由進食飲水。在實驗開始前7天為動物禁食，禁食4小時(h)後眼眶採血，
8000rpm離心2分鐘(min)，收集血漿。利用advia 2400化學系統(siemens)測定血漿脂質濃度。將小鼠按甘油三酯水平分為5組(higg陰性對照組、evinacumab10mpk組、evinacumab5mpk組、p8bg10mpk組、p8bg5mpk組)，每組8隻，分別皮下注射給藥一次(各組給藥劑量見表11)，給藥後的第1天(d)、第7天及第11天分別將各組小鼠禁食4小時後眼眶採血，收集血漿，利用advia2400化學系統(siemens)測定血漿脂質濃度(甘油三酯、hdl膽固醇)。實驗數據表示為平均值
±
標準差(mean
±
sem)，並用graphpad prism5軟體作圖，採用ttest進行統計學分析。
[0402]
本次實驗結果見圖6、7和表11所示，與higg陰性對照組相比，給藥1d後，各治療組甘油三酯均下降，evinacumab(10mpk)組甘油三酯最低降至65.6
±
5.4mg/dl，與開始tg值相比下降了46.2％，evinacumab(5mpk)組甘油三酯最低降至71.8
±
3.3mg/dl，與開始tg值相比下降了42.1％，p8bg(10mpk)組甘油三酯最低降至33.3
±
2.2mg/dl，與開始tg值相比下降了72.9％，p8bg(5mpk)組甘油三酯最低降至37.0
±
1.7mg/dl，與開始tg值相比下降了70.2％。另外，實驗結果顯示，給藥1天後p8bg10mpk組的血漿hdl-c有所升高，evinacumab10mpk組血漿hdl-c下降，而在降脂實驗中，通常並不希望降脂的同時引起hdl-c的下降。
[0403]
表11.抗angptl3抗體對apoe小鼠血漿甘油三酯的影響
[0404][0405][0406]
備註：max inh％表示相對於開始tg的最大降脂百分比
[0407]
實施例1.10p8bg的變體
[0408]
將p8bg的重鏈可變區第78位(依照kabat編號系統確定)胺基酸殘基由m突變為a(也即m78a)，輕鏈和p8bg相同，獲得p8bg的變體p8bg1，其可變區序列如下：
[0409]
》p8bg1輕鏈可變區序列(同p8bg輕鏈可變區序列)；
[0410]
》p8bg1重鏈可變區序列(seq id no：37)；
[0411][0412]
實施例2.特異性結合pcsk9的抗原結合分子
[0413]
特異性結合pcsk9的分子可以來源於任意適宜的抗體，包括來源於wo2018090972申請文本(通過援引完整收入本文)中所述的抗pcsk9抗體，例如，h001-4-yte抗體(本披露簡稱k0)。特異性結合pcsk9的分子也包括k0突變抗體，其通過對k0抗體可變區的個別胺基酸殘基進行改造而獲得。
[0414]
》k0重鏈的胺基酸序列(seq id no：38):
[0415]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarqydydedwyfdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0416]
》k0輕鏈的胺基酸序列(seq id no：39):
[0417]
divmsqspsslsasvgdrvtitckssqsllnsrtrknflawyqqkpgkspklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyckqsfnlftfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0418]
》k-vh0(k0重鏈可變區)的胺基酸序列(seq id no：40):
[0419]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarqydydedwyfdvwgqgttvtvss
[0420]
》k-vl0(k0輕鏈可變區)的胺基酸序列(seq id no：41)
[0421]
divmsqspsslsasvgdrvtitckssqsllnsrtrknflawyqqkpgkspklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyckqsfnlftfgqgtkleik
[0422]
k0改造抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區：
[0423]
》k-vh1的胺基酸序列(seq id no：42)
[0424]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarqydydeewyfdvwgqgttvtvss
[0425]
》k-vh2的胺基酸序列(seq id no：43)
[0426][0427]
》k-vh3的胺基酸序列(seq id no：44)
[0428][0429]
》k-vh4的胺基酸序列(seq id no：45)
[0430][0431]
》k-vh5的胺基酸序列(seq id no：46)
[0432][0433]
》k-vh6的胺基酸序列(seq id no：47)
[0434][0435]
》k-vh7的胺基酸序列(seq id no：48)
[0436][0437]
》k-vh8的胺基酸序列(seq id no：49)
[0438][0439]
》k-vh9的胺基酸序列(seq id no：50)
[0440][0441]
》k-vl1的胺基酸序列(seq id no：51)
[0442][0443]
》k-vl2的胺基酸序列(seq id no：52)
[0444][0445]
》k-vl3的胺基酸序列(seq id no：53)
[0446][0447]
》k-vl4的胺基酸序列(seq id no：54)
[0448][0449]
》k-vl5的胺基酸序列(seq id no：55)
[0450][0451]
》k-vl6的胺基酸序列(seq id no：56)
[0452][0453]
》k-vl7的胺基酸序列(seq id no：57)
[0454][0455]
備註，上述序列中，依次為fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4，下劃線部分為cdr區(依照kabat編號系統確定)，斜體部分為突變的胺基酸殘基，無下劃線部分為框架區。
[0456]
表13.重鏈cdr序列表
[0457][0458]
備註：表中cdr為依照kabat編號系統確定的cdr
[0459]
表14.輕鏈cdr序列表
[0460][0461][0462]
備註：表中cdr為依照kabat編號系統確定的cdr
[0463]
》k-vh通式的胺基酸序列(seq id no：216):
[0464]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsx3dtavyycarqydy x1ex2wyfdvwgqgttvtvss，
[0465]
其中，x1為d、h或n，x2為d、e、h、m或q，x3為d或e；
[0466]
》k-vl通式的胺基酸序列(seq id no：217)
[0467]
dx5vmsqspsslsasvgdrvtitckssqsllx4srtrknflawyqqkpgkspklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpex6x7atyyckqsfnlftfgqgtkleik，
[0468]
其中，x4為n、q、s或t，x5為i或v，x6為d或e，x7為f、i或v；
[0469]
》k-hcdr3通式的胺基酸序列(seq id no：218)：qydy x1ex2wyfdv，其中，x1為d、h或n，x2為d、e、h、m或q；
[0470]
》k-lcdr1通式的胺基酸序列(seq id no：219)：kssqsllx4srtrknfla，其中，x4為n、q、s或t。
[0471]
實施例3.含有titin-t鏈/obscurin鏈的抗原結合分子
[0472]
本披露的titin鏈/obscurin鏈可以來源於任意適宜的多肽，包括來源於pct/cn2021/070832及其公開文本(wo2021139758a1，通過援引完整收入本文)中以及cn202110527339.7及將其作為優先權文件的專利中的多肽。本實施例3中構建雙特異性抗體，其中cl為pct/cn2021/070832中的kappa輕鏈恆定區，titin鏈和obscurin鏈的胺基酸序列見表15-1和表15-2，連接子序列包括ggggs(seq id no：213)、astkg(seq id no：214)或rtvas(seq id no：215)，本實施例3中的fc1、fc2、ch1的胺基酸序列如下所示。
[0473]
表15-1.titin鏈的胺基酸序列
[0474][0475][0476]
表15-2.obscurin鏈的胺基酸序列
[0477]
[0478]
[0479][0480]
》實施例3-fc1(knob，seq id no：133)
[0481]
dkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppcreemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0482]
》實施例3-fc2(hole，seq id no：134)
[0483]
dkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvctlppsreemtknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk；
[0484]
》實施例3-ch1(seq id no：135)
[0485]
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvv
tvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepksc
[0486]
3.1di雙特異性抗體
[0487]
參照pct/cn2021/070832的實施例5，構建抗hngf和hrankl的di雙特異性抗體：di-2至di-20，其包含如下所述的第一重鏈、第二重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈：
[0488]
第一重鏈：從n端到c端依次為：[vh1-i]-[連接子1]-[obscurin鏈]-[fc2]，
[0489]
第一輕鏈：從n端到c端依次為：[vl1-i]-[連接子2]-[titin鏈]，
[0490]
第二重鏈：從n端到c端依次為：[vh2-d]-[ch1]-[fc1]，和
[0491]
第二輕鏈：從n端到c端依次為：[vl2-d]-[cl]；
[0492]
其中，vh1-i和vl1-i分別為pct/cn2021/070832中i0的重鏈可變區和輕鏈可變區，vh2-d和vl2-d分別為pct/cn2021/070832中d0的重鏈可變區和輕鏈可變區。本實施例中di雙特異性抗體中obscurin-o鏈、titin-t鏈、連接子1、連接子2結構見下表16。
[0493]
表16.di雙特異性抗體中obscurin-o鏈/titin-t鏈和連接子對應表
[0494][0495][0496]
註：表格中titin鏈和obscurin鏈的編號見表15-1和表15-2。
[0497]
採用pct/cn2021/070832的測試例4中的方法檢測di-2至di-20雙特異性抗體與其抗原的結合活性。對抗體進行熱穩定性研究。研究方法：用pbs將抗體的濃度稀釋至5mg/ml，採用高通量微分掃描螢光儀(unchained，規格型號：unit)測定其熱穩定性(上樣量9μl；參數設置：start temp 20℃；incubation 0s；rate 0.3℃/min；plate hold 5s；end temp 95
℃)。實驗結果表明，改造後的雙特異性抗體對抗原的結合活性沒有顯著變化；並且，與di-2相比，di-4至di-8、di-10至di-16、di-20的tm1(℃)、tonset(℃)有明顯的提升，雙特異性抗體的熱穩定性更優。
[0498]
表17.di雙特異性抗體的結合活性檢測
[0499][0500]
表18.di雙特異性抗體的熱穩定性實驗結果
[0501]
編號tm1(℃)tonset(℃)編號tm1(℃)tonset(℃)di-255.648.3di-1157.35-di-460.152.493di-1259.951.726di-56151.967di-136150.988di-660.853.012di-1461.252.191di-760.3452.003di-1560.4150.558di-860.6150.425di-1661.550.691di-1060.252.766di-2060.751.859
[0502]
採用10mm乙酸，ph5.5，9％蔗糖的緩衝液配製含di雙特異性抗體的溶液，將溶液置於40℃恆溫箱中孵育四周，結束後將抗體濃度濃縮至孵育開始時濃度，觀察溶液沉澱情況。實驗結果表明，di-2雙特異性抗體組溶液出現沉澱，di-3至di-7相比di-2具有更好的穩定性。
[0503]
表19.di雙特異性抗體的沉澱
[0504][0505]
3.2 pl雙特異性抗體
[0506]
構建抗hpdl1和hctla4的pl雙特異性抗體：pl-1至pl-19，其包含如下所述的第一重鏈、第二重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈：
[0507]
第一重鏈：從n端到c端依次為：[vh1-p]-[連接子1]-[obscurin鏈]-[fc1]，
[0508]
第一輕鏈：從n端到c端依次為：[vl1-p]-[連接子2]-[titin鏈]，
[0509]
第二重鏈：從n端到c端依次為：[vh2-l]-[ch1]-[fc2]，和
[0510]
第二輕鏈：從n端到c端依次為：[vl2-l]-[cl]；
[0511]
其中，vh1-p和vl1-p分別為wo2020177733a1中h1831k抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，vh1-l和vl1-l的胺基酸序列如下所示。
[0512]
》h1831k抗體的重鏈可變區vh2-l(seq id no：136)
[0513]
qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssytmhwvrqapgkglewvtfisydgnnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtaiyycartgwlgpfdywgqgtlvtvss
[0514]
》h1831k抗體的輕鏈可變區vl2-l(seq id no：137)
[0515]
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvgssylawyqqkpgqaprlliygafsratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspwtfgqgtkveik
[0516]
本實施例中pl雙特異性抗體中obscurin-o鏈、titin-t鏈、連接子1、連接子2結構見下表。
[0517]
表20.pl雙特異性抗體中obscurin-o鏈/titin-t鏈和連接子對應表
[0518]
[0519][0520]
註：表格中titin鏈和obscurin鏈的編號見表15-1和表15-2。
[0521]
參照pct/cn2021/070832中測試例4中的elisa方法檢測pl雙特異性抗體的結合活性，其中hpdl1、hctla4抗原購自：sino biology。對抗體進行熱穩定性研究。方法：用pbs將抗體的濃度稀釋至1.4-3mg/ml，採用高通量微分掃描螢光儀(unchained，規格型號：unit)測定其熱穩定性(上樣量9μl；參數設置：start temp 20℃；incubation 0s；rate 0.3℃/min；plate hold 5s；end temp 95℃)。實驗結果表明，pl雙特異性抗體對抗原仍具有良好的結合活性；並且，與pl-1相比，pl-2至pl-19的tm1(℃)、tagg 266(℃)、tonset(℃)有明顯的提升，雙特異性抗體的熱穩定性更優。
[0522]
表21.pl雙特異性抗體的結合活性檢測
[0523][0524]
表22.pl雙特異性抗體的熱穩定性實驗結果
[0525]
[0526][0527]
3.3 hj雙特異性抗體
[0528]
構建抗hil5和htslp的hj雙特異性抗體：hj-3至hj11，其包含如下所述的第一重鏈、第二重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈：
[0529]
第一重鏈：從n端到c端依次為：[vh1-h]-[連接子1]-[titin鏈]-[fc1]，
[0530]
第一輕鏈：從n端到c端依次為：[vl1-h]-[連接子2]-[obscurin鏈]，
[0531]
第二重鏈：從n端到c端依次為：[vh2-j]-[ch1]-[fc2]，和
[0532]
第二輕鏈：從n端到c端依次為：[vl2-j]-[cl]；
[0533]
其中，vh1-h和vl1-h分別為pct/cn2021/070832中h0的重鏈可變區和輕鏈可變區，vh2-j和vl2-j分別為pct/cn2021/070832中j1的重鏈可變區和輕鏈可變區。本實施例中hj雙特異性抗體中obscurin-o鏈、titin-t鏈、連接子1、連接子2結構見下表。
[0534]
表23.hj雙特異性抗體中obscurin-o鏈/titin-t鏈和連接子對應表
[0535][0536]
參照pct/cn2021/070832中測試例4中的方法檢測hj雙特異性抗體的抗原結合活性。對抗體的熱穩定性進行研究，方法：用10mm乙酸ph5.5、9％蔗糖的緩衝液配製hj雙特異性抗體稀釋溶液，然後通過超濾濃縮的方法將雙特異性抗體濃縮，獲得不同濃度的hj雙特異性抗體溶液(hj雙特異性抗體的濃度見表19)，然後將濃縮溶液置於40℃恆溫箱中孵育，第0天(也即40℃孵育開始前，d0)，第7天(40℃孵育第7天，d7)，第14天(40℃孵育第14天，d14)，第21天(40℃孵育第21天，d21)和第28天(40℃孵育第28天，d28)檢測樣品的sec純度，40℃孵育28天後，馬上取樣檢測樣品ce-sds純度。實驗結果表明，本披露構建的hj雙特異性抗體對抗原的結合活性沒有顯著變化；並且，與hj-3相比，hj-5至hj-11雙特異性抗體的熱
穩定性更優。
[0537]
表24.hj雙特異性抗體的結合活性檢測
[0538][0539]
表25.hj雙特異性抗體加速穩定性實驗結果
[0540][0541]
實施例4.特異性結合angptl3和pcsk9的雙特異性抗體製備
[0542]
示範性地，利用本披露實施例1的特異性結angptl3的分子的可變區、實施例1的特異性結合pcsk9的分子的可變區、人igg1或igg4重鏈恆定區、人κ鏈輕恆定區以及實施例3的titin鏈/obscurin鏈構建特異性結合angptl3和pcsk9的雙特異性抗原結合分子。構建的特異性結合angptl3和pcsk9的雙特異性抗體具有format2.1(結構示意圖見附圖10a)、format2.2(結構示意圖見附圖10b)、format2.3(結構示意圖見附圖10c)、format2.4(結構示意圖見附圖10d)、format5.1(結構示意圖見附圖10e)、format5.2(結構示意圖見附圖10f)的結構、format5.3(結構示意圖見附圖10g)或format5.4(結構示意圖見附圖10h)的結構，其中，
[0543]
format2.1包含如下結構的2條鏈，其中：
[0544]
鏈1為：vh(抗angptl3抗體)-連接子1-vl(抗angptl3抗體)-連接子2-vh(抗pcsk9抗體)-igg(ch1)-iggfc，
[0545]
鏈2為：vl(抗pcsk9抗體)-cl；
[0546]
format2.2包含如下結構的2條鏈，其中：
[0547]
鏈1為：vl(抗angptl3抗體)-連接子1-vh(抗angptl3抗體)-連接子2-vh(抗pcsk9抗體)-igg(ch1)-iggfc，
[0548]
鏈2為：vl(抗pcsk9抗體)-cl；
[0549]
format2.3包含如下結構的2條鏈，其中：
[0550]
鏈1為：vh(抗pcsk9抗體)-連接子1-vl(抗pcsk9抗體)-連接子2-vh(抗angptl3抗體)-igg(ch1)-iggfc，
[0551]
鏈2為：vl(抗angptl3抗體)-cl；
[0552]
format2.4包含如下結構的2條鏈，其中：
[0553]
鏈1為：vl(抗pcsk9抗體)-連接子1-vh(抗pcsk9抗體)-連接子2-vh(抗angptl3抗體)-igg(ch1)-iggfc，
[0554]
鏈2為：vl(抗angptl3抗體)-cl，
[0555]
format5.1包含如下結構的4條鏈，其中：
[0556]
鏈1為：vh(抗angptl3抗體)-連接子1-titin鏈-iggfc2，
[0557]
鏈2為：vh(抗pcsk9抗體)-igg(ch1)-iggfc1，
[0558]
鏈3為：vl(抗angptl3抗體)-連接子2-obscurin鏈，
[0559]
鏈4為：vl(抗pcsk9抗體)-cl；
[0560]
format5.2包含如下結構的4條鏈，其中：
[0561]
鏈1為：vh(抗angptl3抗體)-連接子1-obscurin鏈-iggfc2，
[0562]
鏈2為：vh(抗pcsk9抗體)-igg(ch1)-iggfc1，
[0563]
鏈3為：vl(抗angptl3抗體)-連接子2-titin鏈，
[0564]
鏈4為：vl(抗pcsk9抗體)-cl；
[0565]
format5.3包含如下結構的4條鏈，其中：
[0566]
鏈1為：vh(抗pcsk9抗體)-連接子1-titin鏈-iggfc2，
[0567]
鏈2為：vh(抗angptl3抗體)-igg(ch1)-iggfc1，
[0568]
鏈3為：vl(抗pcsk9抗體)-連接子2-obscurin鏈，
[0569]
鏈4為：vl(抗angptl3抗體)-cl；
[0570]
format5.4包含如下結構的4條鏈，其中：
[0571]
鏈1為：vh(抗pcsk9抗體)-連接子1-obscurin鏈-iggfc2，
[0572]
鏈2為：vh(抗angptl3抗體)-igg(ch1)-iggfc1，
[0573]
鏈3為：vl(抗pcsk9抗體)-連接子2-titin鏈，
[0574]
鏈4為：vl(抗angptl3抗體)-cl；
[0575]
iggfc1/iggfc2為igg1的fc的igg1fc(knob)/igg1fc(hole)2個亞基，其中，
[0576]
》igg1fc(knob)(seq id no：138)
[0577]
dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0578]
》igg1fc(hole)(seq id no：139)
[0579]
dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0580]
》igg1重鏈恆定區(seq id no：220)
[0581]
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0582]
》連接子序列：
[0583]
連接子序列1(seq id no：211)：ggggsggggsggggs
[0584]
連接子序列2(seq id no：212)：ggggsggggs
[0585]
連接子序列3(seq id no：213)：ggggs
[0586]
示例性地，構建了如下表所示的特異性結合angptl3和pcsk9的雙特異性抗原結合分子。
[0587]
表26.本披露的雙特異性抗體
[0588]
[0589]
[0590][0591]
特異性結合angptl3和pcsk9的雙特異性抗原結合分子的各條鏈胺基酸序列如下：
[0592]
》ap-2-1-h1(seq id no：140)
[0593]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarqydydedwyfdvwgqgttvtvssggggsggggsggggsdivmsqspsslsasvgdrvtitckssqsllnsrtrknflawyqqkpgkspklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyckqsfnlftfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqapgqglewvglinpredstsyaqkfqgrvtmtrdtststmymelsslrsedtavyfcardlgsirevlyygmdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0594]
》ap-2-1-l1(seq id no：141)
[0595]
dvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsnvytyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalqtpltfgqgtrleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0596]
》ap-2-2-h1(seq id no：142)
[0597]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqapgqglewvglinpredstsyaqkfqgrvtmtrdtststmymelsslrsedtavyfcardlgsirevlyygmdvwgqgttvtvssggggsggggsggggsdvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsnvytyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalqtpltfgqgtrleikggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywm
hwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarqydydedwyfdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0598]
》ap-2-2-l1(seq id no：143)
[0599]
divmsqspsslsasvgdrvtitckssqsllnsrtrknflawyqqkpgkspklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyckqsfnlftfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0600]
》ap-2-3-h1(seq id no：144)
[0601]
divmsqspsslsasvgdrvtitckssqsllnsrtrknflawyqqkpgkspklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyckqsfnlftfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarqydynedwyfdvwgqgttvtvssggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqapgqglewvglinpredstsyaqkfqgrvtmtrdtststmymelsslrsedtavyfcardlgsirevlyygmdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0602]
》ap-2-4-h1(seq id no：145)
[0603]
divmsqspsslsasvgdrvtitckssqsllnsrtrknflawyqqkpgkspklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyckqsfnlftfgqgtkleikggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarqydynedwyfdvwgqgttvtvssggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqapgqglewvglinpredstsyaqkfqgrvtmtrdtststmymelsslrsedtavyfcardlgsirevlyygmdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0604]
》ap-2-5-h1(seq id no：146)
[0605]
divmsqspsslsasvgdrvtitckssqsllnsrtrknflawyqqkpgkspklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyckqsfnlftfgqgtkleikggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarqydynedwyfdvwgqgttvtvssggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqapgqglewvglinpredstsyaqkfqgrvtmtrdtststmymelsslrsedtavyfcardlgsirevlyygmdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdh
kpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0606]
》ap-2-6-h1(seq id no：147)
[0607]
dvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsnvytyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalqtpltfgqgtrleikggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqapgqglewvglinpredstsyaqkfqgrvtmtrdtststmymelsslrsedtavyfcardlgsirevlyygmdvwgqgttvtvssggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarqydynedwyfdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0608]
》ap-2-7-h1(seq id no：148)
[0609]
dvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsnvytyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalqtpltfgqgtrleikggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqapgqglewvglinpredstsyaqkfqgrvtmtrdtststmymelsslrsedtavyfcardlgsirevlyygmdvwgqgttvtvssggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarqydynedwyfdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0610]
》ap-2-8-h1(seq id no：149)
[0611]
dvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsnvytyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalqtpltfgqgtrleikggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqapgqglewvglinpredstsyaqkfqgrvtmtrdtststmymelsslrsedtavyfcardlgsirevlyygmdvwgqgttvtvssggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarqydynedwyfdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0612]
》ap-2-9-h1(seq id no：150)
[0613]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvt
mtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarqydynedwyfdvwgqgttvtvssggggsggggsdivmsqspsslsasvgdrvtitckssqsllnsrtrknflawyqqkpgkspklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyckqsfnlftfgqgtkleikggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqapgqglewvglinpredstsyaqkfqgrvtmtrdtststmymelsslrsedtavyfcardlgsirevlyygmdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0614]
》ap-2-10-h1(seq id no：151)
[0615]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarqydynedwyfdvwgqgttvtvssggggsdivmsqspsslsasvgdrvtitckssqsllnsrtrknflawyqqkpgkspklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyckqsfnlftfgqgtkleikggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqapgqglewvglinpredstsyaqkfqgrvtmtrdtststmymelsslrsedtavyfcardlgsirevlyygmdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0616]
》ap-2-11-h1(seq id no：152)
[0617]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqapgqglewvglinpredstsyaqkfqgrvtmtrdtststmymelsslrsedtavyfcardlgsirevlyygmdvwgqgttvtvssggggsggggsdvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsnvytyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalqtpltfgqgtrleikggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarqydynedwyfdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0618]
》ap-2-12-h1(seq id no：153)
[0619]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqapgqglewvglinpredstsyaqkfqgrvtmtrdtststmymelsslrsedtavyfcardlgsirevlyygmdvwgqgttvtvssggggsdvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsnvytyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalqtpltfgqgtrleikggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarqydynedwyfdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdg
vevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0620]
》ap-2-13-h1(seq id no：154)
[0621]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarqydynedwyfdvwgqgttvtvssggggsggggsggggsdivmsqspsslsasvgdrvtitckssqsllnsrtrknflawyqqkpgkspklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyckqsfnlftfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqapgqglewvglinpredstsyaqkfqgrvtmtrdtststmymelsslrsedtavyfcardlgsirevlyygmdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0622]
》ap-2-14-h1(seq id no：155)
[0623]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsedtavyycarqydynedwyfdvwgqgttvtvssggggsggggsggggsdivmsqspsslsasvgdrvtitckssqsllnsrtrknflawyqqkpgkspklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyckqsfnlftfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqapgqglewvglinpredstsyaqkfqgrvtmtrdtststmymelsslrsedtavyfcardlgsirevlyygmdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0624]
》ap-2-15-h1(seq id no：156)
[0625]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsedtavyycarqydynedwyfdvwgqgttvtvssggggsggggsggggsdivmsqspsslsasvgdrvtitckssqsllssrtrknflawyqqkpgkspklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyckqsfnlftfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqapgqglewvglinpredstsyaqkfqgrvtmtrdtststmymelsslrsedtavyfcardlgsirevlyygmdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0626]
》ap-2-16-h1(seq id no：157)
[0627]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdywmhwvrqapgqglewmgyinpssgftkyhqnfkdrvtmtrdtsistaymelsrlrsedtavyycarqydynedwyfdvwgqgttvtvssggggsggggsggggsdivmsqspss
lsasvgdrvtitckssqslltsrtrknflawyqqkpgkspklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyckqsfnlftfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqapgqglewvglinpredstsyaqkfqgrvtmtrdtststmymelsslrsedtavyfcardlgsirevlyygmdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0628]
》ap-2-17-h1(seq id no：158)
[0629]
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[0691]
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[0694]
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[0700]
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[0704]
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[0706]
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[0708]
》ap-5-26-h1(seq id no：198)
[0709]
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[0710]
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[0711]
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[0712]
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[0713]
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[0714]
》ap-5-30-h1(seq id no：201)
[0715]
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[0716]
》ap-5-32-h1(seq id no：202)
[0717]
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[0718]
》ap-5-33-h1(seq id no：203)
[0719]
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[0720]
》ap-5-35-h2(seq id no：204)
[0721]
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[0722]
》ap-5-35-l1(seq id no：205)
[0723]
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[0724]
》ap-5-36-h1(seq id no：206)
[0725]
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[0726]
》ap-5-36-l1(seq id no：207)
[0727]
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[0728]
》ap-5-37-h1(seq id no：208)
[0729]
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[0730]
》ap-5-38-h1(seq id no：209)
[0731]
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[0732]
》ap-5-38-l1(seq id no：210)dvvmsqspsslsasvgdrvtitckssqsllnsrtrknflawyqqkpgkspklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyckqsfnlftfgqgtkleikggggsgippkieclpidisidegkvltvasaftgeptpevtwstggrkihsqeqgrfhientddsttltikdvqkqdgglytltlrnefgsdsatvnihirsi測試例
[0733]
測試例1.特異性結合angptl3和pcsk9的雙特異性抗體的親和力檢測
[0734]
本測試例用protein a生物傳感晶片親和捕獲特異性結合angptl3/pcsk9的抗體，然後於晶片表面流經人angptl3(rd systems，貨號3829-an)及人pcsk9(sino biological，貨號10594-h08h1)抗原分子，用biacore t200儀器實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線。在每個實驗循環解離完成後，用10mm glycine-hcl(ph1.5)將生物傳感晶片洗淨再生。數據擬合模型採用1:1model。實驗結果見下表27、28所示：
[0735]
表27.結合人angptl3的親和力檢測結果
[0736][0737][0738]
表28.結合人pcsk9的親和力檢測結果
[0739]
[0740]
實驗結果顯示，本披露構建的特異性結合angptl3和pcsk9的雙特異性抗體能與很好結合人angptl3和pcsk9。
[0741]
測試例2.本披露的雙特異性抗體對lpl酶的活性效應
[0742]
以下方法用來測定angptl3/pcsk9雙特異性抗體對lpl酶的活性效應。
[0743]
實驗方法如下：
[0744]
用稀釋緩衝液(pbs+2mg/ml bsa)稀釋bovine lpl(sigma，l2254-5ku)到125units；用稀釋緩衝液稀釋人angptl3(rd systems，貨號3829-an)至40μg/ml濃度；用稀釋緩衝液稀釋抗體至濃度4000nm，然後3倍梯度稀釋10個濃度，第11個濃度為稀釋緩衝液。分別取已稀釋好的bovine lpl、人angptl3和抗體各25μl加入黑色底透96孔板(corning，3603)中，設置control孔：50μl稀釋緩衝液和25μl的lpl，混勻後在37℃培養箱中孵育30分鐘。用稀釋緩衝液稀釋底物(sigma，30058-10mg-f)至5μm濃度，然後25μl/孔加入實驗板孔中，勻後在37℃培養箱中孵育30分鐘。在酶標儀(bmg labtech，pherastar fs)上讀ex535/em612螢光。測試結果如下表29所示。
[0745]
表29.抗體對lpl酶的活性效應
[0746]
抗體ic50(nm)ap-2-3123.9ap-2-4107.3ap-2-5116.7ap-2-10113.8ap-2-19136.1ap-2-21134.2p8bg187
[0747]
結果顯示，採用本披露特異性結合angptl3和pcsk9的雙特異性抗體具有對lpl酶的活性抑制效應，其能有效阻斷angptl3與lpl酶作用。
[0748]
測試例3.抗體對hepg2細胞攝取ldl的活性
[0749]
以下方法用來測特異性結合angptl3和pcsk9的雙特異性抗體對hepg2細胞攝取ldl活性效應。實驗方法簡述如下：
[0750]
hepg2細胞(atcc，hb-8065)培養在含10％fbs的dmem(ge，sh30243.01)培養基中，一周傳代2～3次，傳代比例1:3或1:6。傳代時，吸掉培養基，用5ml pbs(上海源培生物科技股份有限公司，b320)衝洗細胞層，然後吸掉pbs，加入3ml胰酶(invitrogen，25200-072)，使細胞與胰酶充分接觸後吸掉胰酶，將細胞放在培養箱中消化3～5分鐘，加入新鮮培養基重懸細胞。細胞計數後鋪於黑色透明底96孔細胞培養板(bd，356692)中，1.5
×
104細胞/孔，100μl/孔，在37℃二氧化碳培養箱孵育過夜，然後將培養基換成含10％lipoprotein deficient serum(millipore，lp4)的培養基100μl/孔，在37℃二氧化碳培養箱孵育20個小時。用含10％lipoprotein deficient serum的培養基梯度稀釋抗體，用含10％lipoprotein deficient serum的培養基稀釋人pcsk9(北京義翹神州，29698-h08h)至21μg/ml，然後將抗體和人pcsk9按照1:1的比例混合均勻，在4℃預孵育1個小時。吸掉細胞培養板中的培養基，用pbs洗2遍，加入預孵育好的抗體混合物95μl/孔。同時加入用含10％lipoprotein deficient serum的培養基稀釋至200μg/ml的fl ldl
(invitrogen，l3483)5μl/孔，在37℃二氧化碳培養箱孵育6個小時。吸掉細胞培養板中的培養基，用pbs洗2遍，加入pbs 100μl/孔，用酶標儀(bmg labtech，pherastar fs)讀ex485/em535螢光。測試結果如下表30所示。
[0751]
表30.抗體對hepg2細胞攝取ldl的活性檢測實驗
[0752]
抗體ec50(nm)ap-2-170.53ap-2-365.91ap-2-1079.55ap-2-1380.21ap-2-1459.31ap-2-1939.92ap-2-2142.62ap-5-153.12k0115.6
[0753]
結果顯示，本披露的特異性結合angptl3和pcsk9的雙特異性抗體具有對hepg2細胞攝取ldl的活性。
[0754]
測試例4.angptl3/pcsk9雙特異性抗體在aav-hpcsk9過表達小鼠模型中的藥效
[0755]
為測試本披露抗體在aav-hpcsk9過表達小鼠模型中的藥效，本實驗在過表達人pcsk9的c57bl/6小鼠(購自上海卡文斯實驗動物有限責任公司)中測定抗體分子對小鼠血漿脂質濃度的體內效應。
[0756]
首先將5
×
10
11
v.g.(vector genomes)aav8-hpcsk9病毒尾靜脈注射入c57bl/6小鼠體內，構建過表達人pcsk9的小鼠模型。將小鼠根據血脂四項(tg，tc，hdl-c和ldl-c)平均分組，每組7隻，分別於第0天和第3天皮下注射pbs(空白對照，vehicle)，p8bg 10mpk，k0 10mpk，ap-5-40 20mpk，給藥後第2、4、6、8天眼眶取血，檢測血漿中tg，tc，non-hdl-c和ldl-c濃度。實驗結果見表31及附圖11所示。
[0757]
表31.抗體降低aav-hpcsk9過表達鼠模的tg、tc和non-hdl-c
[0758]
抗體k0 10mpkap-5-40 20mpktg的最大下降％25％35％tc的最大下降％22％25％non-hdl-c的最大下降％31％40％
[0759]
實驗結果顯示，本披露的特異性結合angptl3和pcsk9的雙特異性抗體在aav-hpcsk9過表達小鼠模型中能有效降低tg，tc，non-hdl-c和ldl-c水平。
[0760]
測試例5.angptl3/pcsk9雙特異性抗體在hpcsk9轉基因鼠模型的藥效
[0761]
為測試本披露抗體在hpcsk9轉基因鼠模型的藥效，本實驗在hpcsk9轉基因小鼠(購自上海南方模式生物科技股份有限公司)中測定了抗體對小鼠血脂濃度的體內效應。
[0762]
首先將hpcsk9轉基因小鼠根據血脂四項組(每組7隻)，分別於第0天和第3天皮下給予pbs(空白對照，vehicle)，p8bg 10mpk，k0 10mpk，ap-5-40 20mpk、ap-2-25-13.3mpk。給藥後第2、4、6、8、13天各組小鼠快速禁食4h，眼眶取血，檢測血漿中tg、tc、non-hdl-c和ldl-c濃度。實驗結果如下表32及附圖12、13和14所示。
[0763]
表32.抗體在hpcsk9轉基因鼠模型中ldl-c測定
[0764][0765]
實驗結果顯示，本披露的特異性結合angptl3和pcsk9的雙特異性抗體能有效降低小鼠血脂tg、tc、non-hdl-c和ldl-c濃度，ldl-c最大下降百分比優於單抗。
[0766]
雖然為了清楚的理解，已經藉助於附圖和實例詳細描述了上述發明，但是描述和實例不應當解釋為限制本披露的範圍。本文中引用的所有專利和科學文獻的公開內容通過引用完整地清楚結合。