一株增加農作物產量的菌株及其應用的製作方法

2024-04-15 17:08:05

1.本發明涉及一株菌株及其在農業領域的應用。


背景技術：

2.水稻是我國最主要的糧食經濟作物，同時稻米作為我國第一大主食，也是人體獲取主要營養物質的主要途徑之一。目前，全世界有三分之一的人口遭受鐵等微量元素營養不良，這些人主要分布在以稻米為主食的亞洲發展中國家，而我國所佔的比列相對較大。在我國有三分之一的耕地面積面臨鐵、磷養分的缺乏的問題，鐵、磷營養的缺乏已經成為限制水稻生長、降低水稻產量已成為普遍原因之一。


技術實現要素：

3.本發明提供一株增加農作物產量的菌株及其應用，該菌株具有產鐵載體，解有機磷功能。
4.本發明一株增加農作物產量的菌株為西西布哈加瓦氏菌bhargavaea cecembensis hl-17，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc：24993。
5.本發明上述增加農作物產量的菌株西西布哈加瓦氏菌bhargavaea cecembensis hl-17在農作物種植中的應用。
6.本發明上述增加農作物產量的菌株西西布哈加瓦氏菌bhargavaea cecembensis hl-17在水稻種植中的應用。
7.本發明上述西西布哈加瓦氏菌bhargavaea cecembensis hl-17經革蘭氏染色為革蘭氏陽性菌，需氧，杆狀，tsa(胰酪大豆腖瓊脂)上菌落呈米白色，圓形，表面具有黏性，在tsa、na培養基營養瓊脂、r2a瓊脂培養基上生長情況良好，在la(李斯特氏菌顯色培養基)上生長能力較弱。
8.所述西西布哈加瓦氏菌hl-17接種在cas培養基上，培養一段時間後菌落周圍形成明顯的變色圈，西西布哈加瓦氏菌hl-17的變色圈直徑d為6.18mm，菌落直徑d為1.62mm，d/d為3.82，說明西西布哈加瓦氏菌hl-17具有極強的產鐵載體能力。
9.所述西西布哈加瓦氏菌hl-17接種在蒙金娜有機磷培養基上，培養一段時間後菌落周圍形成明顯的溶有機磷圈，西西布哈加瓦氏菌hl-17的溶無機磷圈直徑d為5.03mm，菌落直徑d為2.97mm，d/d為1.69，說明西西布哈加瓦氏菌hl-17具有較強的解有機磷功能。
10.本發明的西西布哈加瓦氏菌為bhargavaea cecembensis hl-17是從鯉的整條腸道中的內含物分離得到的，該菌株產鐵載體可螯合環境中的鐵離子形成鐵元素，參與葉綠體蛋白和葉綠素的合成，維持葉綠體的穩定，有利於農作物的生長發育。同時該菌株還具有解有機磷能力，可將土壤中植物難以吸收的磷分解為易吸收的磷，改善農作物生長環境，促進植物的生長和增加農作物產量，特別適合水稻種植的應用。
11.本發明西西布哈加瓦氏菌為bhargavaea cecembensis hl-17，保藏在中國微生物
菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為cgmcc：24993，保藏日期是2022年5月30日。
附圖說明
12.圖1為bhargavaea cecembensis hl-17鐵載體篩選結果；
13.圖2為bhargavaea cecembensis hl-17有機磷固體培養基上的解磷圈；
14.圖3為bhargavaea cecembensis hl-17構建的系統發育樹；
15.圖4為bhargavaea cecembensis hl-17水培盒試驗結果。
具體實施方式
16.下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
17.需要說明的是，在不衝突的情況下，本發明中的實施例及實施例中的特徵可以相互組合。
18.具體實施方式一：本實施方式增加農作物產量的菌株為西西布哈加瓦氏菌bhargavaea cecembensis hl-17，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc：24993。
19.一、獲得本實施方式西西布哈加瓦氏菌為bhargavaea cecembensis hl-17的方法：
20.1、實驗材料
21.2021年9月，選取遼寧省盤錦市大窪區水稻田中養殖的鯉魚群體，隨機選擇3尾健康的1齡鯉(150
±
10g)，採用ms-222麻醉劑(250mg/l)麻醉，使用無水乙醇擦拭鯉的表面，在超淨工作檯中用滅菌後的剪刀和鑷子進行解剖，取出鯉的整條腸道，輕輕擠出內含物置於含玻璃珠和50ml無菌水的錐形瓶中，以180r/min的轉速室溫振蕩30min，再進行梯度稀釋，將10-3
、10-4
、10-5
梯度取100μl塗布於lb固體培養基平板上，每個梯度重複3次，置於28℃培養24-48h。培養48h後，選取不同形狀的菌株進行分離。
22.2、細菌產鐵載體的鑑定
23.將已經分離純化的菌株重新活化所獲得的菌株轉接到lb平板上培養24h，再用滅菌的牙籤挑取單菌落接到鉻天青s(chromeazurol s，cas)固體檢測培養基，37℃倒置培養2-3d，觀察菌落周圍變色圈大小。
24.培養一段時間後菌落周圍形成明顯的變色圈的菌株具有產鐵載體的能力。圖1為菌株hl-17的產鐵載體的鑑定結果，其變色圈直徑d為6.18mm，菌落直徑d為1.62mm，d/d為3.82，說明菌株hl-17具有極強的產鐵載體能力。
25.對出現明顯變色圈的菌株hl-17進一步試驗：
26.(1)將活化的菌株hl-17菌苔接種於限鐵sa液體培養基中，37℃搖床培養48h得到hl-17菌液；
27.(2)將生長48h的待測菌株hl-17菌液轉移到已滅菌的10ml離心管中，13000rpm離
心15min，去沉澱留上清；
28.(3)將上清液轉移到經濃鹽酸處理過的試管中，加入一定量現配的cas檢測液使上清液與檢測液的體積比為1:1，充分混勻後室溫靜置1h；
29.(4)測定630nm波長處的吸光度值(a)，取雙蒸水作為對照調零，以同法測定的未接種的sa限鐵培養基與檢測液混合後630nm波長處的吸光度值作為參比值(ar)，並以下式表示鐵載體活性單位：
30.su≈(ar-as)/ar
×
100；
31.式中：su為鐵載體含量；ar為所測未接種的sa限鐵培養基與檢測液上清液的od值；as為所測培養基上清液的od值。
32.鐵載體活性單位小於10，一般認為是陰性的，並且鐵載體與檢測液的混合物無顏色變化。
33.菌株hl-17在37℃時產鐵載體的su值為53％，說明該菌株具有很強的產鐵載體能力。
34.3、菌株hl-17解有機磷能力的鑑定
35.將菌株hl-17用滅菌牙籤分別接種於蒙金娜有機磷細菌培養基的平板上。每個梯度重複3次，置於28℃培養24-48h。菌株hl-17接種在蒙金娜有機磷培養基上，培養一段時間後菌落周圍形成明顯的溶有機磷圈，如圖2所示；採用十字交叉法測量菌落直徑d和溶有機磷圈直徑d，並計算d/d。菌株hl-17的溶無機磷圈直徑d為5.03mm，菌落直徑d為2.97mm，d/d為1.69，說明菌株hl-17具有較強的解有機磷功能。
36.4、菌株hl-17的鑑定
37.4.1菌株hl-17生理生化鑑定：將保藏後的菌株在固體lb培養基平板上三區劃線，分離出單菌落並對其形態進行描述，根據《常用細菌系統鑑定手冊》對菌株進行革蘭氏染色以及生理生化鑑定。
38.鑑定結果：菌株hl-17經革蘭氏染色為革蘭氏陽性菌，需氧，杆狀，tsa(胰酪大豆腖瓊脂)上菌落呈米白色，圓形，表面具有黏性，在tsa、na培養基營養瓊脂、r2a瓊脂培養基上生長情況良好，在la(李斯特氏菌顯色培養基)上生長能力較弱。hl-17的部分生理生化指標見下表。根據《伯傑氏細菌鑑定手冊》對芽孢桿菌屬生理特徵的描述，菌株hl-17生理生化結果如表1所示，菌株hl-17與bhargavaea cecembensis模式種的生理生化具有相同特徵，由各項生理生化推斷菌株hl-17可能為bhargavaea cecembensis。
39.表1菌株hl-17生理生化結果
[0040][0041][0042]
4.2 16s rrna鑑定：選用北京索萊寶生物科技公司的細菌基因組dna提取試劑盒，提取分離純化後的菌株dna。採用細菌通用引物27f/1492r進行pcr擴增，pcr擴增體系為25μl體系：10
×
緩衝液2.5μl，taq酶0.5μl，引物27f 0.5μl，引物1492r 0.5μl，dna模板1μl，ddh2o 20μl。反應程序設定為95℃預變性5min；94℃變性50s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，循環次數30次，72℃再延伸10min，4℃保存。將pcr擴增產物送往ruibiotech公司測序。通過ncbi資料庫比對菌株16s rrna的測序結果，並構建系統進化樹。
[0043]
鑑定結果：對16s rrna序列進行測序後，在ncbi中進行blast比對發現菌株hl-17的16s rrna基因序列與bhargavaea cecembensis相似度為99％。如圖3所示，菌株hl-17的
系統發育樹可以看出菌株hl-17與bhargavaea cecembensis(kc844776.1)同處最小的一個分支，進化距離較近，綜合生理生化指標將菌株hl-17鑑定為bhargavaea cecembensis。
[0044]
5、西西布哈加瓦氏菌bhargavaea cecembensishl-17抗逆性檢測
[0045]
5.1耐酸性能檢測：將西西布哈加瓦氏菌bhargavaea cecembensis hl-17接種到ph為2.0、3.0、4.0的lb液體培養基中，始孢子數為2
×
108cfu/ml，在3h吸取菌液塗板，37℃培養24h後，測定其孢子數，並計算菌株的存活率。
[0046]
西西布哈加瓦氏菌bhargavaea cecembensishl-17耐酸性如表2所示，說明西西布哈加瓦氏菌bhargavaea cecembensishl-17具有優異的耐酸性。
[0047]
5.2耐膽鹽檢測：將西西布哈加瓦氏菌(bhargavaea cecembensis)hl-17吸取1ml菌液(始孢子數為2
×
108cfu/ml)放於滅菌過的平皿內，然後用含0.5％、1.0％和1.5％牛膽酸鈉的lb固體培養基傾注平板，同時用不含牛膽酸鈉的mrs固體培養基作為對照組，37℃培養48h，進行菌落計數，並計算菌株的存活率。
[0048]
西西布哈加瓦氏菌bhargavaea cecembensishl-17耐膽鹽性如表2所示，說明西西布哈加瓦氏菌bhargavaea cecembensishl-17具有優異的耐膽鹽性。
[0049]
表2西西布哈加瓦氏菌hl-17耐酸性和耐膽鹽能力檢測
[0050][0051]
具體實施方式二：本實施方式配製西西布哈加瓦氏菌(bhargavaea cecembensis)hl-17菌液。
[0052]
黃豆芽100g加水1000ml，煮沸1h，過濾後補足水分至1l，121℃溼熱滅菌後存放備用，此即質量分數為10％的豆芽汁。
[0053]
西西布哈加瓦氏菌(bhargavaea cecembensis)hl-17液體培養基由1000ml質量分數為10％豆芽汁、11.57g甘露糖、2.33g酵母膏、1.69g草酸銨和0.96g氯化錳組成。
[0054]
以0.2％的接種量將西西布哈加瓦氏菌(bhargavaea cecembensis)hl-17種子液接種於西西布哈加瓦氏菌(bhargavaea cecembensis)hl-17菌液培養基，30℃、180r/min、培養24h，西西布哈加瓦氏菌(bhargavaea cecembensis)hl-17的活菌數達到1.45
×
109cfu/ml(而西西布哈加瓦氏菌(bhargavaea cecembensis)hl-17種子液活菌數為6.38
×
108cfu/ml，西西布哈加瓦氏菌(bhargavaea cecembensis)hl-17種子液是接種在lb液體培養基中製成)。
[0055]
實施例1水稻萌發實驗
[0056]
按照具體實施方式二的方法製備西西布哈加瓦氏菌(bhargavaea cecembensis)
hl-17的菌液，用無菌水分別稀釋至菌體濃度為1.0
×
104cfu/ml和1.0
×
105cfu/ml，作為菌液。
[0057]
選用水稻lj31作為供試水稻。各處理組分別選取形態飽滿、大小一致的水稻種子，用70％乙醇浸沒種子消毒15min，再用無菌水衝洗三次去除乙醇殘留。消毒後的水稻種子置於100ml錐形瓶中，加入相應的浸種溶液50ml，置於28
±
0.5℃培養箱中浸種2天，再催芽2天後，將發芽一致的種子置於水培盒中，放入植物光照培養箱進行28℃常溫培養14天。
[0058]
設置3組處理：
[0059]
對照組：浸種溶液為無菌水；
[0060]
104組：浸種溶液是菌體濃度為1.0
×
104cfu/ml的西西布哈加瓦氏菌hl-17菌液；
[0061]
105組：浸種溶液是菌體濃度1.0
×
105cfu/ml的西西布哈加瓦氏菌hl-17菌液；
[0062]
其中，晝/夜光照時長12h/12h，光強12000lx，植物光照培養箱內溼度設置為60％。
[0063]
實驗結果：
[0064]
在水培盒培養條件下，各處理的生長情況如圖4所示，104組和105組的水稻生長狀況明顯優於對照組，西西布哈加瓦氏菌hl-17對水稻具有較為明顯的促生長作用，並且促生長效果與菌株hl-17的濃度呈正相關關係。從表3中可以看出，105組根長較104組和對照組分別提升10.57％和34.60％；105組地上部較104組和對照組分別提升21.13％和32.00％；105組鮮重較104組和對照組分別提升15.58％和26.18％；105組乾重較104組和對照組分別提升19.12％和30.90％，進而說明菌株hl-17能大幅度提升水稻幼苗的地上部、根長、鮮重和乾重，有利於水稻植株的萌發。
[0065]
表3西西布哈加瓦氏菌hl-17對水稻幼苗生長的影響，n＝20
[0066][0067]
本實施例中西西布哈加瓦氏菌hl-17具有能夠促進植物的生長和增加農作物產量，特別適合水稻種植的應用。由於西西布哈加瓦氏菌hl-17具有很強的產鐵載體可螯合環境中的鐵離子形成鐵元素，參與葉綠體蛋白和葉綠素的合成，維持葉綠體的穩定，有利於農作物的生長發育。同時該菌株還具有解有機磷能力，可將土壤中植物難以吸收的磷分解為易吸收的磷，改善農作物生長環境，能夠進一步促進植物的生長。