一株小單孢菌屬放線菌及其應用的製作方法

2024-04-11 00:11:05

本發明屬於微生物肥料及農作物逆境保護研究領域，涉及一株小單孢菌屬放線菌及其應用。
背景技術：
：土壤鹽鹼化是當前威脅全球農業生產及農作物產量的主要非生物脅迫因素之一，目前全球近50％的灌溉土地都受到不同程度的鹽脅迫威脅。據統計，全世界鹽鹼土面積約佔土地總面積的7％左右，並有逐年增加的趨勢。我國鹽漬化土壤面積約為1.0×108hm2，約佔土地總面積37％。土壤鹽漬化不僅影響植物代謝和光合作用，而且能夠降低植物對土壤養分和微量元素的攝入。已有研究表明，nacl是鹽漬化土壤最主要的成分，在其脅迫下植物會出現營養失衡、滲透功能受損和活性氧過量，進而導致膜完整性破壞、光合電子傳遞系統失活、激素平衡破壞、生物量積累下降甚至細胞死亡。因此，如何改良鹽鹼化土壤、以及保護並提高重要的經濟農作物抵抗鹽脅迫已成為目前急需解決的問題之一。目前，對於土壤鹽漬化主要採用農業措施、水利工程和化學改土等傳統措施，但這些措施均存在投入大、周期長和見效慢等缺點。目前主要的生物改良方法措施是培育並種植耐鹽鹼的作物，如種植甜菜、玉米、大豆，以及耐鹽植物鹼篷、檉柳等，此外還有耐鹽轉基因植物的研究，但是該類方法往往周期長、花費巨大，而且植物轉基因方法還未被社會廣泛接受認可。鑑於此，近年來利用植物有益微生物提高植物耐鹽性和改良土壤鹽鹼化水平已有相關研究，植物有益微生物不僅可以促進植物生長發育和提高產量，而且可以提高作物耐受逆境條件的能力，但目前研究較多的植物促生菌為細菌以及菌根真菌等真菌資源，而有關放線菌尤其是非鏈黴菌屬的稀有放線菌提高作物在鹽脅迫下生長及相關菌劑研究鮮有報導。小麥是我國的主要糧食作物，具有廣泛的種植區域，但是對於大面積的鹽鹼土地，如何提高小麥的鹽環境適應能力和產量是目前在鹽鹼地種植小麥亟待解決的問題。微生物具有體積小、生長快、易控制等優勢，而放線菌是能夠產生活性物質最多的微生物，已經在醫藥開發、農林業保護等領域中得到了廣泛應用。因此，從鹽鹼地土著生長的植物根際土壤中獲取具有耐鹽並促進小麥在鹽脅迫下生長的放線菌，對於提高小麥的抗鹽能力、促進小麥在鹽鹼地的生長與耐受能力，對於擴大小麥的種植面積、改善鹽漬化土壤具有重要意義。目前有關小單孢菌屬的稀有放線菌對於小麥鹽脅迫下促生長的研究還未見有報導。技術實現要素：本發明的目的是針對上述技術問題，提供一株放線菌桔橙小單孢菌。本發明的另一目的是提供包含放線菌桔橙小單孢菌的小麥耐鹽促生劑。本發明的又一目的是提供放線菌桔橙小單孢菌在小麥抗鹽生長過程中的應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現：一方面，本發明提供一株放線菌桔橙小單孢菌，其特徵在於，該菌種屬放線菌桔橙小單孢菌於(micromonosporaaurantiaca)，代號rs019，2017年5月5日保藏於廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc60177。進一步的，所述的放線菌桔橙小單孢菌於(micromonosporaaurantiaca)，代號rs019的16srrna基因序列如seqidno.1所示。進一步的，所述的放線菌桔橙小單孢菌於(micromonosporaaurantiaca)，代號rs019生長初期表面呈橘色，後期顏色逐漸變深至黑色；掃描電鏡下可清晰地觀察到孢子單生、無柄，或著生在孢子梗上，孢子梗時常分枝成簇。進一步的，所述的rs019的菌種能夠產生吲哚乙酸，能夠產氮，固氮；小麥抗鹽生長過程中的應用。一方面，本發明提供一種含有權利要求1所述的保藏號為gdmcc60177的rs019菌株的小麥耐鹽促生劑；含rs019菌株的小麥耐鹽促生劑在小麥抗鹽生長過程中的應用。一方面，本發明提供一種包含放線菌桔橙小單孢菌的小麥耐鹽促生劑，其特徵在於，是通過以下方法生產而成：1)將保藏編號為gdmcc60177的放線菌桔橙小單孢菌rs019，接種於250ml的isp2液體培養基中(4g酵母浸膏，10g麥芽浸膏，葡萄糖4g，ph7.2，1000ml水)；2)28℃，150rpm搖瓶培養3天後，待菌體生長至對數生長期時8000rpm離心收集菌體；3)用無菌水洗滌菌體兩次後，無菌水調節菌體濃度，菌體濃度約為105-106cfu/ml，即為所述的小麥耐鹽促生劑。另一方面，所述的rs019的菌種在促進小麥生長過程中的應用。發明詳述：本發明通過對海岸帶根際土壤放線菌的分離和耐鹽及促生長特徵的篩選，獲得一株較強耐鹽促生活性的菌株，編號為rs019。通過形態特徵、生理生化以及16srrna基因測序與系統發育分析，確定了其分類學地位。通過平皿種子萌發以及盆栽實驗驗證，採用本發明提供的放線菌桔橙小單孢菌micromonosporaaurantiacars019，具有促進小麥在鹽脅迫種子萌發和幼苗生長、顯著提高其鹽脅迫下的適應能力，該方法可發酵用於菌肥，提高小麥的耐鹽能力，促進小麥在鹽鹼地的種植。分離菌株為桔橙小單孢菌，代號為rs019，該菌株於2017年5月5日在廣東省微生物菌種保藏中心登記保藏，保藏編號為gdmcc60177。同時本發明提供了該桔橙小單孢菌的16srrna基因序列(1393bp)，基於序列如seqidno.1所示。此外，本發明提供了桔橙小單孢菌rs019的菌懸液製備方法，具體步驟為：挑取在isp2固體平板上生長3-5天的桔橙小單孢菌rs019單菌落，接種於250ml的isp2液體培養基中(4g酵母浸膏，10g麥芽浸膏，葡萄糖4g，ph7.2，1000ml水)，28℃，150rpm搖瓶培養3天後，待菌體生長至對數生長期時8000rpm離心收集菌體，用無菌水洗滌菌體兩次後，無菌水調節菌體濃度，菌體濃度約為105-106cfu/ml。同時提供了上述菌懸液的催芽與施肥方法，包括以下步驟：對小麥種子進行表面消毒，首先用有效氯含量為5％的naclo浸泡3min後，用無菌水漂洗4-5次；然後用75％的酒精浸泡5min，用無菌水漂洗數次至種子表面不發黃，最後用上述製備的rs019菌懸液浸泡24h，同時以無菌水處理作為對照。將浸泡後的種子在超淨工作檯中放入加有兩層濾紙的無菌平板上，加入15ml無菌水，放於28℃恆溫培養箱中培養，5天後平皿中加入10ml濃度為100mmnacl鹽脅迫處理。12天後觀察並記錄小麥種子的萌發情況。採用營養土與蛭石以體積比4:1混合得到盆栽基質，然後於121℃滅菌一小時，冷卻後分裝至盆栽花盆中(9cm長×9cm寬×9cm高)，每盆約200g。選取長勢一致的小麥幼苗，移栽含營養土的花盆中，放於溫室中生長(溫度為25℃，每天光照12h，無光照12h交替)，用50ml無菌水和菌液澆灌小麥每盆幼苗，每周澆灌2次，以澆無菌水的小麥幼苗作為對照；3周以後，用2％的nacl溶液進行鹽脅迫灌根處理，每周灌根一次，連續灌根3次。平皿上小麥種子催芽實驗可以發現鹽脅迫的對照組小麥苗已經發黃，而接菌組小麥幼苗鮮綠、長勢明顯更好。在nacl濃度為100mm條件下，對照組發芽率為29.3％，用桔橙小單孢菌rs019菌懸液浸種的小麥發芽率為58％，為對照組的近兩倍。以鹽脅迫30天的盆栽測量結果統計可以發現，接種桔橙小單孢菌rs019後小麥在0、2％nacl處理下鮮重分別提高了61.5％、27.1％，可見鹽脅迫下菌株rs019對小麥種子的萌發與幼苗的生長具有顯著促進作用。有益效果：與現有技術相比，本發明分離篩選的海岸帶土壤桔橙小單孢菌rs019具有固氮、產生植物生長激素吲哚乙酸(iaa)和產氨等多種促生特徵，並能夠耐受5％的nacl，通過菌懸液處理後的小麥在nacl濃度為100mm條件下能顯著提高種子發芽率，菌懸液灌根回接小麥幼苗，具有鹽脅迫下顯著減緩鹽害症狀、增加生物量從而促進小麥生長的效果，有助於提高植物的耐鹽性，減少化學肥料的使用。附圖說明圖1.菌株桔橙小單孢菌rs019在isp2平板上培養7天的菌落照片及掃描電鏡照片圖2.基於16srrna基因構建的菌株rs019系統發育樹圖3.鹽脅迫條件下接菌與不接菌小麥在平皿中的萌發生長狀態的比較圖4.高鹽及無鹽脅迫條件下接菌與不接菌小麥盆栽試驗生長狀態的比較圖5.高鹽及無鹽脅迫條件下接菌與不接菌小麥幼苗鮮重的比較生物材料保藏信息放線菌桔橙小單孢菌rs019，分類命名為放線菌桔橙小單孢菌(micromonosporaaurantiaca)，保藏於廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，地址為廣東省廣州市先烈中路100號大院59號樓廣東微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc60177，保藏日期為2017年5月5日。具體實施方式實施例11.放線菌分離土壤樣本採集自江蘇沿海灘涂的鹽鹼地，土樣採集帶回實驗室後於48小時內完成菌株分離。稱取2個土樣，經過成分研磨後加入含有18ml無菌水的試管中，並稀釋至10-1-10-4濃度梯度，取10-2-10-4濃度的樣本稀釋液塗布於分離培養基上(可溶性澱粉2.0g，精氨酸1.0g，k2hpo40.5g，mgso40.5g，kno31.0g，nacl3.0g，feso40.01g，h2o1000ml，ph7.2)。28℃培養7-14d，長出的菌落及時純化並用isp2固體斜面4℃保藏。2.菌株鑑定菌株rs019的形態與生理生化特徵：在生長初期表面呈橘色，後期顏色逐漸變深至黑色。掃描電鏡下可清晰地觀察到孢子單生、無柄，或著生在孢子梗上，孢子梗時常分枝成簇(圖1)。菌株在酵母膏-麥芽膏(isp2)和土豆瓊脂培養基(pda)上生長良好，無可溶性色素產生。能耐受最高濃度為5％的nacl，具有酪蛋白水解酶活性、纖維素酶活性、以及幾丁質酶活性。能夠在15-42℃溫度範圍能夠生長，在ph6-9範圍能夠生長。使用isp2液體培養基於28℃，150rpm搖瓶培養5天後8000rpm離心收集菌體，微波法提取菌體基因組dna，用細菌通用引物27f5'-agagtttgatcctggctcag-3'和1492r：5'-aaggaggtgatccagccgca-3'進行16srrna基因pcr擴增。pcr反應體系為：模板dna2μl，10×buffer5μl，mgcl2(25mmol)3μl，dntp(10mmol/l)1μl，27f(10μmol/l)1μl，1492r(10μmol/l)1μl，taq酶(5u/μl)0.5μl，pcr產物經0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測後送至生工(上海)有限公司測序。測序結果在ncbi以及ezbiocloud網站上比對測序結果，然後用mega6.0軟體進行序列比對及分析，最後用鄰接法(neighbor-joining，nj)構建系統進化樹並進行系統發育分析，序列比對發現該菌株與小單孢菌屬的有效種序列相似性最高，與桔橙小單孢菌micromonosporaaurantiaca的相似性為100％(圖2)。因此，菌株rs019應屬於小單孢菌屬的成員，命名為桔橙小單孢菌rs019(micromonosporaaurantiacars019)。3.菌株促生長性能固氮潛在性檢測：挑取少量的菌體用點植法接種到無氮培養基上(蔗糖10.0g，caco31.0g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.2g，nacl0.2g，agar15g，h2o1000ml，ph7.2)，放置在28℃恆溫培養箱中培養7天左右，觀察其是否生長，若菌株轉接5次後還能生長，則說明該菌株具有固氮潛在活性。菌株rs019傳代5次後仍然能在無氮培養基上生長良好，說明rs019具有固定空氣中氮元素的潛能。產氨活性檢測：挑取少量待測菌株接種於5ml蛋白腖液體(10g/l)培養基中，三次重複，於28℃120r/min搖床振蕩培養3天後，每個試管中加入0.5ml的nessler’s試劑，若出現黃褐色沉澱則說明具有產氨活性，若無則不產氨。菌株rs019培養後顯色反應呈陽性，說明rs019具有產氨的能力。產植物生長激素吲哚乙酸(iaa)檢測：將有氮培養液分裝於試管，每管分裝4ml，121℃高壓滅菌。配製5mg/ml的色氨酸溶液，使用微孔濾膜過濾除菌後，加入到已經經過高壓滅菌的有氮培養基中，使得色氨酸的最終濃度為0.5mg/ml。挑取菌株接種於分裝後的試管中，28℃的搖床避光培養7天後，使用移液槍取出1ml菌液於滅菌後的離心管中，加入2ml的sackowcki’s顯色劑(將150ml的濃硫酸緩緩加入到250ml的去離子水中，邊加邊攪拌，待溶液冷卻後加入7.5ml0.5mol/l的fecl3·6h2o溶液)充分混勻，室溫下顯色30分鐘，溶液呈粉紅色，則為陽性，說明該菌株rs019產iaa。4.菌株應用試驗菌株菌懸液製備方法：挑取在isp2固體平板上生長3-5天的桔橙小單孢菌rs019單菌落，接種於250ml的isp2液體培養基中(4g酵母浸膏，10g麥芽浸膏，葡萄糖4g，ph7.2，1000ml水)，28℃，150rpm搖瓶培養3天後，待菌體生長至對數生長期時8000rpm離心收集菌體，用無菌水洗滌菌體兩次後，無菌水調節菌體濃度，菌體濃度約為105-106cfu/ml，作為生物菌劑。平皿中小麥催芽試驗：對小麥種子進行表面消毒，首先用有效氯含量為5％的naclo浸泡3min後，用無菌水漂洗4-5次；然後用75％的酒精浸泡5min，用無菌水漂洗數次至種子表面不發黃，最後用上述製備的rs019菌懸液浸泡24h，同時以無菌水處理作為對照。將浸泡後的種子在超淨工作檯中放入加有兩層濾紙的無菌平板上，加入15ml無菌水，放於28℃恆溫培養箱中培養，5天後平皿中加入10ml濃度為100mmnacl鹽脅迫處理。12天後觀察並記錄小麥種子的萌發情況。結果如圖3所示，平皿上小麥種子催芽實驗可以發現鹽脅迫的對照組小麥苗已經發黃，而接菌組小麥幼苗鮮綠、長勢明顯更好。在nacl濃度為100mm條件下，對照組發芽率為29.3％，用桔橙小單孢菌rs019菌懸液浸種的小麥發芽率為58％，為對照組的近兩倍。盆栽施肥實驗：採用營養土與蛭石以體積比4:1混合得到盆栽基質，然後於121℃滅菌一小時，冷卻後分裝至盆栽花盆中(9cm長×9cm寬×9cm高)，每盆約200g。選取長勢一致的小麥幼苗，移栽含營養土的花盆中，放於溫室中生長(溫度為25℃，每天光照12h，無光照12h交替)，用50ml無菌水和菌液澆灌小麥每盆幼苗，每周澆灌2次，以澆無菌水的小麥幼苗作為對照；3周以後，用2％的nacl溶液進行鹽脅迫灌根處理，每周灌根一次，連續灌根3次。在鹽脅迫後30天隨機選取植物進行拍照、測量、檢測。結果如圖4所示，左邊兩盆為無鹽脅迫下不接菌(第1盆)與接菌(第2盆)處理的小麥植株幼苗，可以看出，無鹽脅迫下接種rs019菌懸液的小麥幼苗長勢更好。右邊兩盆為2％的nacl鹽脅迫下不接菌(第3盆)與接菌(第4盆)處理的小麥植株幼苗，可以看出，鹽脅迫下接種桔橙小單孢菌rs019的小麥幼苗生長地更好，而未接菌的幼苗，長勢明顯較差。統計可以發現，接種桔橙小單孢菌rs019後小麥在0、2％nacl處理下鮮重分別提高了61.5％、27.1％(表1，圖5),株高得到顯著提高。可見鹽脅迫下菌株rs019對小麥種子的萌發與幼苗的生長具有顯著促進作用。表1.接种放線菌rs019對小麥幼苗生長的影響株高(cm)植株鮮重(g)最大葉長(cm)0mmnacl35±1.20b1.3±0.20b360mmnacl+rs01943±2.11c2.1±0.14c442％nacl30.6±1.35a1.07±0.21a332％nacl+rs01938±1.67b1.36±0.22b40實施例2、一種小麥耐鹽促生劑，是通過以下方法製備而得的：挑取在isp2固體平板上生長3-5天的桔橙小單孢菌rs019單菌落，接種於250ml的isp2液體培養基中(4g酵母浸膏，10g麥芽浸膏，葡萄糖4g，ph7.2，1000ml水)，28℃，150rpm搖瓶培養3天後，待菌體生長至對數生長期時8000rpm離心收集菌體，用無菌水洗滌菌體兩次後，無菌水調節菌體濃度，菌體濃度約為105-106cfu/ml，即得小麥耐鹽促生劑。sequencelisting江蘇師範大學一株小單孢菌屬放線菌及其應用20171patentinversion3.511393dna桔橙小單孢菌rs0191ctaccatgcagtcgagcggaaggcccttcggggtactcgagcggcgaacgggtgagtaac60acgtgagcaacctgccccaggctttgggataaccccgggaaaccggggctaataccgaat120atgacctctgaccgcatggttggtggtggaaagtttttcggcttgggatgggctcgcggc180ctatcagcttgttggtggggtgatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgaga240gggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtgg300ggaatattgcacaatgggcggaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggcct360tcgggttgtaaacctctttcascagggacgaagcgtaagtgacggtacctgcagaagaag420cgccggccaactacgtgccagcagccgcggtaagacgtagggcgcgagcgttgtccggat480ttattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcgcgtcgaccgtgaaaacttggggctc540aaccccaagcctgcggtcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagactggaattcc600tggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctct660gggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctgg720tagtccacgctgtaaacgttgggcgctaggtgtggggggcctctccggttccctgtgccg780cagctaacgcattaagcgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaagga840attgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaa900ccttacctgggtttgacatggccgcaaaactgtcagagatggcaggtccttcgggggcgg960tcacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgca1020acgagcgcaaccctcgttcgatgttgccagcgcgttatggcggggactcatcgaagactg1080ccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgtccag1140ggcttcacgcatgctacaatggccggtacaatgggctgcgataccgtgaggtggagcgaa1200tcccaaaaagccggtctcagttcggatcggggtctgcaactcgaccccgtgaagtcggag1260tcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacac1320cgcccgtcacgtcacgaaagtcggcaacacccgaagccggtggcccaacccttgtggagg1380agccgtcgaagtg1393當前第1頁12