一種防治辣椒疫病的生防放線菌菌株及其應用的製作方法
2024-04-08 15:43:05
本發明涉及一種防治辣椒疫病的生防放線菌菌株及其應用，屬於農作物病害防治技術領域。
背景技術：
由辣椒疫黴(phytophthoracapsici)引起的辣椒疫病是辣椒生產中一種毀滅性的土傳病害，目前在世界各辣椒產區均有發生。該病不僅可以通過雨水或灌溉水在土壤中傳播，引起大面積死苗，也可以通過氣流傳播，為害辣椒莖、葉、花、果實，在適宜發病條件下，病害在短期內爆發成災，可造成寄主作物絕收，嚴重影響我國辣椒產業發展，造成重大的經濟損失。
目前辣椒疫病的防治主要還是依賴培育抗病品種和使用化學藥劑，其中栽培抗病品種是防治該病最經濟、最有效、最簡便的方法，但是由於疫病菌群體的易變異性致使很多抗病品種逐漸喪失了原有的抗性，而在短時間內選育出具有水平抗疫病的新品種是非常困難的。農藥對農業的發展雖然起著重要的作用，但隨著社會的發展，伴隨化學農藥引起的安全及環境問題也日益凸顯。使用化學農藥不僅缺乏長期的有效性，而且對食品和環境的汙染，對人類健康潛在的危害、對非靶標生物的影響以及導致病原菌抗藥性產生等問題，現已受到越來越多的質疑。因此，生物防治尤其是拮抗微生物的利用受到普遍關注和重視，探索有效的生防途徑無疑有著重大的理論意義和實用價值。
放線菌（actinomycetes）是一類具有重要經濟價值和實用價值的微生物，種類豐富，廣泛分布於自然界中。目前從微生物中發現的約8000種生物活性物質當中，近70%是由放線菌產生，特別是鏈黴菌產生的抗生素在農業生產中應用廣泛，如中生菌素、阿維菌素等，其都具有無汙染、無殘留、可再生、效果持久、針對性強、難以使有害生物產生抗藥性、易於產業化、成本低等特點，在農業生產中具有較高的環境效益和經濟效益，開發前景極其廣闊。因此，通過篩選和利用拮抗菌達到高效、環保的生物防治目的已成為當前農業科學研究的熱點之一，符合農業的可持續發展要求。
技術實現要素：
本發明的目的在於：針對目前辣椒疫病嚴重發生，且面積逐年擴大，化學防治效果不理想，同時帶來環境汙染的問題，提供一種高效防治辣椒疫病的生防放線菌及其應用方法。
一種防治辣椒疫病的生防放線菌菌株及其應用方法，本發明的目的可通過如下技術方案實現：
一種防治辣椒疫病的生防放線菌st19，經形態觀察、培養特徵觀察和分子生物學研究鑑定為鏈黴菌(streptomycessp.)，已於2014年3月24月保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（cgmcc），地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101；菌種保藏號為cgmccno.8962。
本發明的另一目的在於提供一種利用上述防治辣椒疫病的生防放線菌菌株st19製備的生防菌劑，所述生防菌劑是由所述放線菌菌株st19發酵而成。
本發明還提供了上述利用防治辣椒疫病的生防放線菌菌株st19製備生防菌劑的方法，其步驟如下：
1）種子液的製備：將所述的菌株接種於高氏一號液體培養基中，28℃，200r/min，培養2d後，製成種子液；
2）發酵：將種子液接種於發酵培養基中，發酵條件為：接種量6%vol、裝瓶量70ml/250ml、發酵培養基初始ph值7.0，28℃，200r/min，發酵時間5d，製成濃度為108cfu/ml的st19菌株發酵液；
3）無菌濾液的製備：將發酵液4000r/min離心5min後，用0.45µm滅菌微孔濾膜過濾除菌，得無菌濾液。
其中，步驟2）所述發酵培養基的配方為：可溶性澱粉2%wt、葡萄糖1.5%wt、黃豆粉2%wt、mgso4·7h2o0.05%wt、k2hpo40.1%wt、nacl0.1%wt、caco30.2%wt，其餘為蒸餾水。
上述生防菌劑的應用方式有以下兩種：
1）在辣椒幼苗期或成株期灌根使用：在辣椒幼苗期或成株期連續使用2~3次，每次間隔7~10d；
2）與有機肥混合製成菌肥使用。
上述防治辣椒疫病的生防放線菌菌株st19可應用於辣椒疫病生物防治中。
本發明的優點在於：
本發明篩選出的生防放線菌st19能夠明顯抑制辣椒疫黴的生長。由於是生物製劑，因此沒有化學農藥的使用帶來的一系列問題，可減少農田汙染，且能有效防治辣椒疫病。
本發明生防放線菌分離自辣椒根圍土壤，與土壤生態和諧相容，有利於充分發揮菌株的優勢。
本發明生防放線菌菌株培養條件簡單，易於工業化生產，具有良好的開發應用前景。
附圖說明
圖1為菌株st19氣生菌絲和孢子絲形態（光學顯微鏡下400×）。
圖2為菌株st19菌絲形態（電子顯微鏡5000×）。
圖3為拮抗菌株st19對辣椒疫黴的平板抑菌效果圖。
具體實施方式
為了更好地理解本發明，下面結合附圖和實施例對本發明做進一步闡述，但並不是對本發明的限制。下述實施例中所用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
實施例一拮抗放線菌的分離
具體過程如下：
1、土壤樣品的採集
從福建省建甌市東峰鎮坤口村採集不同辣椒地塊5~10cm深處的根圍土壤，分裝標記後帶回實驗室，待自然風乾後分離。
2、放線菌的分離
採用平板稀釋法進行分離。稱取土壤樣品10g，倒入裝有小玻璃珠和90ml無菌水的三角瓶中，震蕩30min後靜置5分鐘，依次稀釋10倍，分別配製成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的懸浮液，吸取不同濃度的懸浮液各0.1ml加到高氏一號培養基（加入終濃度為50mg/l的k2cr2o7）平板上，均勻塗布後置於28℃培養觀察，5~7天後挑取不同的單菌落劃線純化。將純化後的菌株轉接到高氏一號斜面培養基上培養，4℃保存備用，共分離得到80株放線菌。
實施例二菌株st19的鑑定
1、形態特徵觀察
將菌株st19劃線接種在高氏一號培養基上，以45℃斜插入無菌蓋玻片，28℃培養10d後，取出蓋玻片在光學顯微鏡和電子顯微鏡下觀察菌絲的形態特徵（圖1和圖2）。
2、培養特徵觀察
採用《鏈黴菌鑑定手冊》推薦的8種培養基，將菌株st19於28℃培養7~10d後觀察菌體生長情況，記錄氣生菌絲、基內菌絲的顏色以及是否產生可溶性色素。菌株st19在高氏一號培養基、察貝克培養基、澱粉銨培養基、pda培養基、葡萄糖酵母膏培養基和燕麥培養基上生長良好，基內菌絲和氣生菌絲髮育良好；而在克氏一號培養基和葡萄糖天門冬素培養基上生長較差，在高氏一號培養基和pda培養基上產生黃褪色或棕褪色可溶性色素(表1)。根據以上形態特徵分析，對照鏈黴菌鑑定手冊，將st19鑑定為鏈黴菌(streptomycessp.)。
表1菌株st19在不同培養基上的培養特徵
3、16srdna序列分析
基因組提取試劑盒提取菌株st19基因組dna後，採用通用引物f:5'-agagtttgatcctggctcag-3'和r:5'-ggttaccttgttacgactt-3'，進行16srdna的pcr擴增。回收pcr擴增產物得到st19-16srdna，經連接、轉化、鑑定後，陽性克隆送生工生物工程（上海）有限公司測序得核苷酸序列信息，序列全長為1548bp。將所得序列提交到genbank資料庫進行blast分析比對，發現與st19同源性達到99%的菌株均屬於鏈黴菌屬，結合形態學特徵和培養特徵，最終將菌株st19鑑定為鏈黴菌(streptomycessp.)。
實施例三st19菌株發酵工藝的優化
將上述菌株接種於高氏一號液體培養基中，28℃，200r/min，培養2d後，製成種子液，接種於發酵培養基中。以辣椒疫黴為靶標菌，通過對碳源、氮源的篩選以及營養條件單因子試驗和正交試驗後，得到該菌株的最佳發酵配方為：可溶性澱粉2%wt、葡萄糖1.5%wt、黃豆粉2%wt、mgso4·7h2o0.05%wt、k2hpo40.1%wt、nacl0.1%wt、caco30.2%wt，其餘為蒸餾水。最佳發酵條件為：接種量6%vol、裝瓶量70ml/250ml、發酵培養基初始ph值7.0，28℃，200r/min，發酵時間5d，製成濃度為108cfu/ml的st19菌株發酵液。將發酵液4000r/min離心5min後，用0.45µm滅菌微孔濾膜過濾除菌，得無菌濾液。
實施例四菌株st19拮抗測定
採用平板對峙培養法，將菌株st19對辣椒疫黴作拮抗測定，首先在黑麥培養基平板中央接入5cm辣椒疫黴菌餅，待辣椒疫黴菌落長至3cm時，在菌落4周點接上菌株st19，25℃下培養5d後測量菌株st19對辣椒疫黴的抑菌帶寬度，以不接拮抗菌為對照，結果表明菌株st19對辣椒疫黴具有較好的拮抗作用（圖3）。
實施例五菌株st19發酵液盆栽防效試驗
選取4~6葉期的茄門甜椒苗，每株苗澆灌50mlst19菌株發酵液（108cfu/ml）。24h後灌根接種辣椒疫黴遊動孢子懸浮液（5×103個/ml），每株20ml。接種4天後再澆灌一次100mlst19菌株發酵液。以72%克露可溼性粉劑600倍液灌根處理作為農藥對照，以發酵培養基和清水處理的植株作為空白對照。每個處理10株苗，每處理3次重複。待發病後每天調查發病情況，統計發病率和病情指數，直至清水對照發病率達到80%以上時結束實驗。
病情分級標準如下：
0級：無病；
1級：幼苗根莖部輕微變黑，葉片不萎蔫或可恢復性萎蔫；
3級：幼苗根莖部變黑1~2cm，葉片不可恢復性萎蔫，下部葉片偶有脫落；
5級：幼苗根莖部變黑2cm以上，葉片不可恢復性萎蔫或葉片脫落明顯；
7級：幼苗根莖部變黑縊縮，除生長點外葉片全部脫落或植株萎蔫；
9級：植株枯死。
病情指數（%）=[∑病級數×該病級植株數)／(最高病級數×總植株數)]×100%
防治效果（%）=[(空白對照病情指數－處理病情指數)／空白對照病情指數]×100%
實驗結果見表2，該結果表明供試放線菌st19發酵液能夠顯著降低辣椒疫病的病情指數，防治效果高達66.85%，僅略低於化學農藥72%克露可溼性粉劑600倍液的防治效果71.06%。另外從表中還可以看出，發酵培養基處理的病情指數略低於清水對照處理的病情指數，但兩者差異不顯著。溫室盆栽實驗結果說明，st19菌株能夠有效防治辣椒疫病，表現出良好的應用潛力。
表2放線菌st19發酵液對辣椒疫病的防治效果
以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。
sequencelisting
福建省農業科學院植物保護研究所
一種防治辣椒疫病的生防放線菌菌株及其應用
3
3
patentinversion3.3
1
20
dna
f
1
agagtttgatcctggctcag20
2
19
dna
r
2
ggttaccttgttacgactt19
3
1548
dna
st19-16srdna
3
agcttgcatgcctgcaggtcgacgattagagtttgatcctggctcaggacgaacgctggc60
ggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacgatgaaccacttcggtggggattagtggcgaac120
gggtgagtaacacgtgggcaatctgcccttcactctgggacaagccctggaaacggggtc180
taataccggatacaacactctcgggcatccgatgagtgtggaaagctccggcggtgaagg240
atgagcccgcggcctatcagcttgttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgacgggt300
agccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgg360
gaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtga420
gggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgaaagtgacggta480
cctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcga540
gcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggtctgtcgcgtcgaatgtga600
aagcccggggcttaaccccgggtctgcattcgatacgggcagactagagtgtggtagggg660
agatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcg720
aaggcggatctctgggccattactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacagga780
ttagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggaactaggtgttggcgacattccac840
gtcgtcggtgccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggct900
aaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggcttaattcgac960
gcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatacaccggaaacggccagagatggtcgcc1020
cccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttg1080
ggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgttctgtgttgccagcatgcccttcggggtg1140
atggggactcacaggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagt1200
catcatgccccttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggcaggtacaatgagctgc1260
gaagccgtgaggcggagcgaatctcaaaaagcctgtctcagttcggattggggtctgcaa1320
ctcgaccccatgaagtcggagttgctagtaatcgcagatcagcagtgctgcggtgaatac1380
gttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccg1440
gtggcccaaccccttgtgggagggagctgtcgaaggtgggactggcgattgggacgaagt1500
cgtaacaaggtaccaatctctagaggatccccgggtaccgagctcgaa1548