一種仿生膠原液體敷料及其製備方法與流程
2024-04-13 05:11:05
1.本發明涉及一種生物材料的製備方法，具體涉及一種仿生膠原液體敷料及其製備方法。
背景技術：
2.1962年倫敦大學的winter博士首先用動物實驗證實，溼性環境的傷口癒合速度比乾性癒合快1倍。1963年hinman進行人體研究，證實溼性癒合的科學性。20世紀70年代「溼性傷口癒合」觀念逐漸被廣泛接受。液體敷料就是根據「溼潤癒合理論」研製的新型醫用敷料，相對於傳統敷料，液體敷料能保持創面溼潤，利於創面組織再生修復，縮短傷口癒合時間，同時也減少醫用敷料用量，顯著縮短護理時間。
3.另一方面，膠原是脊椎動物體內含量最豐富、分布最廣的蛋白，膠原敷料可促進皮膚組織合成代謝和細胞再生，提高皮膚局部溫度和溼度，加速局部皮膚細胞的血液循環和新陳代謝，有利於皮膚細胞的更新換代，從而加速組織再生與修復。然而，膠原敷料多以膜型、海綿型或結合無紡布等固體敷料形式提供，液體敷料中的膠原成份也多以團聚物或凝膠等形式提供，其中的膠原分子不具有流動性。
4.本發明從解決液體敷料中膠原分子流動性問題的角度出發，提供一種以膠原水溶液為主要成份的仿生膠原液體敷料及其製備方法，在確保敷料具備均質流動特性的基礎上，從膠原類型、成份模擬、酸性環境等方面模擬皮膚組織微環境，實現仿生功效，促進皮膚創面的修復再生。
技術實現要素：
5.本發明要解決的技術問題是提供一種仿生膠原液體敷料及其製備方法。
6.一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，依次包括如下步驟：
7.(1)將固體膠原材料溶於水中，充分溶解，離心，取上清液；所述固體膠原材料選自i型、iii型、v型、vi型、vii型、viii型、xii型、xiii型、xiv型、xvi型、xxviii型膠原中的一種或兩種以上的組合；所述上清液中各種類型膠原的總濃度為大於等於0.001wt.％但小於等於5wt.％；
8.(2)通過鹼性溶液或酸性溶液調節步驟(1)所得上清液的ph值；所述酸性溶液包括水楊酸、乳酸、硫酸、酒石酸、檸檬酸、磷酸、草酸、乙酸、乙二酸、琥珀酸、鹽酸、馬來酸、苯甲酸、硝酸、蘋果酸、煙酸、磷酸二氫鈉和甲酸中的至少一種；所述鹼性溶液包括四甲基乙二胺、氫氧化鈉、三乙胺、碳酸鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氨水、磷酸氫二鈉和碳酸氫鈉中的至少一種；
9.(3)在步驟(2)所得溶液中加入皮膚模擬成份；所述皮膚模擬成份包括透明質酸、彈力蛋白、角蛋白、硫酸軟骨素、黏多糖、神經醯胺、維他命a、維他命e、d-泛醇、尿素、乳酸鈉和乳酸中的至少一種；所述皮膚模擬成份的濃度為大於等於0.00001wt.％但小於等於2wt.％；
10.(4)在步驟(3)所得溶液中加入模擬體液成份，模擬體液成份包括na
+
、k
+
、mg
2+
、ca
2+
、cl-、hco
3-、hpo
42-、so
42-、co
32-、po
43-、h2po
4-中的一種或兩種以上的組合；
11.(5)在步驟(4)所得溶液中加入保護分子，所述保護分子包括十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、吐溫、曲拉通、乙二醇、苯丙氨酸、脯氨酸、卵磷脂、穀氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、芒果苷、甘氨酸、天冬氨酸、正丁醇、丙二醇、乙二胺四乙酸鈉鹽、硬脂酸、司盤、甘油和明膠中的至少一種；
12.(6)將步驟(5)所得溶液進行低溫輻照處理。
13.本發明一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，所述步驟(6)中低溫輻照處理的低溫範圍為-20
–
5℃。
14.本發明一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，所述輻照處理包括γ射線輻照、電子束輻照和x射線輻照中的至少一種。
15.本發明一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，仿生膠原液體敷料中各離子的最終離子濃度範圍為0.01
–
0.5m。
16.本發明一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，所述保護分子與膠原的質量比為1:10
–
100:1。
17.本發明一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，所述步驟(2)中上清液的ph值最終範圍為大於等於4.0但小於等於7.8；優選地，所述步驟(2)中上清液的ph值最終範圍為大於等於4.1但小於等於6.5；優選地，所述步驟(2)中上清液的ph值最終範圍為大於等於4.2但小於等於5.6。
18.使用本發明任意一種仿生膠原液體敷料的製備方法所製備的仿生膠原液體敷料。
19.本發明一種仿生膠原液體敷料，可以用於人體創面，也可以用於動物體創面。
20.本發明的有益效果：
21.本發明從解決液體敷料中膠原分子流動性問題的角度出發，提供了一種以膠原水溶液為主要成份的仿生膠原液體敷料及其製備方法，其中，步驟(2)調控膠原水溶液的ph值偏弱酸性，儘可能分散膠原分子，降低膠原分子的自組裝行為；步驟(3)加入皮膚模擬成份、步驟(4)加入模擬體液成份、步驟(5)加入保護分子，都有調控溶液環境的作用，相互協同降低膠原分子的自組裝行為，保證了敷料的均質流動性，且在確保敷料具備均質流動特性的基礎上，從膠原類型、成份模擬、酸性環境等方面模擬皮膚組織微環境，實現了仿生功效，促進了皮膚創面的修復再生，增強了液體敷料的修復功效。
附圖說明
22.圖1膠原液體敷料的濁度測試圖(圖1a是實施例1樣品，圖1b是實施例2樣品，圖1c是實施例3樣品，圖1d是實施例4樣品，圖1e是實施例5樣品，圖1f是對比例1樣品，圖1g是對比例2樣品)
23.圖2膠原液體敷料在皮膚表面粘附性測試圖(圖2a是實施例1樣品，圖2b是實施例2樣品，圖2c是實施例3樣品，圖2d是實施例4樣品，圖2e是實施例5樣品，圖2f是對比例1樣品，圖2g是對比例2樣品)
24.圖3膠原液體敷料修復皮膚創面的效果圖
25.圖4大鼠皮膚創面修復的he染色效果圖(圖4a是實施例1樣品，圖4b是對比例1樣
品)
具體實施方式
26.本發明從解決液體敷料中膠原分子流動性問題的角度出發，提供了一種以膠原水溶液為主要成份的仿生膠原液體敷料及其製備方法，具體內容如下：
27.本發明一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，依次包括如下步驟：
28.(1)將固體膠原材料溶於水中，充分溶解，離心，取上清液；固體膠原材料選自i型、iii型、v型、vi型、vii型、viii型、xii型、xiii型、xiv型、xvi型、xxviii型膠原中的一種或兩種以上的組合；上清液中各種類型膠原的總濃度為大於等於0.001wt.％但小於等於5wt.％；
29.(2)通過鹼性溶液或酸性溶液調節步驟(1)所得上清液的ph值；酸性溶液包括水楊酸、乳酸、硫酸、酒石酸、檸檬酸、磷酸、草酸、乙酸、乙二酸、琥珀酸、鹽酸、馬來酸、苯甲酸、硝酸、蘋果酸、煙酸、磷酸二氫鈉和甲酸中的至少一種；鹼性溶液包括四甲基乙二胺、氫氧化鈉、三乙胺、碳酸鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氨水、磷酸氫二鈉和碳酸氫鈉中的至少一種；
30.(3)在步驟(2)所得溶液中加入皮膚模擬成份；皮膚模擬成份包括透明質酸、彈力蛋白、角蛋白、硫酸軟骨素、黏多糖、神經醯胺、維他命a、維他命e、d-泛醇、尿素、乳酸鈉和乳酸中的至少一種；皮膚模擬成份的濃度為大於等於0.00001wt.％但小於等於2wt.％；
31.(4)在步驟(3)所得溶液中加入模擬體液成份，模擬體液成份包括na
+
、k
+
、mg
2+
、ca
2+
、cl-、hco
3-、hpo
42-、so
42-、co
32-、po
43-、h2po
4-中的一種或兩種以上的組合；
32.(5)在步驟(4)所得溶液中加入保護分子，保護分子包括十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、吐溫、曲拉通、乙二醇、苯丙氨酸、脯氨酸、卵磷脂、穀氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、芒果苷、甘氨酸、天冬氨酸、正丁醇、丙二醇、乙二胺四乙酸鈉鹽、硬脂酸、司盤、甘油和明膠中的至少一種；
33.(6)將步驟(5)所得溶液進行低溫輻照處理。
34.本發明一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，步驟(6)中低溫輻照處理的低溫範圍為-20
–
5℃。
35.本發明一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，輻照處理包括γ射線輻照、電子束輻照和x射線輻照中的至少一種。
36.本發明一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，仿生膠原液體敷料中各離子的最終離子濃度範圍為0.01
–
0.5m。
37.本發明一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，保護分子與膠原的質量比為1:10
–
100:1。
38.本發明一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，步驟(2)中上清液的ph值最終範圍為大於等於4.0但小於等於7.8；優選地，步驟(2)中上清液的ph值最終範圍為大於等於4.1但小於等於6.5；優選地，步驟(2)中上清液的ph值最終範圍為大於等於4.2但小於等於5.6。
39.本發明一種仿生膠原液體敷料，是使用本發明上述任意一種仿生膠原液體敷料的製備方法所製備的仿生膠原液體敷料。本發明一種仿生膠原液體敷料，可以用於人體創面，
也可以用於動物體創面。
40.本發明一種仿生膠原液體敷料的製備方法的步驟(1)中是根據皮膚組織所含膠原類型選擇仿生膠原液體敷料中的膠原材料，根據敷料的特定功效確定敷料中各類型膠原的比例，根據敷料的應用方式確定敷料中膠原總濃度，比如，以噴塗方式使用會使用低濃度膠原水溶液，以塗抹方式使用會使用高濃度膠原水溶液。
41.由於在人體皮膚表面存留著尿素、尿酸、鹽分、乳酸、胺基酸、游離脂肪酸等酸性物質，所以皮膚表面常顯弱酸性。皮膚只有在正常的ph值範圍內，也就是處於弱酸性，才能使皮膚處於吸收營養的最佳狀態，此時皮膚抵禦外界侵蝕的能力以及彈性、光澤、水分等等，都為最佳狀態。因此，在本發明步驟(2)中膠原水溶液的ph值會根據敷料應用中皮膚組織的ph值進行調控，膠原水溶液總體偏弱酸性。同時，水溶液的酸性環境更利於膠原材料的充分溶解，利於仿生膠原液體敷料保持均質流動性。
42.為了調控膠原水溶液的ph值與預修復皮膚組織的ph值相匹配，在本發明步驟(2)中微量添加鹼性溶液或酸性溶液，不顯著改變水溶液中膠原濃度；同時，鹼性溶液或酸性溶液儘可能選擇生物相容性良好的試劑。
43.本發明在步驟(3)中根據皮膚組織的成份選擇添加少量皮膚模擬成份，儘可能使膠原液體敷料成份與預修復皮膚組織相匹配，並根據皮膚組織的成份含量確定添加皮膚模擬成份含量，儘可能與預修復皮膚組織相匹配。
44.為了調控仿生膠原液體敷料的離子環境與預修復皮膚組織的離子環境相匹配，在本發明一種仿生膠原液體敷料的製備方法的步驟(4)中添加模擬體液成份，一方面增強水溶液中各成份的穩定性，減少團聚現象，另一方面增強仿生膠原液體敷料的生物相容性。
45.本發明在步驟(5)中加入保護分子，與水溶液中各成份通過氫鍵等弱相互作用力進行結合，避免水溶液中成份在輻照過程中發生交聯。
46.本發明在步驟(6)中採用低溫條件輻照，一方面避免輻照過程中溫度過高造成對水溶液中各成份的不利影響，另一方面避免輻照過程中水溶液中各成份發生交聯。
47.由於膠原分子的自組裝行為，在分子環境、ph值、溫度等因素影響下，液體敷料中的膠原分子通常會聚集團聚，甚至以凝膠的形式存在，膠原分子不具有流動性，即使保持創面溼潤，膠原材料的修復功效也會受到影響。為了增強液體敷料的修復功效，本發明從解決液體敷料中膠原分子流動性問題的角度出發，提供一種以膠原水溶液為主要成份的仿生膠原液體敷料及其製備方法，其中，步驟(2)調控膠原水溶液的ph值偏弱酸性，儘可能分散膠原分子，降低膠原分子的自組裝行為；步驟(3)加入皮膚模擬成份、步驟(4)加入模擬體液成份、步驟(5)加入保護分子，都有調控溶液環境的作用，相互協同降低膠原分子的自組裝行為，保證了敷料的均質流動性，且在確保敷料具備均質流動特性的基礎上，從膠原類型、成份模擬、酸性環境等方面模擬皮膚組織微環境，實現了仿生功效，促進了皮膚創面的修復再生，增強了液體敷料的修復功效。
48.下面以具體實施例對本發明的效果作說明。
49.實施例1
50.一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，依次包括如下步驟：
51.(1)將1g i型膠原和0.5g iii型膠原材料置入100g去離子水中，充分溶解，離心，取上清液；
52.(2)通過0.5m三乙胺或0.1m蘋果酸調節步驟(1)所得上清液的ph值至6.5；
53.(3)在步驟(2)所得溶液中加入0.1wt.％透明質酸；
54.(4)在步驟(3)所得溶液中加入0.02g kh2po4和0.005g na2co3；
55.(5)在步驟(4)所得溶液中加入吐溫，其中吐溫與膠原的質量比為10:1；
56.(6)將步驟(5)所得溶液在0℃進行co
60
輻照處理。
57.實施例2
58.一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，依次包括如下步驟：
59.(1)將2g i型膠原、0.1g v型膠原和0.1g vii型膠原材料置入500g去離子水中，充分溶解，離心，取上清液；
60.(2)通過0.2m碳酸鈉或1m草酸調節步驟(1)所得上清液的ph值至7.8；
61.(3)在步驟(2)所得溶液中加入0.05wt.％彈力蛋白和0.00001wt.％硫酸軟骨素；
62.(4)在步驟(3)所得溶液中加入1gna2hpo4和0.05g mg(hco3)2；
63.(5)在步驟(4)所得溶液中加入賴氨酸和甘油，其中賴氨酸與膠原的質量比為1:10，甘油與膠原的質量比為2:1；
64.(6)將步驟(5)所得溶液在5℃進行cs
137
輻照處理。
65.實施例3
66.一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，依次包括如下步驟：
67.(1)將0.5g i型膠原、0.01g xii型膠原和0.01g xiv型膠原材料置入200g去離子水中，充分溶解，離心，取上清液；
68.(2)通過1m氫氧化鉀或0.2m檸檬酸調節步驟(1)所得上清液的ph值至4.2；
69.(3)在步驟(2)所得溶液中加入0.05wt.％彈力蛋白和0.00001wt.％硫酸軟骨素；
70.(4)在步驟(3)所得溶液中加入2g乳酸鈉和1g黏多糖；
71.(5)在步驟(4)所得溶液中加入明膠和乙二醇，其中明膠與膠原的質量比為1:5，乙二醇與膠原的質量比為100:1；
72.(6)將步驟(5)所得溶液在-10℃進行電子加速器輻照處理。
73.實施例4
74.一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，依次包括如下步驟：
75.(1)將0.01g i型膠原材料置入1000g去離子水中，充分溶解，離心，取上清液；
76.(2)通過0.5m三乙胺或0.1m蘋果酸調節步驟(1)所得上清液的ph值至5.6；
77.(3)在步驟(2)所得溶液中加入2wt.％透明質酸；
78.(4)在步驟(3)所得溶液中加入0.02g kh2po4和0.005g na2co3；
79.(5)在步驟(4)所得溶液中加入吐溫，其中吐溫與膠原的質量比為10:1；
80.(6)將步驟(5)所得溶液在-20℃進行co
60
輻照處理。
81.實施例5
82.一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，依次包括如下步驟：
83.(1)將8.5g i型膠原、0.5g xii型膠原和1g xiv型膠原材料置入200g去離子水中，充分溶解，離心，取上清液；
84.(2)通過1m氫氧化鉀或0.2m乙酸調節步驟(1)所得上清液的ph值至4.0；
85.(3)在步驟(2)所得溶液中加入0.05wt.％彈力蛋白和0.00001wt.％硫酸軟骨素；
86.(4)在步驟(3)所得溶液中加入2g乳酸鈉和1g黏多糖；
87.(5)在步驟(4)所得溶液中加入明膠和乙二醇，其中明膠與膠原的質量比為1:5，乙二醇與膠原的質量比為100:1；
88.(6)將步驟(5)所得溶液在-10℃進行電子加速器輻照處理。
89.實施例6
90.仿生膠原液體敷料效果比較試驗
91.一、對比膠原敷料的製備
92.對比例1：一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，依次包括如下步驟：
93.(1)將1g i型膠原和0.5g iii型膠原材料置入100g去離子水中，充分溶解，離心，取上清液；
94.(2)通過0.5m三乙胺或0.1m蘋果酸調節步驟(1)所得上清液的ph值至6.5；
95.(3)在步驟(2)所得溶液中加入吐溫，其中吐溫與膠原的質量比為10:1；
96.(4)將步驟(3)所得溶液在0℃進行co
60
輻照處理。
97.對比例2：一種仿生膠原液體敷料的製備方法，其中，依次包括如下步驟：
98.(1)將2g i型膠原、0.1g v型膠原和0.1g vii型膠原材料置入500g去離子水中，充分溶解，離心，取上清液；
99.(2)通過0.2m碳酸鈉或1m草酸調節步驟(1)所得上清液的ph值至7.8；
100.(3)在步驟(2)所得溶液中加入0.05wt.％彈力蛋白和0.00001wt.％硫酸軟骨素；
101.(4)在步驟(3)所得溶液中加入1gna2hpo4和0.05g mg(hco3)2；
102.(5)將步驟(4)所得溶液在5℃進行cs
137
輻照處理。
103.二、效果試驗對比
104.(1)膠原液體敷料濁度測試：膠原液體敷料的濁度在濁度儀(tzd-bz-905,suzhou diagvita technology co.,ltd.)上觀察，波長為625nm。測試結果見表1。膠原液體敷料的濁度測試圖見圖1，其中，圖1a是實施例1樣品，圖1b是實施例2樣品，圖1c是實施例3樣品，圖1d是實施例4樣品，圖1e是實施例5樣品，圖1f是對比例1樣品，圖1g是對比例2樣品。
105.表1膠原液體敷料濁度測試
[0106][0107]
由表1可知，由於實施例1-5可形成均質膠原水溶液，水溶液濁度均很小，圖1a、1b、1c、1d、1e中實施例1、2、3、4、5的水溶液也比較透明；而對比例1-2中膠原分子已聚集形成膠原纖維，實際形成膠原纖維懸浮液，其濁度也較大，圖1f、1g中對比例1、2的水溶液比較渾濁。
[0108]
(2)膠原液體敷料在皮膚表面粘附性測試：將測試樣品均勻塗抹於皮膚表面，觀察測試樣品是否可以均勻粘附在皮膚表面，是否有聚集成團現象。測試圖見圖2，其中，圖2a是實施例1樣品，圖2b是實施例2樣品，圖2c是實施例3樣品，圖2d是實施例4樣品，圖2e是實施例5樣品，圖2f是對比例1樣品，圖2g是對比例2樣品。
[0109]
由圖2可知，實施例1、2、3、4、5樣品為均質水溶液，可以均勻黏附於皮膚表面，與皮膚緊密結合，而對比例1、2樣品為非均質懸浮液，膠原已形成纖維發生聚集，不能均勻塗抹於皮膚表面。
[0110]
(3)膠原液體敷料修復皮膚創面測試：皮膚創面為真皮層出血創面，創面尺寸約1cm
×
1cm，在創面形成時使用碘伏擦拭傷口滅菌，然後塗抹實施例1，在塗抹後2分鐘、2天、6天、9天和12天觀察創面修復情況，並拍照記錄。修復效果圖見圖3。
[0111]
由圖3可知，實施例1樣品可以在創面修復初期均勻粘附於創面表面，仿生膠原敷料可以高效止血，並將創面與空氣隔絕，防止染菌汙染創面；創面修復2天後再生皮膚組織在創面已形成；創面在6-12天快速修復，基本無疤痕形成。
[0112]
與實施例1樣品相似，實施例2、3、4、5樣品可以在創面形成初期快速與創面粘合，一方面形成物理屏障為創面修復提供溼潤環境，一方面能夠模擬皮膚組織微環境促進創面修復，創面在3天內開始皮膚再生，10天基本修復完成，無明顯疤痕。
[0113]
(4)大鼠皮膚創面修復效果比較：在大鼠皮膚表面製造出血創面，經碘伏消毒滅菌後，塗抹膠原液體敷料樣品，經10天後處死實驗大鼠，取出敷料樣品，用4wt.％多聚甲醛固定液固定，進行he染色。
[0114]
具體步驟如下：
[0115]
(1)將樣品放在石蠟包埋機裡進行包埋，然後用切片機進行切片，將切好的片子放入60℃的水浴鍋裡，用載玻片小心插入靠近切片的水裡，將漂浮的石蠟切片轉移到載玻片上，若有水泡，用針頭挑出。
[0116]
(2)二甲苯脫水5min，兩次，100％酒精、95％酒精、85％酒精、70％酒精、50％酒精依次衝洗，自來水衝洗，蘇木精染色5min，自來水衝洗使顏色變藍。
[0117]
(3)放入1％鹽酸乙醇溶液褪色2-10s，顏色變紅並較淺，自來水衝洗恢復藍色。
[0118]
(4)再放入50％酒精、70％酒精、80％酒精各5min，0.5％伊紅酒精溶液對比染色1-3min。
[0119]
(5)將切片放入95％酒精中洗去多餘紅色，然後放入100％酒精中3-5min，吸水紙吸取多餘酒精，將切片放入二甲苯ⅰ、ⅱ各3-5min。
[0120]
(6)用中性樹膠封存，固定。
[0121]
大鼠創面修復的he染色效果見圖4，其中，圖4a是實施例1樣品，圖4b是對比例1樣品。由圖4可知，由於實施例1樣品與大鼠皮膚組織的微環境更接近，實施例1樣品與大鼠皮膚組織相容性更好，基本無炎症細胞，而對比例1樣品中發現大量炎症細胞。
[0122]
與實施例1樣品相似，實施例2、3、4、5樣品具有更好的皮膚組織相容性，而對比例2皮膚組織相容性較差。
[0123]
綜上所述，由效果測試可知，實施例樣品可以在確保敷料具備均質流動特性的基礎上，從膠原類型、成份模擬、酸性環境等方面模擬皮膚組織微環境，實現了仿生功效，促進了皮膚創面的修復再生。
[0124]
以上所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方案做出的各種變形和改進，均應落入本發明權利要求書確定的保護範圍內。