一種可注射膠原材料及其製備方法與流程
2024-04-13 07:29:05 2
1.本發明涉及一種生物材料及其製備方法，具體涉及一種可注射膠原材料及其製備方法。
背景技術：
2.膠原蛋白是結締組織主要的結構蛋白，在骨骼、皮膚、血管、韌帶、軟骨、肌肉和肌腱等組織器官中廣泛分布，佔總蛋白的25％～30％。迄今為止，已發現20餘種膠原蛋白，其中i型膠原蛋白含量最高，約為90％。由於其具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性等特性，膠原蛋白作為常規生物材料廣泛應用於組織工程、再生醫學等領域。
3.作為膠原蛋白的應用形式之一，可注射膠原材料通常是將鹽析提取膠原或固體膠原溶於酸溶液後通過透析獲得。在透析過程中酸性膠原水溶液ph值會逐漸轉變成中性，由於膠原蛋白的等電點是7.5～7.8，溶解在水溶液中膠原分子會逐漸自組裝形成膠原纖維。因此，常規可注射膠原材料實質是相分離的膠原纖維在水溶液中濃縮的分散體，即，非均質的膠原纖維懸浮水溶液，而不是膠原分子充分溶解的均質水溶液。這種膠原纖維懸浮液通常還需要高速剪切或過濾等操作才可以滿足注射要求，由於實質為非均質的膠原纖維懸浮水溶液，注射後在體內也不會形成具有一定力學強度的膠原水凝膠。
4.針對以上可注射膠原材料在製備及使用中的問題，需要開發一種ph中性的、均質流動的、可以在體內形成具有一定力學強度的膠原水凝膠的可注射膠原材料，及可製備該可注射膠原材料的製備方法。
技術實現要素：
5.本發明的一個目的在於提供一種ph中性的均質流動的可注射膠原材料，該材料可以在體內形成具有一定力學強度的膠原水凝膠。本發明的另一個目的在於提供一種可注射膠原材料的製備方法。
6.本發明一種可注射膠原材料的製備方法，其中，依次包括如下步驟：
7.(1)將固體膠原材料溶於水中，充分溶解，離心，取上清液；所述固體膠原材料選自i型、ii型、iii型、v型膠原中的一種或兩種以上的組合；所述上清液中各種類型膠原的總濃度為大於等於0.1wt.％但小於等於5wt.％；
8.(2)在步驟(1)所得上清液中加入模擬體液成份；所述模擬體液成份包括na
+
、k
+
、mg
2+
、ca
2+
、cl-、hco
3-、hpo
42-、so
42-、co
32-、po
43-、h2po
4-中的一種或兩種以上的組合；
9.(3)步驟(2)所得溶液，取上清液；
10.(4)通過鹼性溶液和酸性溶液調節步驟(3)所得上清液的ph值的最終範圍至大於等於6.0但小於等於8.0；
11.(5)離心步驟(4)所得溶液，取上清液；
12.(6)在步驟(5)所得上清液中加入保護分子；所述保護分子包括十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、吐溫、曲拉通、乙二醇、苯丙氨酸、脯氨酸、卵磷脂、穀氨酸、賴氨酸、半胱
氨酸、芒果苷、甘氨酸、天冬氨酸、正丁醇、丙二醇、乙二胺四乙酸鈉鹽、硬脂酸、司盤、甘油和明膠中的至少一種；
13.(7)將步驟(6)所得溶液進行低溫輻照處理；
14.(8)離心步驟(7)所得溶液，取上清液。
15.本發明一種可注射膠原材料的製備方法，其中，所述步驟(3)、步驟(5)和步驟(8)中離心的轉速為1000
–
10000rpm。由於製備過程中不可避免的會發生膠原分子自組裝形成膠原纖維的現象，為了滿足材料可注射的要求，採用離心的方式可以去除膠原水溶液中的不溶物，並根據注射針頭的大小選擇合適的離心轉速，如8g針頭選擇1000rpm離心轉速即可滿足注射要求，21g針頭選擇3000rpm離心轉速即可滿足注射要求。
16.本發明一種可注射膠原材料的製備方法中，步驟(4)中所述酸性溶液包括水楊酸、乳酸、硫酸、酒石酸、檸檬酸、磷酸、草酸、乙酸、乙二酸、琥珀酸、鹽酸、馬來酸、苯甲酸、硝酸、蘋果酸、煙酸、磷酸二氫鈉和甲酸中的至少一種；所述鹼性溶液包括四甲基乙二胺、氫氧化鈉、三乙胺、碳酸鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氨水、磷酸氫二鈉和碳酸氫鈉中的至少一種。選擇合適的酸性溶液或鹼性溶液主要為了調控膠原水溶液的ph值至體內注射可允許的範圍；由於人體正常ph值為7.35-7.45，膠原分子在此範圍內很容易自組裝形成不溶物堵塞注射針頭，因此，酸性溶液或鹼性溶液偏重選擇弱酸或弱鹼，可以與膠原水溶液中添加的模擬體液成份和保護分子發生協同作用，減弱膠原分子的自組裝行為，利於膠原水溶液通過注射形式使用。
17.本發明一種可注射膠原材料的製備方法中，所述步驟(4)中上清液的ph值最終範圍為大於等於6.8但小於等於7.8。將膠原水溶液ph值調控至人體正常ph值範圍附近，確保材料注射進入體內具有良好的組織相容性。
18.與現有技術相比，本發明一種可注射膠原材料的製備方法，首先選擇合適的膠原類型、控制膠原總濃度，其次添加模擬體液成份、通過鹼性溶液或酸性溶液調控ph值、添加保護分子等步驟相互協同，且在過程中多次離心以去除膠原水溶液中的不溶物，可以確保膠原水溶液保持均質流動性，其中膠原分子不發生聚集堵塞針頭，即使經過輻照處理，膠原分子也不會交聯堵塞針頭，經本製備方法可得到ph中性的均質流動的可注射膠原材料，該材料注射後可在體內形成具有一定力學強度的膠原水凝膠。
19.本發明一種可注射膠原材料，使用上述可注射膠原材料的製備方法所製備。
20.本發明一種可注射膠原材料，其中，可注射膠原材料可以通過8
–
34g的針頭進行體內注射；優選地，所述可注射膠原材料可以通過21
–
32g的針頭進行體內注射；優選地，所述可注射膠原材料可以通過25
–
30g的針頭進行體內注射。由於應用場景的差異，使用本發明一種可注射膠原材料時需要選擇不同規格的針頭，比如，體內空腔填充可以選擇10g針頭，內徑大約2.69mm，面部微整形注射可以選擇32g針頭，內徑大約0.11mm，因此，需要調控制備方法中的關鍵參數，確保膠原水溶液的均質流動性，不發生堵塞針頭的問題。
21.本發明一種可注射膠原材料，其中，所述可注射膠原材料經注射進入體內後可以形成膠原水凝膠，所述膠原水凝膠的壓縮模量範圍為0.1
–
20kpa。由於本發明一種可注射膠原材料在注射前膠原分子沒有自組裝形成膠原纖維，也沒有經過輻照處理發生交聯反應，因此，注射後可以在體內溫度條件下通過膠原分子的聚集等相互作用形成具有一定力學強度的膠原水凝膠，而不會如非均質的膠原纖維懸浮水溶液那樣膠原分子已經在注射前發生
聚集而無法在注射進入體內後無法形成具有一定力學強度的膠原水凝膠。通過控制可注射膠原材料中的膠原濃度調控所形成膠原水凝膠的力學強度。
22.本發明一種可注射膠原材料，與常規可注射膠原材料非均質的膠原纖維懸浮水溶液不同，是利用上述可注射膠原材料的製備方法所製備的，其ph值中性，可均質流動，在體內可以形成具有一定力學強度的膠原水凝膠。
附圖說明
23.圖1為可注射膠原材料的濁度測試圖(圖1a是實施例1樣品，圖1b是實施例2樣品，圖1c是實施例3樣品，圖1d是對比例1樣品，圖1e是對比例2樣品)；
24.圖2為測試可注射膠原材料所用的不同規格的針頭；
25.圖3可注射膠原材料裸鼠皮下注射測試。
具體實施方式
26.實施例1
27.一種可注射膠原材料的製備方法，其中，依次包括如下步驟：
28.(1)將1g i型膠原溶於1000g水中，充分溶解，經2000rpm離心轉速離心，取上清液；
29.(2)在步驟(1)所得上清液中加入2g khco3、0.01g cacl2、0.5gnah2po4；
30.(3)經1000rpm離心轉速離心步驟(2)所得溶液，取上清液；
31.(4)通過1m琥珀酸、0.5m乙酸和2m碳酸鈉調節步驟(3)所得上清液的ph值至7.2；
32.(5)經3000rpm離心轉速離心步驟(4)所得溶液，取上清液；
33.(6)在步驟(5)所得上清液中加入1％曲拉通、0.5％乙二胺四乙酸鈉鹽和0.2％甘氨酸；
34.(7)將步驟(6)所得溶液進行0℃co
60
輻照處理；
35.(8)經3000rpm離心轉速離心步驟(7)所得溶液，取上清液。
36.由本實施例製備的可注射膠原材料，可以形成均質流動的可注射膠原材料，其中膠原分子以分子狀態充分溶解在水溶液中，可以通過內徑為0.11mm的32g針頭進行注射操作，在注射入體內後可以形成壓縮模量為0.25
±
0.08kpa的膠原水凝膠。
37.實施例2
38.一種可注射膠原材料的製備方法，其中，依次包括如下步驟：
39.(1)將2g ii型膠原和0.1g iii型膠原溶於200g水中，充分溶解，經3000rpm離心轉速離心，取上清液；
40.(2)在步驟(1)所得上清液中加入0.1g nacl、0.1g na2co3、0.1g k3po4；
41.(3)經2000rpm離心轉速離心步驟(2)所得溶液，取上清液；
42.(4)通過0.5m磷酸和0.1m氫氧化鉀調節步驟(3)所得上清液的ph值至6.0；
43.(5)經4000rpm離心轉速離心步驟(4)所得溶液，取上清液；
44.(6)在步驟(5)所得上清液中加入0.4％正丁醇、1％天冬氨酸和2％甘油；
45.(7)將步驟(6)所得溶液進行4℃電子束輻照處理；
46.(8)經5000rpm離心轉速離心步驟(7)所得溶液，取上清液。
47.由本實施例製備的可注射膠原材料，可以形成均質流動的可注射膠原材料，其中
膠原分子以分子狀態充分溶解在水溶液中，可以通過內徑為0.16mm的30g針頭進行注射操作，在注射入體內後可以形成壓縮模量為5.92
±
0.43kpa的膠原水凝膠。
48.實施例3
49.一種可注射膠原材料的製備方法，其中，依次包括如下步驟：
50.(1)將40g i型膠原和0.1gv型膠原溶於500g水中，充分溶解，經6000rpm離心轉速離心，取上清液；
51.(2)在步驟(1)所得上清液中加入0.5g k2so4、1g kh2po4、2g k2co3；
52.(3)經4000rpm離心轉速離心步驟(2)所得溶液，取上清液；
53.(4)通過2m水楊酸和1m三乙胺、1m氨水調節步驟(3)所得上清液的ph值至8.0；
54.(5)經6000rpm離心轉速離心步驟(4)所得溶液，取上清液；
55.(6)在步驟(5)所得上清液中加入0.01％明膠、0.2％乙二醇和1％脯氨酸；
56.(7)將步驟(6)所得溶液進行4℃γ射線輻照處理；
57.(8)經10000rpm離心轉速離心步驟(7)所得溶液，取上清液。
58.由本實施例製備的可注射膠原材料，可以形成均質流動的可注射膠原材料，其中膠原分子以分子狀態充分溶解在水溶液中，可以通過內徑為0.41mm的22g針頭進行注射操作，在注射入體內後可以形成壓縮模量為17.86
±
0.15kpa的膠原水凝膠。
59.在本發明一種可注射膠原材料的製備方法中，步驟(1)中固體膠原材料選自i型、ii型、iii型、v型膠原中的一種或兩種以上的組合，固體膠原材料的選擇不限於實施例1-3公開的類型，還可採用其它類型，如單獨採用ii型、iii型或v型，或者採用i型、ii型、iii型、v型四種的組合等；固體膠原材料的質量也可調整，只要滿足步驟(1)上清液中各種類型膠原的總濃度為大於等於0.1wt.％但小於等於5wt.％即可；膠原總濃度如此選擇的原因在於：如果膠原濃度小於0.1wt.％，在注射後無法在體內形成具有一定力學強度的膠原水凝膠，如果膠原濃度大於5wt.％，膠原水溶液由於粘度過大無法進行注射操作，該膠原總濃度範圍的選擇是使製備的可注射膠原材料滿足注射和使用要求的前提。
60.本發明步驟(2)中模擬體液成份包括na
+
、k
+
、mg
2+
、ca
2+
、cl-、hco
3-、hpo
42-、so
42-、co
32-、po
43-、h2po
4-中的一種或兩種以上的組合，由於膠原蛋白的等電點是7.5～7.8，膠原水溶液在後續ph調控過程中很容易發生膠原分子自組裝形成膠原纖維，容易堵塞注射針頭無法注射，加入模擬體液成份一方面平衡水溶液中的離子強度等減弱膠原分子間的相互作用，另一方面模擬體內環境增強可注射膠原材料的組織相容性。
61.本發明步驟(4)中酸性溶液包括水楊酸、乳酸、硫酸、酒石酸、檸檬酸、磷酸、草酸、乙酸、乙二酸、琥珀酸、鹽酸、馬來酸、苯甲酸、硝酸、蘋果酸、煙酸、磷酸二氫鈉和甲酸中的至少一種；鹼性溶液包括四甲基乙二胺、氫氧化鈉、三乙胺、碳酸鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氨水、磷酸氫二鈉和碳酸氫鈉中的至少一種；選擇合適的酸性溶液或鹼性溶液主要為了調控膠原水溶液的ph值至體內注射可允許的範圍；由於人體正常ph值為7.35-7.45，膠原分子在此範圍內很容易自組裝形成不溶物堵塞注射針頭，因此，酸性溶液或鹼性溶液偏重選擇弱酸或弱鹼，可以與膠原水溶液中添加的模擬體液成份和保護分子發生協同作用，減弱膠原分子的自組裝行為，利於膠原水溶液通過注射形式使用。步驟(4)中上清液的ph值最終範圍為大於等於6.0但小於等於8.0；優選地，步驟(4)中上清液的ph值最終範圍為大於等於6.8但小於等於7.8；將膠原水溶液ph值調控至人體正常ph值範圍附近，確保材料注射進
入體內具有良好的組織相容性。
62.本發明步驟(6)中保護分子包括十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、吐溫、曲拉通、乙二醇、苯丙氨酸、脯氨酸、卵磷脂、穀氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、芒果苷、甘氨酸、天冬氨酸、正丁醇、丙二醇、乙二胺四乙酸鈉鹽、硬脂酸、司盤、甘油和明膠中的至少一種。添加合適的保護分子主要是為了與水溶液中的膠原分子發生氫鍵等弱相互作用，減少膠原分子在輻照過程中發生交聯等反應造成堵塞針頭的可能性，同時，保護分子也減弱了水溶液中膠原分子之間的相互作用，從而減少了膠原分子自組裝形成不溶物堵塞針頭的可能性。
63.本發明步驟(3)、步驟(5)和步驟(8)中離心的轉速為1000
–
10000rpm，由於製備過程中不可避免的會發生膠原分子自組裝形成膠原纖維的現象，為了滿足材料可注射的要求，採用離心的方式可以去除膠原水溶液中的不溶物，並根據注射針頭的大小選擇合適的離心轉速，如8g針頭選擇1000rpm離心轉速即可滿足注射要求，21g針頭選擇3000rpm離心轉速即可滿足注射要求。
64.本發明一種可注射膠原材料，使用上述可注射膠原材料的製備方法所製備。
65.本發明一種可注射膠原材料，其中，可注射膠原材料可以通過8
–
34g的針頭進行體內注射；優選地，可注射膠原材料可以通過21
–
32g的針頭進行體內注射；優選地，可注射膠原材料可以通過25
–
30g的針頭進行體內注射。由於應用場景的差異，使用本發明一種可注射膠原材料時需要選擇不同規格的針頭，比如，體內空腔填充可以選擇10g針頭，內徑大約2.69mm，面部微整形注射可以選擇32g針頭，內徑大約0.11mm，因此，需要調控制備方法中的關鍵參數，確保膠原水溶液的均質流動性，不發生堵塞針頭的問題。
66.本發明一種可注射膠原材料，其中，可注射膠原材料經注射進入體內後可以形成膠原水凝膠，膠原水凝膠的壓縮模量範圍為0.1
–
20kpa。由於本發明一種可注射膠原材料在注射前膠原分子沒有自組裝形成膠原纖維，也沒有經過輻照處理發生交聯反應，因此，注射後可以在體內溫度條件下通過膠原分子的聚集等相互作用形成具有一定力學強度的膠原水凝膠，而不會如非均質的膠原纖維懸浮水溶液那樣膠原分子已經在注射前發生聚集而無法在注射進入體內後無法形成具有一定力學強度的膠原水凝膠。通過控制可注射膠原材料中的膠原濃度調控所形成膠原水凝膠的力學強度。
67.與常規可注射膠原材料非均質的膠原纖維懸浮水溶液不同，本發明一種可注射膠原材料提供一種ph中性的均質流動的可注射膠原材料，在體內可以形成具有一定力學強度的膠原水凝膠。本發明製備方法中添加模擬體液成份、通過鹼性溶液或酸性溶液調控ph值、添加保護分子等步驟相互協同，可以確保膠原水溶液保持均質流動性，其中膠原分子不發生聚集堵塞針頭，即使經過輻照處理，膠原分子也不會交聯堵塞針頭。本發明可注射膠原材料可以均質流動狀態經注射進入體內，形成具有一定力學強度的膠原水凝膠。
68.下面將實施例1-3與對比例1、2對比說明本發明的效果。
69.實施例4
70.可注射膠原材料效果比較試驗
71.一、對比膠原材料的製備
72.對比例1：一種膠原材料的製備方法，其中，依次包括如下步驟：
73.(1)將1g i型膠原溶於1000g水中，充分溶解；
74.(2)在步驟(1)所得上清液中加入2g khco3、0.01g cacl2、0.5gnah2po4；
75.(3)在步驟(2)所得上清液中加入1％曲拉通和0.2％甘氨酸；
76.(4)將步驟(3)所得溶液進行常溫co
60
輻照處理。
77.對比例2：一種膠原材料的製備方法，其中，依次包括如下步驟：
78.(1)將1g i型膠原溶於1000g水中，充分溶解，經2000rpm離心轉速離心，取上清液；
79.(2)通過1m琥珀酸和2m碳酸鈉調節步驟(1)所得上清液的ph值至7.2；
80.(3)經3000rpm離心轉速離心步驟(2)所得溶液，取上清液；
81.(4)將步驟(3)所得溶液進行0℃co
60
輻照處理；
82.(5)經3000rpm離心轉速離心步驟(4)所得溶液，取上清液。
83.二、效果試驗對比
84.(1)可注射膠原材料濁度測試：可注射膠原材料的濁度在濁度儀(tzd-bz-905,suzhou diagvita technology co.,ltd.)上觀察，波長為625nm。測試結果見表1。可注射膠原材料的濁度測試圖見圖1，其中，圖1a是實施例1樣品，圖1b是實施例2樣品，圖1c是實施例3樣品，圖1d是對比例1樣品，圖1e是對比例2樣品。
85.表1可注射膠原材料濁度測試
86.樣品實施例1實施例2實施例3對比例1對比例2濁度(
×
104ntu)0.36
±
0.080.23
±
0.020.39
±
0.064.15
±
0.186.21
±
0.32
87.由表1可知，在實施例1-3可注射膠原材料中，膠原分子保持分子狀態充分溶解在水溶液中，沒有發生聚集形成膠原纖維，水溶液具有均質流動性，水溶液的濁度也很小，圖1a、1b、1c中實施例1、2、3的可注射膠原材料比較透明，可以清晰觀察到注射器刻度；而對比例1-2中膠原分子已聚集形成膠原纖維，形成與常規可注射膠原材料相似的膠原纖維懸浮液，水溶液的濁度偏大，圖1d、1e中對比例1、2的水溶液比較渾濁，無法清晰觀察到注射器刻度。
88.(2)可注射膠原材料通過不同規格針頭的注射測試：採用圖2所示不同規格針頭對實施例1製備的可注射膠原材料進行注射測試，圖中從左至右依次為，22g針頭內徑0.41mm，27g針頭內徑0.21mm，30g針頭內徑0.16mm，32g針頭內徑0.11mm，34g針頭內徑0.06mm。由圖2可知，實施例1製備的可注射膠原材料具有均質流動性，膠原分子沒有聚集形成膠原纖維，因此可以通過以上規格的針頭進行注射操作，不會堵塞針頭。然而，對比例1形成的是膠原纖維懸浮液，為非均質體系，膠原纖維很容易聚集堵塞針頭，無法通過以上規格的針頭進行注射操作。
89.(3)可注射膠原材料裸鼠皮下注射測試：將實施例1可注射膠原材料通過8g針頭進行裸鼠皮下注射測試，由圖3可知，材料可以輕鬆進行注射操作，達到可注射要求。
90.(4)可注射膠原材料體內形成水凝膠壓縮模量測試：將實施例1-3和對比例1-2樣品注射進入小鼠皮下，24小時後將注射材料與小鼠組織分離，對注射材料進行壓力測試。採用單軸力學測試儀(e10000,instron)，負載為1kn，壓縮速度為0.4mm min-1
，溫度為25℃。測試中樣品保持溼潤狀態。樣品尺寸為5mm
×
5mm
×
5mm，壓縮量為30％。壓縮模量通過應力-應變曲線斜率計算得到。測試結果見表2。
91.表2 可注射膠原材料形成水凝膠壓縮模量測試
[0092] 實施例1實施例2實施例3對比例1對比例2壓縮模量(kpa)0.25
±
0.085.92
±
0.4317.86
±
0.15無無
[0093]
由表2可知，實施例1-3可注射膠原材料保持均質流動的水溶液狀態，在小鼠體內可以形成具有一定力學強度的膠原水凝膠，而對比例1-2中膠原水溶液實際為膠原纖維懸浮液，在小鼠體內無法形成膠原水凝膠，為無定形狀態，無法測試其壓縮模量。
[0094]
結合上述試驗可知，實施例1-3與對比例1-2比較，實施例1-3可以形成均質流動的可注射膠原材料，其中膠原分子以分子狀態充分溶解在水溶液中，可以通過內徑更小的針頭進行注射操作，在注射入體內後可以形成具有一定力學強度的膠原水凝膠；而對比例1-2形成的是膠原纖維懸浮液，其中膠原分子已聚集形成膠原纖維，不具有均質性，在注射入體內後無法形成膠原水凝膠。
[0095]
以上所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方案做出的各種變形和改進，均應落入本發明權利要求書確定的保護範圍內。