李斯特菌疫苗治療以後的抑制細胞功能抑制的製作方法

2023-10-29 17:12:47

李斯特菌疫苗治療以後的抑制細胞功能抑制的製作方法
【專利摘要】本發明提供了使用活減毒李斯特菌在具有疾病的受試者中抑制細胞介導的抗疾病浸潤性T淋巴細胞的抑制的方法和組合物。
【專利說明】李斯特菌疫苗治療以後的抑制細胞功能抑制

【技術領域】
[0001] 本發明提供了使用活減毒李斯特菌（Listeria)在具有疾病的受試者中抑制細胞 介導的抗疾病浸潤性T淋巴細胞的抑制的方法和組合物。

【背景技術】
[0002] 單核細胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes,Lm)是一種細胞內病原體，其 主要感染抗原呈遞細胞，且已經適應生活在這些細胞的細胞質中。單核細胞增生李斯特菌 和它產生的被稱作李斯特菌溶血素O(LLO)的蛋白具有強佐劑性能，其與用於基於細胞的 免疫療法的大多數佐劑不同，可以在提供抗原特異性的治療以後施用。
[0003] Treg在周圍自身耐受性的維持中起關鍵作用。天然存在的⑶4+CD25hiTreg在胸腺 中產生並表達FoxP3,所述FoxP3為Treg譜系身份和抑制劑功能的建立和維持所必需的轉 錄因子。Treg可以積累在疾病部位，在此處它們抑制疾病特異性的T細胞的效應子功能。 當這發生時，它可以導致疾病的增加，儘管存在適當抗原或不活化以攻擊那些抗原的T細 胞。增加的浸潤腫瘤的FoxP3+Treg的密度已經與不同實體瘤（包括胰腺癌、卵巢癌和肝細 胞癌）中的預後不良相關聯。Treg的消除會在鼠模型中導致增強的抗腫瘤免疫和腫瘤排 斥，但是也可以導致自身免疫疾病的發展。
[0004] 源自骨髓的抑制細胞（MDSC)是處於不同分化階段的早期骨髓祖細胞、未成熟的 粒細胞、巨噬細胞和樹突細胞的異質群體。這些細胞非常重要，因為它們具有抑制天然殺傷 (NK)和NKT細胞的細胞毒性活性以及由CD8+T細胞介導的適應性免疫應答的能力。儘管NK 細胞抑制的機制目前沒有被較好地理解，但是多個途徑負責MDSC介導的T細胞抑制，包括： 1)精氨酸酶1/ARG1的產生和2) -氧化氮合酶2(N0S2)的增量調節。ARGl和N0S2會代謝 L-精氨酸，並且一起或單獨地阻斷T細胞CD3ζ鏈的翻譯、抑制T細胞增殖和促進T細胞凋 亡。另外，MDSC分泌免疫抑制性的細胞因子並誘導調節性T細胞發育。在小鼠中，將MDSC 廣泛地定義為⑶Ilb+Gr-l/Ly-6G+細胞，但是Ly-6G和Ly-6C的相對表達水平會鑑別出2個 特異性子集。人MDSC共同地表達Siglec-3/⑶33且缺少譜系標誌物和HLA-DR，但是⑶14 和⑶15的異質表達提示存在多個子集。
[0005] MDSC由促炎細胞因子誘導，並且以增加的數目存在於傳染性的和炎症性的病理學 狀況中。它們積累在荷瘤小鼠的血液、骨髓和周圍淋巴樣器官中，並且已經提示，它們在腫 瘤微環境中的存在在促進腫瘤相關的免疫抑制中起成因作用。儘管現在明白MDSC可以充 當用於預防腫瘤進展的靶標，但是需要進一步表徵來確定可以抑制它們的有效機制。
[0006] 本發明提供了如下抑制抑制細胞（諸如Treg和MDSC)的有效機制：提供給荷瘤受 試者施用1次的李斯特菌疫苗，繼續抑制Treg和MDSC功能，由此允許抗腫瘤T細胞複製和 抑制腫瘤生長。


【發明內容】

[0007] 在一個實施方案中，本發明涉及一種在具有疾病的受試者中或在所述受試者內的 疾病部位中增加T浸潤性淋巴細胞/抑制細胞比率的方法，所述方法包括下述步驟：給所述 受試者施用包含活減毒李斯特菌疫苗菌株的組合物。
[0008] 在另一個實施方案中，本發明涉及一種降低受試者的疾病中的抑制細胞百分比的 方法，所述方法包括下述步驟：給所述受試者施用活減毒李斯特菌疫苗菌株。
[0009] 從下述詳細描述實施例和附圖將明白本發明的其它特徵和優點。但是，應當理解， 所述詳細描述和具體實施例儘管指出了本發明的優選實施方案，但是僅僅通過例證給出， 因為本領域技術人員從該詳細描述會明白在本發明的精神和範圍內的各種變化和修改。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 以下附圖形成本說明書的部分，並且被包括以進一步證實本公開內容的某些方 面，通過參考這些附圖中的一個或多個，結合在本文中呈現的具體實施方案的詳細描述，可 以更好地理解所述方面的發明。專利或申請文件至少含有一幅彩色繪製的圖。在請求並支 付必要的費用後，含有彩圖的該專利或專利申請公開文本的複製件將由官方提供。
[0011] 圖1表明，Lm-E7和Lm-LL0-E7使用不同的表達系統來表達和分泌E7。通過將基 因盒引入單核細胞增生李斯特菌基因組的orfZ結構域中來製備Lm-E7 (A)。hly啟動子驅 動hly信號序列和LLO的前5個胺基酸（AA)以及隨後的HPV-16E7的表達。B)通過用質粒 pGG-55轉化prfA-菌株XFL-7,製備Lm-LL0-E7。pGG-55具有驅動LL0-E7的非溶血性融合 體的表達的hly啟動子。pGG-55也含有prfA基因，以選擇XFL-7在體內對質粒的保留。
[0012] 圖 2 表明，Lm-E7 和Lm-LL0-E7 分泌E7。將Lm-Gag(泳道I)、Lm-E7(泳道 2)、Lm-LLO-NP(泳道 3)、Lm-LL0-E7 (泳道 4)、XFL-7 (泳道 5)和 10403S(泳道 6)在 Luria-Bertoni液體培養基中在37°C培養過夜。使相等數目的細菌（通過600nm吸光度 OD確定）沉澱，並將18ml每種上清液進行TCA沉澱。通過蛋白質印跡來分析E7表達。用 抗-E7mAb、隨後用HRP-綴合的抗-小鼠（Amersham)探測該印跡，然後使用ECL檢測試劑顯 影。
[0013] 圖3表明LL0-E7融合體的腫瘤免疫治療效果。顯示了腫瘤接種以後7、14、21、 28和56天小鼠中的腫瘤大小（以毫米計）。原初小鼠：空心圓圈；Lm-LL0-E7 :實心圓圈； Lm-E7 :正方形；Lm-Gag:空心菱形；和Lm-LLO-NP:實心三角形。
[0014] 圖4表明，得自Lm-LL0-E7-免疫的小鼠的脾細胞在暴露於TC-I細胞時繁殖。將 C57BL/6小鼠用Lm-LL0-E7、Lm-E7或對照rLm菌株免疫和強化。在強化後6天收穫脾細胞， 並以顯示的比率與照射的TC-I細胞一起鋪板。將細胞用3H胸苷脈衝處理並收穫。將Cpm 定義為（實驗cpm)-(無TC-I對照）。
[0015] 圖5顯示了（A)證實Lm-ActA-E7分泌E7的蛋白質印跡。泳道I:Lm-LL0-E7 ;泳 道 2 :Lm-ActA-E7. 001 ;泳道 3 ;Lm-ActA-E7-2. 5. 3 ;泳道 4 :Lm-ActA-E7-2. 5. 4。（B)施用了 Lm-ActA-E7 (矩形）、Lm-E7 (橢圓形）、Lm-LL0-E7 (X)和原初小鼠（未接種疫苗；實心三角 形）的小鼠中的腫瘤大小。
[0016] 圖6顯示了（A)用於製備4種LM疫苗的質粒插入片段的示意圖。Lm-LL0-E7插 入片段含有所有使用的李斯特菌基因。它含有hly啟動子、hly基因（其編碼蛋白LL0)的 前I. 3kb和HPV-16E7基因。hly的前I. 3kb包括信號序列（ss)和PEST區域。Lm-PEST-E7 包括hly啟動子、信號序列以及PEST和E7序列，但是不包括截短的LLO基因的剩餘部分。 Lm-APEST-E7不包括PEST區域，但是含有hly啟動子、信號序列、E7和截短的LLO的剩餘 部分。Lm-E7印i僅具有hly啟動子、信號序列、和E7。（B)上圖：含有PEST區域的李斯特 菌構建體誘導腫瘤消退。下圖：在2個單獨實驗中腫瘤攻擊後第28天時的平均腫瘤大小。 (C)含有PEST區域的李斯特菌構建體在脾中誘導更高百分比的E7-特異性的淋巴細胞。描 繪了得自3個實驗的數據的平均值和SE。
[0017] 圖7顯示了⑷在施用TC-I腫瘤細胞並隨後施用Lm-E7、Lm-LL0-E7、Lm-ActA-E7 或不施用疫苗（原初）的小鼠中，脾中E7-特異性的分泌IFN-γ的CD8+T細胞的誘導和穿 透腫瘤的數目。（B)關於（A)描述的小鼠的脾和腫瘤中E7特異性的CD8+細胞的誘導和穿 透。
[0018] 圖8顯示，含有PEST區域的李斯特菌構建體在腫瘤中誘導更高百分比的E7-特異 性的淋巴細胞。（A)得自1個實驗的代表性數據。（B)得自所有3個實驗的數據的平均值 和SE。
[0019] 圖9顯示了大腸桿菌-李斯特菌穿梭質粒pGG55(上面）和pTV3(下面）的示意 圖。CAT(-):大腸桿菌氯黴素轉移酶；CAT(+):李斯特菌氯黴素轉移酶；OriLm:李斯特菌的 複製起點；OriEc:大腸桿菌的pl5複製起點；prfA:李斯特菌致病性調節因子A;LL0 :C-端 截短的李斯特菌溶血素〇,包括它的啟動子；E7:HPVE7 ;p60-dal;p60啟動子和李斯特菌 dal基因的表達盒。還描繪了選擇的限制位點。
[0020] 圖10顯示了存在於李斯特菌菌株E⑶的基因組的inic區域的上遊和下遊的DNA 序列（SEQIDNO: 81)。DNA-up(紅色）、inlC基因（藍色）和DNA-down(黑色）。
[0021] 圖11顯示了被克隆進溫度敏感的質粒PKSV7中以建立iniC缺失突變體的DNA 序列（SEQIDN0:82)。用於克隆這些區域的限制性酶位點用大寫字母表示且標有下劃線。 GAATTC-EcoRI、GGATCC-BamHI和CTGCAg-PstI。將EcoRI-PstI插入序列克隆進載體pKSV7 中。
[0022] 圖12顯示了Lm-dd和Lm-ddDactA菌株的示意圖。凝膠顯示了使用寡物1/2和 寡物3/4的PCR產物的大小，所述寡物使用菌株Lm-dd和Lm-ddΛactA的e染色體DNA作 為模板得到。
[0023] 圖13顯示了存在於李斯特菌染色體的actA基因的上遊和下遊的DNA序列（SEQID NO: 83)。以斜體字顯示的區域含有存在於LmddΛactA菌株中的殘餘actA序列元件。標有 下劃線的序列gtcgac代表XhoI的限制位點，其為actA的N-T和C-T區域之間的連接部。
[0024] 圖14描繪了由LM疫苗菌株（A)的施用引起的腫瘤消退。圓圈代表原初小鼠，倒 三角形代表施用Lmdd-TV3的小鼠，十字叉代表施用Lm-LL0E7的小鼠。
[0025] 圖15顯示了（A)pAdvl64的質粒圖譜，其具有枯草芽孢桿菌dal基因，受組成 型李斯特菌p60啟動子的控制，用於補充LmddA菌株中的染色體dal-dat刪除。它也 含有截短的LLO(1_441)與嵌合人Her2/neu的融合體，所述融合體通過直接融合3個片 Her2/neu:ECl(胺基酸 40-170)、EC2 (胺基酸 359-518)和ICI(胺基酸 679-808)而構 建。（B)通過用抗-LLO抗體印跡的TCA沉澱的細胞培養物上清液的蛋白質印跡分析，在 Lm-LL0-ChHer2 (Lm-LL0-138)和LmddA-LL0-ChHer2 (ADXS31-164)中檢測出tLL0-ChHer2 的 表達和分泌。大約104KD的差異帶對應tLL0-ChHer2。檢測到內源LLO為58KD帶。李斯特 菌對照缺乏ChHer2表達。
[0026] 圖16 (A)使用NT-2細胞作為刺激物並使用3T3/neu細胞作為靶標，試驗Her2/neu 基於李斯特菌的疫苗在得自免疫的小鼠的脾細胞中引起的細胞毒性T細胞應答。Lm-對照 是基於LmddA背景，所述LmddA背景除了表達不相關抗原（HPV16-E7)外，在所有方面都與 所述疫苗相同。（B)在體外用絲裂黴素C處理的NT-2細胞刺激24小時以後，通過ELISA 測得的得自免疫的FVB/N小鼠的脾細胞分泌進細胞培養基中的IFN-γ。（C)響應於與得自 該蛋白質的不同區域的肽一起體外溫育，得自用嵌合疫苗免疫的HLA-A2轉基因小鼠的脾 細胞的IFN-Y分泌。如圖例中列舉，重組ChHer2蛋白用作陽性對照，不相關肽或沒有肽 組構成陰性對照。使用72小時共溫育之後收穫的細胞培養物上清液，通過ELISA測定檢測 IFN-Y分泌。每個數據點是一式三份數據的平均值土標準誤差。*P值〈0.001。
[0027] 圖17呈現了得自Her2/neU轉基因小鼠的結果，所述Her2/neU轉基因小鼠用每 種重組李斯特菌-ChHer2或對照李斯特菌疫苗注射6次。在6周齡開始免疫接種，並且繼 續每三周1次直到第21周。每周監測腫瘤的出現，並且將其表達為無腫瘤小鼠的百分比。 *ρ〈0· 05,N= 9/ 組。
[0028] 圖18顯示了用IxlO6個ΝΤ-2細胞皮下接種FVB/N小鼠，並且用每種疫苗以一周 的間隔免疫3次。在第2次免疫接種之後7天收穫脾。在分離免疫細胞之後，將它們染色 用於通過抗⑶3、⑶4、⑶25和FoxP3抗體檢測Treg。得自代表性實驗的Treg的點圖顯示 了⑶25+/F〇XP3+T細胞的頻率，將其表達為跨不同治療組的總⑶3+或⑶3+⑶4+T細胞的百分 比。
[0029] 圖19顯示了用IxlO6個NT-2細胞皮下接種FVB/N小鼠，並且用每種疫苗以一周 的間隔免疫3次。第2次免疫接種7天後收穫腫瘤。分離免疫細胞之後，將它們染色用於 通過抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗體檢測Treg。（A)得自代表性實驗的Treg的點圖。（B) ⑶25+/F〇XP3+T細胞的頻率，表達為跨不同治療組的總⑶3+或⑶3+⑶4+T細胞的百分比（左 圖）和腫瘤內⑶8/Treg比率（右圖）。將數據顯示為從2個獨立實驗獲得的平均值土SEM。
[0030] 圖20顯示了pAdvl34質粒和雙重質粒的示意圖。指示了將用於克隆抗原I(Xho I和SpeI)和抗原2(XbaI和SacI或BglII)基因的限制位點。黑色箭頭代表轉錄的方向。 pl5ori和R印R表示李斯特菌和大腸桿菌複製起點。tLLO是截短的李斯特菌溶血素0蛋白 (1-441胺基酸），且tActA是截短的ActA(1-233胺基酸）蛋白。芽孢桿菌-dal基因編碼 D-丙氨酸消旋酶，該酶補足LmAdaldat菌株中的D-丙氨酸的合成。
[0031] 圖21顯示了腫瘤中MDSC和Treg的減少。在Lm疫苗接種（LmddAPSA和LmddAE7) 以後的MDSC(右側圖）和Treg(左側圖）的數目。
[0032] 圖22顯示的抑制測定數據證實，在李斯特菌疫苗接種後，得自TPSA23腫瘤的單核 細胞MDSC更少地受到抑制。MDSC的抑制能力的這種變化不是抗原特異性的，因為用PSA-抗 原特異性的T細胞以及用非特異性地刺激的T細胞觀察到相同的抑制減少。無MDSC組顯 示了應答者T細胞當不受刺激時分裂的缺乏，且最後一組顯示了在沒有加入MDSC來抑制分 裂時受刺激的細胞的分裂。左側圖顯示了每組的單個細胞分裂周期。右側圖顯示了合併的 分裂周期。
[0033] 圖23顯示的抑制物測定數據證實，李斯特菌對脾單核細胞MDSC沒有影響，且它們 僅以抗原特異性的方式產生抑制。無MDSC組顯示了應答者T細胞當不受刺激時分裂的缺 乏，且最後一組顯示了在沒有加入MDSC來抑制分裂時受刺激的細胞的分裂。左側圖顯示了 每組的單個細胞分裂周期。右側圖顯示了合併的分裂周期。
[0034] 圖24顯示的抑制物測定數據證實，在李斯特菌疫苗接種後，得自腫瘤的粒細胞 MDSC具有降低的抑制T細胞的能力。MDSC的抑制能力的這種變化不是抗原特異性的，因為 用PSA-抗原特異性的T細胞以及用非特異性地刺激的T細胞觀察到相同的抑制減少。無 MDSC組顯示了應答者T細胞當不受刺激時分裂的缺乏，且最後一組顯示了在沒有加入MDSC 來抑制分裂時受刺激的細胞的分裂。左側圖顯示了每組的單個細胞分裂周期。右側圖顯示 了合併的分裂周期。
[0035] 圖25顯示的抑制物測定數據證實，李斯特菌對脾粒細胞MDSC沒有影響，且它們僅 以抗原特異性的方式產生抑制。無MDSC組顯示了應答者T細胞當不受刺激時分裂的缺乏， 且最後一組顯示了在沒有加入MDSC來抑制分裂時受刺激的細胞的分裂。左側圖顯示了每 組的單個細胞分裂周期。右側圖顯示了合併的分裂周期。
[0036] 圖26顯示的抑制物測定數據證實，得自腫瘤的Treg仍然是抑制性的。在該腫瘤 模型中存在Treg的抑制能力的非抗原特異性的方式的輕微下降。NoTreg組顯示了應答者 T細胞當不受刺激時分裂的缺乏，且最後一組顯示了在沒有加入Treg來抑制分裂時受刺激 的細胞的分裂。左側圖顯示了每組的單個細胞分裂周期。右側圖顯示了合併的分裂周期。
[0037] 圖27顯示的抑制物測定數據證實，脾Treg仍然是抑制性的。NoTreg組顯示了應 答者T細胞當不受刺激時分裂的缺乏，且最後一組顯示了在沒有加入Treg來抑制分裂時受 刺激的細胞的分裂。左側圖顯示了每組的單個細胞分裂周期。右側圖顯示了合併的分裂周 期。
[0038] 圖28顯示的抑制物測定數據證實，常規CD4+T細胞對細胞分裂沒有影響，不論它 們存在於小鼠的腫瘤還是脾中。左側圖和右側圖顯示了合併的分裂周期。
[0039] 圖29顯示的抑制物測定數據證實，在李斯特菌疫苗接種後，得自4T1腫瘤的單核 細胞MDSC具有降低的抑制能力。MDSC的抑制能力的這種變化不是抗原特異性的，因為用 Her2/neu-抗原特異性的T細胞以及用非特異性地刺激的T細胞觀察到相同的抑制減少。無 MDSC組顯示了應答者T細胞當不受刺激時分裂的缺乏，且最後一組顯示了在沒有加入MDSC 來抑制分裂時受刺激的細胞的分裂。左側圖顯示了每組的單個細胞分裂周期。右側圖顯示 了合併的分裂周期。
[0040] 圖30顯示的抑制物測定數據證實，對脾單核細胞MDSC不存在李斯特菌特異性的 作用。無MDSC組顯示了應答者T細胞當不受刺激時分裂的缺乏，且最後一組顯示了在沒有 加入MDSC來抑制分裂時受刺激的細胞的分裂。左側圖顯示了每組的單個細胞分裂周期。右 側圖顯示了合併的分裂周期。
[0041] 圖31顯示的抑制物測定數據證實，在李斯特菌疫苗接種後，得自4T1腫瘤的粒 細胞MDSC具有降低的抑制能力。MDSC的抑制能力的這種變化不是抗原特異性的，因為用 Her2/neu-抗原特異性的T細胞以及用非特異性地刺激的T細胞觀察到相同的抑制減少。無 MDSC組顯示了應答者T細胞當不受刺激時分裂的缺乏，且最後一組顯示了在沒有加入MDSC 來抑制分裂時受刺激的細胞的分裂。左側圖顯示了每組的單個細胞分裂周期。右側圖顯示 了合併的分裂周期。
[0042] 圖32顯示的抑制物測定數據證實，對脾粒細胞MDSC不存在李斯特菌特異性的作 用。無MDSC組顯示了應答者T細胞當不受刺激時分裂的缺乏，且最後一組顯示了在沒有加 入MDSC來抑制分裂時受刺激的細胞的分裂。左側圖顯示了每組的單個細胞分裂周期。右 側圖顯示了合併的分裂周期。
[0043] 圖33顯示的抑制物測定數據證實，在李斯特菌疫苗接種後，得自4T1腫瘤的Treg 的抑制能力下降。該下降不是抗原特異性的，因為用Herf/neu-特異性的和非特異性的應 答者T細胞觀察到所述Treg抑制能力變化。左側圖顯示了每組的單個細胞分裂周期。右 側圖顯示了合併的分裂周期。
[0044] 圖34顯示的抑制物測定數據證實，對脾Treg不存在李斯特菌特異性的作用。應 答者T細胞都能夠分裂，不論它們是否是抗原特異性的。左側圖顯示了每組的單個細胞分 裂周期。右側圖顯示了合併的分裂周期。
[0045] 圖35顯示的抑制物測定數據證實，粒細胞MDSC的抑制能力是由於tLLO的過表 達，且獨立於配偶融合抗原（A-D)。左側圖顯示了每組的單個細胞分裂周期。右側圖顯示了 合併的分裂周期。
[0046] 圖36顯示的抑制物測定數據也證實，單核細胞MDSC的抑制能力是由於tLLO的過 表達，且獨立於配偶融合抗原（A-D)。左側圖顯示了每組的單個細胞分裂周期。右側圖顯示 了合併的分裂周期。
[0047] 圖37顯示的抑制物測定數據證實，在Lm疫苗接種以後，從脾純化的粒細胞MDSC 保留它們的抑制抗原特異性的應答者T細胞的分裂的能力（A，B)。但是，在非特異性的刺激 以後，（用PM/離子黴素）活化的T細胞仍然能夠分裂（C，D)。左側圖顯示了每組的單個 細胞分裂周期。右側圖顯示了合併的分裂周期。
[0048] 圖38顯示的抑制物測定數據證實，在Lm疫苗接種以後，從脾純化的單核細胞MDSC 保留它們的抑制抗原特異性的應答者T細胞的分裂的能力（A，B)。但是，在非特異性的活 化（用PM/離子黴素刺激）以後，T細胞仍然能夠分裂（C，D)。左側圖顯示了每組的單個 細胞分裂周期。右側圖顯示了合併的分裂周期。
[0049] 圖39顯示的抑制物測定數據證實，從Lm-處理組中的任一個的腫瘤純化的Treg 具有稍微減少的抑制應答者T細胞分裂的能力，不論應答細胞是抗原特異性的（A，B)還是 非特異性地活化的（C，D)。左側圖顯示了每組的單個細胞分裂周期。右側圖顯示了合併的 分裂周期。
[0050] 圖40顯示的抑制物測定數據證實，從脾純化的Treg仍然能夠抑制抗原特異性的 (A，B)和非特異性地活化的（C，D)應答者T細胞的分裂。
[0051] 圖41顯示的抑制物測定數據證實，腫瘤Tcon細胞不能抑制T細胞的分裂，不論應 答細胞是抗原特異性的（A，B)還是非特異性地活化的（C，D)。
[0052] 圖42顯示的抑制物測定數據證實，脾Tcon細胞不能抑制T細胞的分裂，不論應答 細胞是抗原特異性的（A，B)還是非特異性地活化的（C，D)。

【具體實施方式】
[0053] 在一個實施方案中，本文提供了在具有疾病的受試者中或在所述受試者內的疾病 部位中增加浸潤性T淋巴細胞/抑制細胞比率的方法。在另一個實施方案中，本文提供了 在具有疾病的受試者中或在所述受試者內的疾病部位中增加CD8+T細胞/抑制細胞的比率 的方法。在另一個實施方案中，所述增加浸潤性T淋巴細胞/抑制細胞比率或CD8+T細胞/ 抑制細胞比率的方法包括以下步驟：給所述受試者施用包含活減毒李斯特菌的組合物或本 發明的重組李斯特菌菌株。
[0054] 在一個實施方案中，本文提供了在具有疾病的受試者中或在所述受試者內的疾病 部位中增加浸潤性T淋巴細胞/T調節細胞比率的方法。在另一個實施方案中，本文提供了 在具有疾病的受試者中或在所述受試者內的疾病部位中增加CD8+T細胞/T調節細胞比率 的方法。在另一個實施方案中，所述增加浸潤性T淋巴細胞/T調節細胞比率或CD8+T細胞/ T調節細胞比率的方法包括以下步驟：給所述受試者施用包含活減毒李斯特菌的組合物或 本發明的重組李斯特菌菌株。
[0055] 在一個實施方案中，本文提供了在具有疾病的受試者中或在所述受試者內的疾病 部位中增加浸潤性T淋巴細胞/源自骨髓的抑制細胞（MDSC)比率的方法。在另一個實施 方案中，本文提供了在具有疾病的受試者中或在所述受試者內的疾病部位中增加CD8+T細 胞/源自骨髓的抑制細胞（MDSC)的比率的方法。在另一個實施方案中，所述增加浸潤性T 淋巴細胞/源自骨髓的抑制細胞（MDSC)比率或CD8+T細胞/源自骨髓的抑制細胞（MDSC) 比率的方法包括以下步驟：給所述受試者施用包含活減毒李斯特菌的組合物或本發明的重 組李斯特菌菌株。
[0056] 在一個實施方案中，所述浸潤性T淋巴細胞是腫瘤浸潤性T淋巴細胞（TIL)。
[0057] 在一個實施方案中，本文提供了減少抑制對疾病的免疫應答的細胞的量的方法。 在另一個實施方案中，所述抑制免疫應答的細胞是抑制細胞。在另一個實施方案中，所述抑 制細胞是源自骨髓的抑制細胞（MDSC)。在另一個實施方案中，所述抑制細胞是T調節細胞 (Treg) 〇
[0058] 人MDSC中的常見血漿標誌物包括⑶33、⑶lib、⑶15、⑶14陰性、II類MHC陰性、 HLADRffiB8_。常見的細胞內標誌物包括精氨酸酶和iNOS。此外，人MDSC的抑制活性或機制包 括一氧化氮（N0)、精氨酸酶或硝基酪氨酸的利用。在小鼠中，源自骨髓的抑制細胞（MDSC) 是CDllb和Gr-I雙重陽性的，且已經被描述為F4/80int、CDllcffi、MHCir/ffi、Ly6C+。具有免 疫抑制能力的⑶llb+/Gr-l+細胞已經被描述為生產IFN-g。MDSC也可以是單核細胞和/ 或粒細胞。
[0059] 在一個實施方案中，腫瘤MDSC可以意外地抑制抗原特異性的和非特異性的T細胞 功能，而脾MDSC僅可以抑制抗原特異性的T細胞的功能。如在下面的實施例中所證實的 (參見實施例17-20)，與在疾病部位（例如，腫瘤部位）處的腫瘤浸潤性淋巴細胞（TIL)的 群體相比，本文提供的活減毒李斯特菌會減少疾病中抑制細胞的百分比。
[0060] Lm或亞裂解劑量的LLO在人上皮Caco-2細胞中會誘導IL-6的表達，所述IL-6會 減少細菌的細胞內生長和造成可誘導的一氧化氮合酶（NOS)的過表達。一氧化氮似乎為針 對Lm的先天性免疫應答的必需組分，在嗜中性粒細胞和巨噬細胞的殺李斯特菌活性中具 有重要作用，可誘導的NO合酶（iNOS)的缺乏會造成Lm感染的易感性。
[0061] Lm感染也會導致穩健的2類MHC限制的⑶4+T細胞應答的產生，並使⑶4+T細胞 的表型轉換為Th-I。此外，針對Lm的功能性的⑶8+T細胞記憶的產生和維持需要⑶4+T細 胞幫助。此外，已經報導，Lm對小鼠的腹膜內感染會造成⑶4+TYS細胞的局部誘導（與腹 腔中的IL-17分泌有關），但是在這些注射以後在脾或淋巴結T細胞群體中沒有觀察到變 化。另外，李斯特菌感染也涉及基本上不是免疫系統的一部分的其它系統，但是其支持免疫 功能以影響治療結果，諸如髓細胞生成和血管內皮細胞功能。
[0062] Lm感染的巨噬細胞會產生TNF-a、IL-18和IL-12,它們都在誘導IFN-Y產生和 隨後在吞噬體中殺死和降解Lm方面是重要的。IL-12缺乏會導致增加的李斯特菌病易感 性，該病可以通過施用IFN-Y來逆轉。NK細胞是早期感染中的IFN-Y的主要來源。在再 感染後，記憶⑶8+Τ細胞具有在沒有同源抗原存在下響應於IL-12和IL-18而產生IFN-γ 的能力。CD8+T細胞與巨噬細胞和Lm-起共同局部化在脾的T細胞區域，在此處，它們獨立 於抗原而產生IFN-γ。CD8+T細胞的IFN-γ產生部分地依賴於LLO的表達。
[0063] IFN-Y在用基於Lm的疫苗所得到的抗腫瘤應答中起重要作用。儘管最初由NK細 胞產生，IFN-γ水平隨後由⑶4+Τ-輔助細胞維持較長時段。Lm疫苗需要IFN-γ才能實現 有效的腫瘤消退，並且淋巴細胞的腫瘤滲入特別需要IFN-γ。在疫苗接種後的早期效應階 段，IFN-Y也會抑制腫瘤部位處的血管生成。
[0064] 在一個實施方案中，LLO具有誘導後天修飾的能力，所述後天修飾影響DNA表達的 控制。在李斯特菌感染的早期階段，細胞外的LLO會誘導組蛋白蛋白Η3的去磷酸化和組蛋 白Η4的類似脫乙醯化。該表現遺傳效應會導致在免疫功能中涉及的某些基因的轉錄減少， 從而提供這樣的機制：LL0通過該機制可以調節免疫應答所需的基因產物的表達。在另一 個實施方案中，LLO的另一種基因組效應是，它的增加NF-κβ易位的能力，所述NF-κβ 易位與ICAM和E-選擇素的表達以及IL-8和MCP-I的分泌有關。在另一個實施方案中，受 LLO影響的另一種信號傳遞級聯是促分裂原活化的蛋白激酶（MPK)途徑，其導致跨細胞膜 的Ca2+流入增加，這會促進李斯特菌向內皮細胞中的進入和它們的後續感染。
[0065] 在一個實施方案中，LLO是炎症性細胞因子（諸如IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、 TNF-α和IFN-γ)、GM-CSF以及N0、趨化因子和共刺激分子（其對於先天性和適應性免疫 應答而言是重要的）的有效誘導物。在一個實施方案中，在有LLO存在下，巨噬細胞會釋放 IL-Ia、TNF-a、IL-12和IL-18,它們又會活化NK細胞以釋放IFN-Y，從而導致增強的巨 噬細胞活化。
[0066] 在一個實施方案中，由細胞溶質的Lm分泌的LLO會在巨噬細胞中造成特異性基因 增量調節，從而導致顯著的IFN-Y轉錄和分泌。在另一個實施方案中，細胞溶質的LLO會 獨立於Toll-樣受體（TLR)而活化針對侵襲性Lm的有效I型幹擾素應答，沒有可檢測的 NF-KB和MAPK活化。
[0067] 在一個實施方案中，本文提供的李斯特菌（Lm)疫苗菌株會減少疾病部位處Treg 和MDSC的百分比，具有在疾病部位處效應細胞與抑制細胞比率的對應遷移。在另一個實施 方案中，本文提供的Lm疫苗可用於如下改善免疫應答：減少在受試者的特定疾病部位處的 Treg和MDSC的百分比以及MDSC的絕對數目。這樣的部位可以是由變態反應、創傷、感染、 疾病引起的炎症部位，或所述部位可以是腫瘤部位。
[0068] 在另一個實施方案中，從李斯特菌處理過的小鼠的腫瘤純化出的單核細胞和粒細 胞MDSC的抑制CD8+T細胞分裂的能力低於從未經處理的小鼠的腫瘤純化出的MDSC，而在用 李斯特菌接種疫苗後，從這些相同荷瘤小鼠的脾純化出的單核細胞和粒細胞MDSC沒有表 現出它們的功能的變化（參見本文中的實施例17-20)。在一個實施方案中，觀察到該效應， 因為脾MDSC僅是抗原特異性的方式產生抑制。因此，使用李斯特菌的治療具有下述獨特優 點：它允許腫瘤抑制細胞諸如Treg和MDSC的腫瘤特異性的抑制。由本文提供的方法和組 合物的活減毒李斯特菌提供的另一個意外優點是，在腫瘤中存在較低量的Treg，並且持續 的那些喪失抑制T細胞複製的能力。
[0069] 在另一個實施方案中，從表達截短LLO的李斯特菌治療的小鼠的腫瘤純化的單核 細胞和粒細胞MDSC具有比從未治療的小鼠的腫瘤純化的MDSC更低的抑制CD8+T細胞分裂 的能力，而在用表達截短LLO的李斯特菌接種疫苗以後，從這些相同荷瘤小鼠的脾純化的 單核細胞和粒細胞MDSC沒有表現出它們的功能的變化（參見本文中的實施例21)。在一個 實施方案中，因為僅以抗原特異性的方式抑制脾MDSC，觀察到該效應。因此，使用表達截短 LLO的李斯特菌的治療具有以下獨特優點：它允許腫瘤抑制細胞（諸如Treg和MDSC)的腫 瘤特異性抑制。由本文提供的方法和組合物的表達截短LLO的活減毒李斯特菌提供的另一 個意外優點是，在腫瘤中存在較小量的Treg和MDSC，和持續喪失抑制T細胞複製的能力的 那些，並且甚至在沒有LLO融合配偶體（諸如異種抗原）存在下觀察到該效應。
[0070] 在另一個實施方案中，施用表達截短LLO的活減毒李斯特菌疫苗會通過抑制 Treg-和MDSC-介導的T細胞抑制而增強抗腫瘤T細胞應答（參見本文中的實施例21)。
[0071] 在一個實施方案中，本文提供了降低受試者的疾病部位中的抑制細胞的百分比的 方法，所述方法包括下述步驟：給所述受試者施用活減毒李斯特菌疫苗菌株。
[0072] 在另一個實施方案中，本文提供了減小受試者的疾病部位中的抑制細胞的抑制T 細胞複製的能力的方法，所述方法包括下述步驟：給所述受試者施用活減毒李斯特菌疫苗 菌株。
[0073] 在一個實施方案中，減少在疾病部位處的抑制細胞的數目會有效地治療所述疾 病。在另一個實施方案中，減少在疾病部位處的抑制細胞的數目會增強在疾病部位處具有 所述疾病的受試者的抗疾病免疫應答。在另一個實施方案中，所述免疫應答是細胞介導的 免疫應答。在另一個實施方案中，所述免疫應答是腫瘤浸潤性的T-淋巴細胞（TIL)免疫應 答。
[0074] 在一個實施方案中，本文提供了降低受試者疾病中的抑制細胞百分比和增強針對 受試者疾病的治療應答的方法，所述方法包括下述步驟：給所述受試者施用活減毒李斯特 菌疫苗菌株，由此降低所述疾病中的抑制細胞百分比和增強針對受試者疾病的治療應答。 [0075] 在另一個實施方案中，本文提供了減小抑制細胞的抑制受試者疾病中的T細胞復 制的能力和增強針對受試者疾病的治療應答的方法，所述方法包括下述步驟：給所述受試 者施用活減毒李斯特菌疫苗菌株。
[0076] 在一個實施方案中，本文提供了減少受試者的疾病中源自骨髓的抑制細胞的數目 的方法，所述方法包括下述步驟：給所述受試者施用活減毒李斯特菌疫苗菌株。
[0077] 在一個實施方案中，術語"降低……的百分比"是在測定中或在免疫應答中的抑制 細胞（Treg或MDSC)的量的表示，由於T浸潤細胞的存在，所述抑制細胞在疾病部位處的存 在減小或減少。
[0078] 在另一個實施方案中，術語"減少……的數目"表示抑制細胞（Treg或MDSC)的絕 對數目，其絕對數目由於本文提供的活減毒李斯特菌的施用或還在本文別處描述的實現類 似作用的其它試劑而已經減小或減少。
[0079] 在一個實施方案中，本文提供的抑制細胞是T調節細胞（Treg)。在另一個實施方 案中，所述抑制細胞是源自骨髓的抑制細胞（MDSC)。
[0080] 在另一個實施方案中，本文提供的活減毒李斯特菌包含重組核酸序列，所述重組 核酸序列包含第一個開放讀碼框和至少第二個開放讀碼框，每個開放讀碼框編碼第一種多 肽和至少第二種多肽，其中所述第一種和所述第二種多肽各自包含與內源性含有PEST的 多肽融合的異種抗原或其功能片段。
[0081] 在一個實施方案中，在單個開放讀碼框中翻譯本文提供的異種抗原或其功能片段 和內源性含有PEST的多肽。在另一個實施方案中，本文提供的每種異種抗原多肽和內源性 含有PEST的多肽在單獨翻譯以後融合。
[0082] 在另一個實施方案中，本文提供的重組核酸還包含編碼第三種多肽的第三個開放 讀碼框，其中所述第三種多肽包含與內源性含有PEST的多肽融合的異種抗原或其功能片 段。
[0083] 在另一個實施方案中，所述含有PEST的多肽是N-端截短的LLO多肽、N-端ActA 多肽或PEST-肽或其功能片段。
[0084] 在另一個實施方案中，所述第一種、第二種或第三種異種抗原或其功能片段由傳 染性病原體或腫瘤細胞表達或從傳染性病原體或腫瘤細胞衍生出。
[0085] 在一個實施方案中，所述第一種、第二種或第三種抗原與局部組織環境有關，所述 局部組織環境進一步與癌症的發展或轉移有關，或者與腫瘤逃避或癌症抗性有關，或者是 血管生成性抗原。
[0086] 在另一個實施方案中，所述異種抗原是在宿主中造成變應性炎症反應的變應原。 [0087] 在另一個實施方案中，本文提供的疾病是局部化的疾病（即，局部化至特定疾病 部位），或是全身性疾病。
[0088] 在另一個實施方案中，所述疾病是傳染性疾病、呼吸或炎性疾病或癌症或腫瘤。 [0089] 在另一個實施方案中，所述傳染性疾病是由下述病原體（但不限於此）中的任一 種造成的疾病：卡介苗/結核病、瘧疾、惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲、間日瘧原蟲、輪狀病毒、霍 舌U白喉-破傷風、百日咳、流感嗜血桿菌、B型肝炎、人乳頭瘤病毒、季節性流感）、A型流感 (HlNl)大範圍流行、麻疹和風疹、腮腺炎、腦膜炎球菌A+C、口服脊髓灰質炎疫苗（單價、二 價和三價）、肺炎球菌、狂犬病、破傷風類毒素、黃熱病、炭疽芽孢桿菌（炭疽）、肉毒稜狀芽 孢桿菌毒素（肉毒中毒）、鼠疫耶爾森菌（瘟疫）、重型天花（天花）和其它有關的痘病毒、 土拉熱弗朗西絲菌（土拉菌病）、病毒性出血熱、沙粒病毒（LCM、胡寧病毒、馬丘波病毒、瓜 納瑞託病毒、拉沙熱）、布尼亞病毒（漢坦病毒屬、裂谷熱）、黃病毒屬（登革熱）、線狀病毒 (伊波拉病毒、馬爾堡病毒）、假鼻疽伯克霍爾德菌、伯內特考克斯體（Q熱）、布魯桿菌屬種 (布魯桿菌病）、鼻疽伯克霍爾德菌（鼻疽）、鸚鵡衣原體（鸚鵡熱）、蓖麻蛋白毒素（來自 菌麻）、產氣莢膜梭菌的ε毒素、葡萄球菌屬腸毒素B、斑疫傷寒熱（普氏立克次體）、其它 立克次體屬、食品和水傳播的病原體、細菌（致腹瀉性的大腸桿菌、致病性的弧菌屬、志賀 氏菌屬種、沙門氏菌屬/卡介苗、空腸彎曲桿菌、小腸結腸炎耶爾森菌）、病毒（杯狀病毒、 A型肝炎、西尼羅病毒、LaCrosse、加利福尼亞腦炎、VEE、EEE、WEE、日本腦炎病毒、科薩努爾 森林病毒、尼帕病毒、漢坦病毒屬、蜱傳出血熱病毒、切昆貢亞病毒、克裡米亞-剛果出血熱 病毒、蜱傳腦炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、單純皰疹病毒（HSV)、人免疫缺陷病毒 (HIV)、人乳頭狀瘤病毒（HPV))、原生動物（小隱孢子蟲、卡晏環孢子蟲、蘭伯賈第蟲、溶組 織內阿米巴、弓形蟲屬）、真菌（微孢子目）、黃熱病、結核病（包括藥物抗性的TB)、狂犬病、 朊病毒、嚴重急性呼吸症候群相關的冠狀病毒（SARS-CoV)、Coccidioidesposadasii、粗球 孢子菌、細菌性陰道病、沙眼衣原體、巨細胞病毒、腹股溝肉芽腫、杜克雷嗜血桿菌、淋病奈 瑟球菌、蒼白密螺旋體、陰道毛滴蟲或本領域已知的在本文中沒有列出的任意其它傳染性 疾病。
[0090] 在另一個實施方案中，所述傳染性疾病是家畜傳染性疾病。在另一個實施方案中， 家畜疾病可以傳播給人類，且被稱作"人畜共患病"。在另一個實施方案中，這些疾病包括、 但不限於：口蹄疫、西尼羅病毒、狂犬病、犬細小病毒、貓白血病病毒、馬流感病毒、傳染性牛 鼻氣管炎（IBR)、偽狂犬病、古典豬瘟（CSF)、由牛的1型牛皰疹病毒（BHV-I)感染造成的 IBR和豬的偽狂犬病（奧爾斯基病）、弓形蟲病、炭疽、水皰性口炎病毒、馬紅球菌、土拉菌 病、瘟疫（鼠疫耶爾森菌）、毛滴蟲屬。
[0091] 在另一個實施方案中，所述呼吸或炎性疾病是哮喘。
[0092] 在不共同施用其它治療劑（諸如抗炎劑或支氣管擴張劑）的情況下，所述活減毒 李斯特菌菌株能夠減輕哮喘徵狀。在另一個實施方案中，本文提供的方法還包括以下步 驟：給受試者共同施用活減毒李斯特菌菌株和一種或多種治療劑。在另一個實施方案中， 所述治療劑是抗哮喘劑。在另一個實施方案中，所述藥劑是抗炎劑、非留體類抗炎劑、抗生 素、抗膽鹼能劑、支氣管擴張劑、皮質類固醇、短效β_激動劑、長效β_激動劑、組合吸入劑 (combinationinhalers)、抗組胺劑或它們的組合。
[0093] 在另一個實施方案中，本發明的藥物組合物可以含有活減毒李斯特菌菌株和共同 施用的治療劑。所述活減毒李斯特菌菌株和所述共同施用的治療劑也可以是在不同的藥物 組合物中。
[0094] 在另一個實施方案中，所述藥劑包括吸入皮質類固醇，其包括氟替卡松（Flovent Diskus,FloventHFA)、布地奈德（PulmicortFlexhaler)、莫米松（Asmanex)、氟尼縮松 (Aerobid)、倍氯米松（Qvar)和其它。它們是最常開處方的長期哮喘藥物類型。不同於口 服皮質類固醇，這些皮質類固醇藥物具有相對較低的副作用風險，且就長期應用而言通常 是安全的。
[0095] 所述藥劑可以是白三烯調節劑。這些口服藥物治療包括孟魯司特（順爾寧）、扎魯 司特（安可來）和齊留通（Zyflo,ZyfloCR)。它們幫助預防哮喘徵狀多達24小時。
[0096] 此外，所述藥劑可以是長效β激動劑（LABA)。這些吸入藥物包括沙美特羅 (SereventDiskus)和福莫特羅（ForadilAerolizer)。LABA會打開氣道和減少炎症。但 是，它們已經與嚴重哮喘發作關聯。LABA應當僅與吸入皮質類固醇聯合施用。
[0097] 在一個實施方案中，通過本發明的方法治療的癌症是乳腺癌。在另一個實施方案 中，所述癌症是子宮頸癌。在另一個實施方案中，所述癌症是含有Her2的癌症。在另一個 實施方案中，所述癌症是黑素瘤。在另一個實施方案中，所述癌症是胰腺癌。在另一個實施 方案中，所述癌症是卵巢癌。在另一個實施方案中，所述癌症是胃癌。在另一個實施方案 中，所述癌症是胰腺的癌性病變。在另一個實施方案中，所述癌症是肺腺癌。在另一個實施 方案中，它是多形性膠質母細胞瘤。在另一個實施方案中，它是低氧的實體瘤。在另一個實 施方案中，所述癌症是結腸直腸腺癌。在另一個實施方案中，所述癌症是肺鱗狀腺癌。在另 一個實施方案中，所述癌症是胃腺癌。在另一個實施方案中，所述癌症是卵巢表面上皮腫瘤 (例如其良性的、增生性的或惡性的種類）。在另一個實施方案中，所述癌症是口腔鱗狀細 胞癌。在另一個實施方案中，所述癌症是非小細胞肺癌。在另一個實施方案中，所述癌症是 子宮內膜癌。在另一個實施方案中，所述癌症是膀胱癌。在另一個實施方案中，所述癌症是 頭頸癌。在另一個實施方案中，所述癌症是前列腺癌。每種可能性代表本發明的一個單獨 實施方案。
[0098] 在一個實施方案中，本文提供的異種抗原是HPV-E7。在另一個實施方案中，所述抗 原是HPV-E6。在另一個實施方案中，所述抗原是Her-2/neu。在另一個實施方案中，所述抗 原是NY-ES0-1。在另一個實施方案中，所述抗原是端粒末端轉移酶（TERT)。在另一個實施 方案中，所述抗原是SCCE。在另一個實施方案中，所述抗原是CEA。在另一個實施方案中， 所述抗原是LMP-1。在另一個實施方案中，所述抗原是p53。在另一個實施方案中，所述抗 原是碳酸酐酶（carboxicanhydrase)IX(CAIX)。在另一個實施方案中，所述抗原是PSMA。 在另一個實施方案中，所述抗原是前列腺幹細胞抗原（PSCA)。在另一個實施方案中，所述 抗原是HMW-MAA。在另一個實施方案中，所述抗原是WT-I。在另一個實施方案中，所述抗原 是HIV-lGag。在另一個實施方案中，所述抗原是蛋白水解酶3。在另一個實施方案中，所 述抗原是酪氨酸酶相關蛋白2。在另一個實施方案中，所述抗原是PSA(前列腺特異性的抗 原）。在另一個實施方案中，所述抗原選自HPV-E7、HPV-E6、Her-2、NY-ES0-1、端粒末端轉 移酶（TERT)、SCCE、HMW-MAA、WT-I、HIV-lGag、CEA、LMP-I、p53、PSMA、PSCA、蛋白水解酶 3、 酪氨酸酶相關蛋白2、Mucl、PSA(前列腺特異性的抗原）或它們的組合。
[0099] 在另一個實施方案中，本文提供的異種抗原是腫瘤相關抗原，其在一個實施方案 中是下述腫瘤抗原之一：MAGE(黑素瘤相關抗原E)蛋白，例如MGEUMGE2、MAGE3、MAGE 4、酪氨酸酶；突變體ras蛋白；突變體p53蛋白；p97黑素瘤抗原、與晚期癌症有關的ras肽 或P53肽；與宮頸癌有關的HPV16/18抗原、與乳腺癌有關的KLH抗原、與結直腸癌有關的 CEA(癌胚抗原）、gplOO、與黑素瘤有關的MARTI抗原或與前列腺癌有關的PSA抗原。在另 一個實施方案中，用於本文提供的組合物和方法中的抗原是黑素瘤相關抗原，其在一個實 施方案中為TRP-2、MAGE-l、MAGE-3、gp-100、酪氨酸酶、HSP-70、β-HCG或它們的組合。應 當理解，技術人員能夠使用在本文中沒有提及但是本領域已知用在本文提供的方法和組合 物中的任意異種抗原。
[0100] 在一個實施方案中，本文提供的核酸分子還包含編碼代謝酶的第二個開放讀碼 框。在另一個實施方案中，所述代謝酶補足在重組李斯特菌菌株的染色體中缺少的內源基 因。在另一個實施方案中，由所述第二個開放讀碼框編碼的代謝酶是丙氨酸消旋酶。在一 個實施方案中，所述李斯特菌還包含編碼另一種代謝酶的第三個開放讀碼框。在另一個實 施方案中，由所述第三個開放讀碼框編碼的代謝酶是D-胺基酸轉移酶。在另一個實施方案 中，所述核酸分子包含編碼異種抗原或其片段的第四個讀碼框。
[0101] 在一個實施方案中，所述核酸分子整合進李斯特菌基因組中。在另一個實施方案 中，所述核酸分子是在重組李斯特菌疫苗菌株的質粒中。在另一個實施方案中，在沒有抗生 素選擇存在下，所述質粒穩定地維持在重組李斯特菌疫苗菌株中。在另一個實施方案中，所 述質粒不會給重組李斯特菌賦予抗生素抗性。
[0102] 在一個實施方案中，本文提供了用於轉化李斯特菌以便得到重組李斯特菌的核酸 分子。在另一個實施方案中，本文提供的用於轉化李斯特菌的核酸缺少毒力基因。在另一個 實施方案中，所述核酸分子整合進李斯特菌基因組中且攜帶無功能的毒力基因。在另一個 實施方案中，所述毒力基因在重組李斯特菌中發生突變。在另一個實施方案中，使用所述核 酸分子將存在於李斯特菌基因組中的內源基因滅活。在另一個實施方案中，所述毒力基因 是ActA基因、inlA基因和inlB基因、inlC基因、inlj基因、PlbC基因或PrfA基因。技術 人員會理解，所述毒力基因可以是本領域已知的與重組李斯特菌的毒力有關的任何基因。
[0103] 在一個實施方案中，在所述李斯特菌菌株的染色體中缺少所述代謝基因、所述毒 力基因等。在另一個實施方案中，在所述李斯特菌菌株的染色體中和任意附加型遺傳元件 中缺少所述代謝基因、所述毒力基因等。在另一個實施方案中，在所述毒力菌株的基因組中 缺少所述代謝基因、所述毒力基因等。在一個實施方案中，所述毒力基因在染色體中發生突 變。在另一個實施方案中，所述毒力基因從染色體缺失。每種可能性代表本發明的一個單 獨實施方案。
[0104] 在一個實施方案中，術語"核酸分子"在另一個實施方案中表質粒。在另一個實 施方案中，該術語表示整合載體。在另一個實施方案中，該術語表示包含整合載體的質粒。 在另一個實施方案中，所述整合載體是位點特異性的整合載體。在另一個實施方案中，本發 明的方法和組合物的核酸分子由本領域已知的任意類型的核苷酸組成。每種可能性代表本 發明的一個單獨實施方案。
[0105] 在另一個實施方案中，使用同源重組，將所述構建體或核酸分子整合進李斯特菌 的染色體中。同源重組技術是本領域眾所周知的，且被描述在，例如，BalogluS，BoyleSM, 等人（Immuneresponsesofmicetovacciniavirusrecombinantsexpressingeither ListeriamonocytogenespartiallisteriolysinorBrucellaabortusribosomal L7/L12protein.VetMicrobiol2005,109(1-2):11-7);和JiangLL，SongHH,等人 (CharacterizationofamutantListeriamonocytogenesstrainexpressinggreen fluorescentprotein.ActaBiochimBiophysSin(Shanghai) 2005, 37 (I) : 19-24) 〇 在另一 個實施方案中，如在美國專利號6, 855, 320中所述進行同源重組。在該情況下，通過在hly 啟動子控制下的E7基因的染色體整合，製備表達E7的重組Lm菌株，並且包含hly信號序 列以確保基因產物的分泌，從而產生被稱作Lm-AZ/E7的重組體。在另一個實施方案中，使 用溫度敏感的質粒來選擇所述重組體。每種技術代表本發明的一個單獨實施方案。
[0106] 在另一個實施方案中，使用轉座子插入，將所述構建體或核酸分子整合進李斯 特菌的染色體中。轉座子插入技術是本領域眾所周知的，且由Sun等人（Infectionand Immunity1990, 58:3770-3778)在DP-L967的構建中描述，以及描述在其它文獻中。在另一 個實施方案中，轉座子誘變具有可以形成穩定的基因組插入突變體的優點，但是具有下述 缺點：外源基因在基因組中已經插入的位置是未知的。
[0107] 在另一個實施方案中，使用噬菌體整合位點（LauerP,ChowMY等人，Constructi on,characterization,anduseoftwoListeriamonocytogenessite-specificphage integrationvectors.JBacteriol2002; 184 (15) :4177_86)，將所述構建體或核酸分子 整合進李斯特菌的染色體中。在該方法的某些實施方案中，使用噬菌體（例如U153或PSA 李斯特噬菌體）的整合酶基因和附著位點將異源基因插入對應的附著位點中，後者可以是 基因組中的任何適當的位點（例如comK或argtRNA基因的3'末端）。在另一個實施方案 中，內源原噬菌體從構建體或異源基因整合之前利用的附著位點自愈。在另一個實施方案 中，該方法產生單拷貝整合體。在另一個實施方案中，本發明還包括用於臨床應用的基於噬 菌體的染色體整合系統，其中可以使用對於必需酶（包括、但不限於，d-丙氨酸消旋酶）而 言營養缺陷型的宿主菌株，例如Lmdal(-)dat(-)。在另一個實施方案中，為了避免"噬菌體 自愈步驟"，使用基於PSA的噬菌體整合系統。在另一個實施方案中，這需要用抗生素連續 選擇以維持整合的基因。因而，在另一個實施方案中，本發明能夠建立不需要抗生素選擇的 基於噬菌體的染色體整合系統。相反，可以補足營養缺陷型的宿主菌株。每種可能性代表 本發明的一個單獨實施方案。
[0108] 在另一個實施方案中，從附加型載體表達所述構建體或核酸分子，所述附加型載 體含有編碼LLO、PEST或ActA序列或其功能片段的內源核酸序列。在另一個實施方案中， 所述構建體或核酸分子包含各自編碼第一種多肽和至少第二種多肽的第一個開放讀碼框 和至少第二個開放讀碼框，其中所述第一種多肽和所述至少第二種多肽各自包含與內源性 含有PEST的多肽融合的異種抗原或其功能片段。
[0109] 在另一個實施方案中，本文提供了包含附加型重組核酸分子的重組李斯特菌菌 株，所述核酸分子包含各自編碼第一種多肽和至少第二種多肽的第一個開放讀碼框和至少 第二個開放讀碼框，其中所述第一種多肽和所述至少第二種多肽各自包含與內源性含有 PEST的多肽融合的異種抗原或其功能片段，其中所述核酸還包含編碼質粒複製控制區的開 放讀碼框。
[0110] 在一個實施方案中，本發明提供了一種生產包含附加型表達質粒的重組李斯特菌 菌株的方法，所述附加型表達質粒包含編碼第一種多肽和至少第二種多肽的第一種核酸和 至少第二種核酸，其中所述第一種和所述第二種多肽各自包含與內源性含有PEST的多肽 融合的異種抗原，所述方法包括以下步驟：a)在所述質粒中重組地融合編碼所述第一種多 肽和所述第二種多肽的所述第一種核酸和所述第二種核酸，每種多肽包含與內源性含有 PEST的多肽融合的第一種和第二種異種抗原；b)用所述附加型表達質粒轉化重組李斯特 菌；和c)在有助於重組李斯特菌菌株中的抗原表達的條件下，表達所述第一種抗原和所述 至少第二種抗原。
[0111] 在一個實施方案中，本文提供了生產包含附加型表達質粒的重組李斯特菌菌株的 方法，所述附加型表達質粒包含編碼第一種、第二種和第三種多肽的第一種、第二種和第三 種核酸，其中所述第一種、第二種和第三種多肽各自包含與內源性含有PEST的多肽融合的 異種抗原，所述方法包括下述步驟：a)在所述質粒中重組地融合編碼所述第一種、第二種 和第三種多肽的所述第一種、第二種和第三種核酸，每種多肽包含與內源性含有PEST的 多肽融合的第一種、第二種和第三種異種抗原；b)用所述附加型表達質粒轉化重組李斯特 菌；和c)在有助於重組李斯特菌菌株中的抗原表達的條件下，表達所述第一種、第二種和 第三種抗原。
[0112] 在另一個實施方案中，本發明提供了包含至少一種附加型重組核酸分子的重組李 斯特菌菌株，所述核酸分子包含各自編碼第一種多肽和至少第二種多肽的第一個開放讀碼 框和至少第二個開放讀碼框，其中所述第一種多肽和所述至少第二種多肽各自包含與內源 性含有PEST的多肽融合的異種抗原或其功能片段，其中所述核酸還包含編碼質粒複製控 制區的開放讀碼框。在另一個實施方案中，所述質粒控制區調節附加型重組核酸分子的復 制。
[0113] 在另一個實施方案中，所述質粒控制區包含編碼轉錄阻遏物的開放讀碼框，所述 轉錄阻遏物抑制來自所述第一種核酸分子或至少第二種核酸分子的異種抗原表達。在另一 個實施方案中，所述質粒控制區包含編碼轉錄誘導物的開放讀碼框，所述轉錄誘導物誘導 來自所述第一種核酸分子或至少第二種核酸分子的異種抗原表達。在另一個實施方案中， 所述質粒控制區包含編碼轉錄阻遏物的開放讀碼框，所述轉錄阻遏物抑制來自所述第一 種、第二種或第三種核酸分子的異種抗原表達。在另一個實施方案中，所述質粒控制區包含 編碼轉錄誘導物的開放讀碼框，所述轉錄誘導物誘導來自所述第一種、第二種或第三種核 酸分子的異種抗原表達。
[0114] 在一個實施方案中，存在不同類型的轉錄調節，這些包括"負控制"和"正控制"。在 負控制中，調節蛋白或阻遏蛋白結合操縱基因並阻止RNA聚合酶適當地結合啟動子序列。 可替換地，可以以無活性形式合成阻遏蛋白（因為它不可阻斷RNA聚合酶結合啟動子），然 後將阻遏物活化以通過輔阻遏物的結合來阻止RNA聚合酶結合啟動子。這類控制最常見於 合成代謝途徑（例如，精氨酸生物合成）中，其中輔阻遏物經常是合成代謝途徑的終產物。 可替換地，阻遏蛋白以活性形式合成，結合操縱基因並阻止RNA聚合酶結合啟動子。當誘導 物結合阻遏物時，所述阻遏物變成無活性的，因此RNA聚合酶現在可自由地開始轉錄。這類 控制最常見於分解代謝途徑（例如，乳糖分解代謝）中。所述誘導物經常呈將要降解的底 物的形式。在正控制中，調節蛋白（被稱作激活蛋白）結合操縱基因，且活化劑分子穩定化 與啟動子區域結合的RNA聚合酶。這類的一個例子包括阿拉伯糖分解代謝。調節蛋白（對 於正調節和負調節）由調節基因編碼，且可以在低水平連續合成。可以使它們成為自調節， 由此高濃度的調節蛋白（與高質粒生產量有關）結合它自己的操縱基因並抑制RNA聚合酶 與啟動子序列的結合。這會停止轉錄直到它的水平下降。這些類型的調節的幾個例子包括 乳糖操縱子、精氨酸操縱子、白喉毒素基因調節系統等。轉錄阻遏物及其使用方法是本領域 容易地已知的，且被預見到用在本發明中。
[0115] 在另一個實施方案中，所述質粒複製調節區域能夠調節從所述第一種或所述至少 第二種核酸分子中的每一種表達外源異種抗原。在另一個實施方案中，所述質粒複製調節 區域能夠調節從所述第一種、第二種或第三種核酸分子中的每一種表達外源異種抗原。
[0116] 在一個實施方案中，通過做出本發明時本領域已知的任意方式測量代謝負荷，所 述方式包括、但不限於：測量疫苗菌株的生長速率、光密度讀數、菌落形成單位（CFU)鋪板 等。在另一個實施方案中，通過測量細菌細胞的生存力，確定所述細菌細胞上的代謝負荷。 測量細菌生存力的方法是本領域容易地已知的和可得到的，其中的一些包括、但不限於：細 菌鋪板進行生存力計數，測量ATP，和流式細胞計量術。在ATP染色中，檢測是基於使用螢光 素酶反應來測量來自活細胞的ATP的量，其中細胞中ATP的量與細胞生存力相關聯。關於 流式細胞計量術，可以以不同的方式使用該方法，這也是本領域已知的，例如在使用生存力 染料以後，所述生存力染料不會被活細菌細胞包含且被死細菌細胞吸收或吸附。技術人員 會容易地理解，在本發明中可以使用本領域已知的用於測量細菌生存力的這些和任意其它 方法。應當理解，技術人員能夠實現在做出本發明時本領域可得到的用於測量疫苗菌株的 生長速率或疫苗菌株對標記基因的表達的知識，所述知識能夠確定表達多種異種抗原或其 功能片段的疫苗菌株的代謝負荷。
[0117] 在另一個實施方案中，所述"功能片段"是免疫原性片段，並在單獨地或在本文提 供的疫苗組合物中施用給受試者時引起免疫應答。在另一個實施方案中，功能片段具有如 技術人員將理解的和如本文中進一步提供的生物活性。
[0118] 在一個實施方案中，術語"至少第二種核酸分子"表示2種或更多種核酸分子，可 替換地它表不3種、4種、5種等核酸分子。
[0119] 在另一個實施方案中，所述重組核酸分子還包含編碼第三種多肽的第三個開放讀 碼框，其中所述第三種多肽包含與內源性含有PEST的多肽融合的異種抗原或其功能片段。
[0120] 在一個實施方案中，本文提供了遞送至少2種抗原的多價質粒。在另一個實施方 案中，所述質粒是雙重質粒。在另一個實施方案中，本文提供了編碼多價質粒的附加型重組 核酸。在另一個實施方案中，所述附加型重組核酸主鏈由包含SEQIDNO: 1的序列編碼。在 另一個實施方案中，由SEQIDNO: 1組成的序列編碼本文提供的附加型重組核酸。在另一 個實施方案中，由SEQIDNO: 1所述的序列編碼本文提供的附加型重組核酸。
[0121] ggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggaga aaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacg ctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatac ttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatct gacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtg cgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctga cactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgcc ttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattg atttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcct ccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttc gttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttct agccctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaacatttgttaatgacgtcaa 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[0122] 在一個實施方案中，所述多價質粒骨架包含編碼至少2種抗原的至少2種核酸序 列。在另一個實施方案中，所述重組附加型核酸編碼質粒骨架序列和至少2種抗原。在另 一個實施方案中，所述抗原是攜帶所述質粒的細菌宿主的異種抗原。在另一個實施方案中， 所述抗原是攜帶所述質粒的李斯特菌宿主的異種抗原。在另一個實施方案中，所述編碼質 粒骨架和至少2種異種抗原的重組附加型核酸序列包含SEQIDNO:2。在另一個實施方案 中，所述編碼質粒骨架和至少2種異種抗原的重組附加型核酸序列由SEQIDN0:2組成。
[0123] ggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggaga aaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacg ctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatac ttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatct gacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtg cgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctga cactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgcc ttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattg atttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcct ccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttc gttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttct agccctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaacatttgttaatgacgtcaa 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agtttgacatgtgacagtgtcgaatgcagggtaaatgccggacgcagctgaaacggtatctcgtccgacatgtcage agacgggcgaaggccatacatgccgatgccgaatctgactgcattaaaaaagccttttttcagccggagtccagcgg cgctgttcgcgcagtggaccattagattctttaacggcagcggagcaatcagctctttaaagcgctcaaactgcatt aagaaatagcctctttctttttcatccgctgtcgcaaaatgggtaaatacccctttgcactttaaacgagggttgcg gtcaagaattgccatcacgttctgaacttcttcctctgtttttacaccaagtctgttcatccccgtatcgaccttca gatgaaaatgaagagaaccttttttcgtgtggcgggctgcctcctgaagccattcaacagaataacctgttaaggtc acgtcatactcagcagcgattgccacatactccgggggaaccgcgccaagcaccaatataggcgccttcaatccctt tttgcgcagtgaaatcgcttcatccaaaatggccacggccaagcatgaagcacctgcgtcaagagcagcctttgctg tttctgcatcaccatgcccgtaggcgtttgctttcacaactgccatcaagtggacatgttcaccgatatgttttttc atattgctgacattttcctttatcacggacaagtcaatttccgcccacgtatctctgtaaaaaggttttgtgctcat ggaaaactcctctcttttttcagaaaatcccagtacgtaattaagtatttgagaattaattttatattgattaatac taagtttacccagttttcacctaaaaaacaaatgatgagataatagctccaaaggctaaagaggactataccaacta tttgttaat(SEQIDN0:2)〇
[0124] 在另一個實施方案中，由在SEQIDN0:2內的序列編碼的抗原之一是E7(在SEQ IDN0:2中用粗體表示）。在另一個實施方案中，所述E7序列闡述在SEQIDN0:3中
[0125] Ctcgagcatggagatacacctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagagacaactgatct ctactgttatgagcaattaaatgacagctcagaggaggaggatgaaatagatggtccagctggacaagcagaaccg gacagagcccattacaatattgtaaccttttgttgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcaca cacgtagacattcgtactttggaagacctgttaatgggcacactaggaattgtgtgccccatctgttctcagaaa ccataaactagt(SEQIDN0:3)〇
[0126] 在一個實施方案中，由在SEQIDN0:2內的序列編碼的抗原之一是嵌合的 Her2-neu抗原（在SEQIDN0:2中用斜體表示）。在另一個實施方案中，所述嵌合的 Her2_neu序列闡述在SEQIDN0:4中
[0127] ctagtggtgatggtgatgatggagctcagatctgtctaagaggcagccatagggcataagctgtgtcac cagctgcaccgtggatgtcaggcagatgcccagaaggcgggagacatatggggagcccacaccagccatcacgtatg cttcgtctaagatttctttgttggctttgggggatgtgttttccctcaacactttgatggccactggaattttcaca ttctccccatcagggatccagatgcccttgtagactgtgccaaaagcgccagatccaagcaccttcaccttcctcag ctccgtctctttcaggatccgcatctgcgcctggttgggcatcgctccgctaggtgtcagcggctccaccagctccg tttcctgcagcagtctccgcatcgtgtacttccggatcttctgctgccctcgggcgcacagctggtggcaggccagg ccctcgcccacacactcgtcctctggccggttggcagtgtggagcagagcttggtgcgggttccgaaagagctggtc ccagggcaccgtgtgcacgaagcagaggtgggtgttatggtggatgagggccagtccactgcccagttccctcagtg agcgcagccccagccagctgatgcccagcccttgcagggtcagcgagtaggcgccattgtgcagaattcgtccccgg attacttgcaggttctggaagacgctgaggtcaggcaggctgtccggccatgctgagatgtataggtaacctgtgat ctcttccagagtctcaaacacttggagctgctctggctggagcggggcagtgttggaggctgggtccccatcaaagc tctccggcagaaatgccaggctcccaaagatcttcttgcagccagcaaactcctggatattcttccacaaaatcgtg tcctggtagcagagctgggggttccgctggatcaagacccctcctttcaagatctctgtgaggcttcgaagctgcag ctcccgcaggcctcctggggaggcccctgtgacaggggtggtattgttcagcgggtctccattgtctagcacggcca gggcatagttgtcctcaaagagctgggtgcctcgcacaatccgcagcctctgcagtgggacctgcctcacttggttg tgagcgatgagcacgtagccctgcacctcctggatatcctgcaggaaggacaggctggcattggtgggcaggtaggt gagttccaggtttccctgcaccacctggcagccctggtagaggtggcggagcatgtccaggtgggttctagat(SEQ IDN0:4)〇
[0128] 在另一個實施方案中，"代謝酶"表示，在宿主細菌需要的營養物的合成中涉及的 酶。在另一個實施方案中，該術語表示宿主細菌需要的營養物的合成所需的酶。在另一個 實施方案中，該術語表示在宿主細菌所利用的營養物的合成中涉及的酶。在另一個實施方 案中，該術語表示在宿主細菌的持續生長所需的營養物的合成中涉及的酶。在另一個實施 方案中，所述酶是營養物的合成所必需的。每種可能性代表本發明的一個單獨實施方案。
[0129] 在另一個實施方案中，"穩定地維持"表示，在沒有選擇（例如抗生素選擇）存在 下，核酸分子或質粒維持10代，而沒有可檢測的丟失。在另一個實施方案中，所述時段是15 代。在另一個實施方案中，所述時段是20代。在另一個實施方案中，所述時段是25代。在 另一個實施方案中，所述時段是30代。在另一個實施方案中，所述時段是40代。在另一個 實施方案中，所述時段是50代。在另一個實施方案中，所述時段是60代。在另一個實施方 案中，所述時段是80代。在另一個實施方案中，所述時段是100代。在另一個實施方案中， 所述時段是150代。在另一個實施方案中，所述時段是200代。在另一個實施方案中，所述 時段是300代。在另一個實施方案中，所述時段是500代。在另一個實施方案中，所述時段 是很多代。在另一個實施方案中，所述核酸分子或質粒在體外（例如在培養物中）穩定地 維持。在另一個實施方案中，所述核酸分子或質粒在體內穩定地維持。在另一個實施方案 中，所述核酸分子或質粒在體外和在體內穩定地維持。每種可能性代表本發明的一個單獨 實施方案。
[0130] 在另一個實施方案中，本文提供的方法和組合物的代謝酶是胺基酸代謝酶，在另 一個實施方案中，所述代謝酶是丙氨酸消旋酶。在另一個實施方案中，所述代謝酶是D-氨 基酸轉移酶。在另一個實施方案中，所述代謝酶會催化在重組李斯特菌菌株中用於細胞壁 合成的胺基酸的形成，在另一個實施方案中，所述代謝酶是丙氨酸消旋酶。
[0131] 在另一個實施方案中，在李斯特菌p60啟動子控制下，表達編碼所述代謝酶的基 因。在另一個實施方案中，使用inlA(編碼內化蛋白）啟動子。在另一個實施方案中，使用 hly啟動子。在另一個實施方案中，使用ActA啟動子。在另一個實施方案中，在任意其它革 蘭氏陽性的啟動子控制下，表達所述整合酶基因。在另一個實施方案中，在任意其它在李斯 特菌中起作用的啟動子的控制下，表達編碼所述代謝酶的基因。技術人員會明白，可以使用 其它啟動子或多順反子表達盒來驅動所述基因的表達。每種可能性代表本發明的一個單獨 實施方案。
[0132] 在一個實施方案中，所述活減毒李斯特菌是重組李斯特菌。在另一個實施方案中， 所述重組李斯特菌包含基因組內化蛋白C(inlC)基因、anActA基因、aPlcA基因、PrfA基 因或PlcB基因的突變或缺失。在另一個實施方案中，所述重組李斯特菌包含基因組actA 基因和基因組內化蛋白C基因的突變或缺失。
[0133] 在一個實施方案中，所述重組李斯特菌菌株已經通過動物宿主傳代。在另一個實 施方案中，所述動物宿主是非人動物宿主。在另一個實施方案中，所述傳代會最大化所述菌 株作為疫苗載體的效力。在另一個實施方案中，所述傳代會穩定化李斯特菌菌株的免疫原 性。在另一個實施方案中，所述傳代會穩定化李斯特菌菌株的毒力。在另一個實施方案中， 所述傳代會增加李斯特菌菌株的免疫原性。在另一個實施方案中，所述傳代會增加李斯特 菌菌株的毒力。在另一個實施方案中，所述傳代會除去李斯特菌菌株的不穩定亞株。在另 一個實施方案中，所述傳代會減少李斯特菌菌株的不穩定亞株的流行。在另一個實施方案 中，所述傳代會使菌株減毒，或在另一個實施方案中，使得菌株具有更低的毒力。通過動物 宿主傳代重組李斯特菌菌株的方法是本領域眾所周知的，且描述在例如美國專利申請系列 號10/541,614中。每種可能性代表本文提供的方法和組合物的一個單獨實施方案。
[0134] 在一個實施方案中，本發明提供了用於預防疾病、治療疾病和給人受試者接種疫 苗的方法和組合物。
[0135] 在另一個實施方案中，本發明涉及增強人的抗腫瘤免疫應答。在另一個實施方案 中，通過施用本文提供的組合物而增強受試者中的抗腫瘤應答的方法可以與其它已知的抗 腫瘤或抗癌療法相組合。在另一個實施方案中，Lm-LLO可以單獨使用，或者與其中佐劑為 適當的任意療法聯合使用，且可以用於通常不使用佐劑的場合，諸如化學療法或放射療法。
[0136] 在另一個實施方案中，本文提供的李斯特菌菌株還包含編碼代謝酶的第三個開放 讀碼框。
[0137] 在一個實施方案中,所述代謝酶是胺基酸代謝酶。在另一個實施方案中,所述由第 二開放讀碼框編碼的代謝酶是丙氨酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。在另一個實施方案中，所 述由第三開放讀碼框編碼的代謝酶是丙氨酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。在另一個實施方 案中，所述代謝酶由dal基因編碼，而在另一個實施方案中，所述dal基因得自枯草芽孢杆 菌。在另一個實施方案中，所述代謝酶由dat基因編碼。
[0138] 在另一個實施方案中，所述重組李斯特菌是減毒的營養缺陷型菌株。
[0139] 在一個實施方案中，所述減毒的菌株是Lmdal(_)dat(_) (Lmdd)。在另一個實施方 案中，所述減毒的菌株是Lmdal(_)dat(_)δactA(LmddA)。LmddA是基於這樣的李斯特菌 疫苗載體：其由於毒力基因actA的缺失而減毒，且通過dal基因的互補而保留期望的異種 抗原或截短的LLO體內和體外表達所需的質粒。
[0140] 在另一個實施方案中，所述減毒的菌株是Lmdda。在另一個實施方案中，所述減毒 的菌株是LmΛactA。在另一個實施方案中，所述減毒的菌株是LmΛPrfA。在另一個實施方 案中，所述減毒的菌株是LmΛPlcB。在另一個實施方案中，所述減毒的菌株是LmΛPlcA。在 另一個實施方案中，所述菌株是上述菌株中的任一種的二重突變體或三重突變體。在另一 個實施方案中，該菌株發揮強佐劑作用，後者是基於李斯特菌的疫苗的固有性質。在另一個 實施方案中，該菌株從EGD李斯特菌骨架構建得到。在另一個實施方案中，在本發明中使用 的菌株是表達非溶血性LLO的李斯特菌菌株。在另一個實施方案中，所述李斯特菌菌株是 PrfA突變體、ActA突變體、plcB缺失突變體、或缺少plcA和plcB的雙重突變體。所有這 些李斯特菌菌株被預見到用於本文提供的方法中。每種可能性代表本發明的一個單獨實施 方案。
[0141] 在一個實施方案中，李斯特菌向鄰近細胞的易位通過actA基因和/或inlC基因 (它們二者都涉入該過程）的缺失受到抑制，由此導致意外高水平的減毒、增加的免疫原性 和作為疫苗骨架的實用性。
[0142] 在一個實施方案中，本文提供的重組李斯特菌菌株是減毒菌株。在另一個實施方 案中，所述重組李斯特菌缺少ActA毒力基因。在另一個實施方案中，所述重組李斯特菌缺 少PrfA毒力基因。
[0143] 在另一個實施方案中，所述重組李斯特菌疫苗菌株包含佐劑，其中所述佐劑是李 斯特菌溶血素0。在另一個實施方案中，所述重組李斯特菌疫苗菌株包含佐劑，其中所述佐 劑是ActA。在另一個實施方案中，所述重組李斯特菌疫苗菌株包含佐劑，其中所述佐劑是 PEST胺基酸序列。
[0144] 在另一個實施方案中，本文提供的方法進一步提供了克服或"破壞"對作為自體抗 原的異種抗原的耐受性的方法。這樣的抗原可以由多種腫瘤異常地表達，使用本文提供的 方法和組合物對所述腫瘤進行在本發明的範圍內的治療或預防。
[0145] 在一個實施方案中，由本文提供的方法和組合物誘導的免疫應答是治療性免疫應 答。在另一個實施方案中，它是預防性免疫應答。在另一個實施方案中，與本領域可用於在 罹患本文提供的病症的受試者中誘導免疫應答的方法相比，它是增強的免疫應答。在另一 個實施方案中，所述免疫應答會導致折磨受試者的本文提供的腫瘤的清除。
[0146] 在一個實施方案中，與其它治療模態相組合的表達截短的李斯特菌溶血素0的重 組減毒李斯特菌可用於增強免疫應答，和用於預防和治療疾病，包括癌症或實體瘤。在一個 實施方案中，與其它治療模態相組合的表達截短的ActA的重組減毒李斯特菌可用於增強 免疫應答，和用於預防和治療疾病，包括癌症或實體瘤。在一個實施方案中，與其它治療模 態相組合的表達PEST胺基酸序列的重組減毒李斯特菌可用於增強免疫應答，和用於預防 和治療疾病，包括癌症或實體瘤。
[0147] 在另一個實施方案中，本文提供了提高治療疫苗的免疫原性的方法，所述方法包 括：給受試者共同施用所述疫苗和活減毒李斯特菌，其中所述活減毒李斯特菌增強所述疫 苗的免疫原性，由此提高所述疫苗的免疫原性。在另一個實施方案中，所述活減毒李斯特菌 是重組李斯特菌。在一個實施方案中，所述方法能夠是指所述疫苗對其具有特異性的腫瘤。
[0148] 在一個實施方案中，本文提供了以抗原非依賴性方式增強對疾病的免疫應答的方 法，所述方法包括：給受試者施用活減毒李斯特菌或重組李斯特菌。
[0149] 在另一個實施方案中，本文中提供的活減毒或重組李斯特菌表達LLO蛋白或其非 溶血性片段。在另一個實施方案中，本文提供的李斯特菌單獨使用，或與其它佐劑組合。 在另一個實施方案中，在本發明的方法和組合物中使用的其它佐劑是，在另一個實施方案 中，粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)蛋白。在另一個實施方案中，所述佐劑包含 GM-CSF蛋白。在另一個實施方案中，所述佐劑是編碼GM-CSF的核苷酸分子。在另一個實施 方案中，所述佐劑包含編碼GM-CSF的核苷酸分子。在另一個實施方案中，所述佐劑是皂苷 QS21。在另一個實施方案中，所述佐劑包含皂苷QS21。在另一個實施方案中，所述佐劑是單 磷醯脂質A。在另一個實施方案中，所述佐劑包含單磷醯脂質A。在另一個實施方案中，所述 佐劑是SBAS2。在另一個實施方案中，所述佐劑包含SBAS2。在另一個實施方案中，所述佐劑 是未甲基化的含有CpG的寡核苷酸。在另一個實施方案中，所述佐劑包含未甲基化的含有 CpG的寡核苷酸。在另一個實施方案中，所述佐劑是免疫刺激性細胞因子。在另一個實施方 案中，所述佐劑包含免疫刺激性細胞因子。在另一個實施方案中，所述佐劑是編碼免疫刺激 性細胞因子的核苷酸分子。在另一個實施方案中，所述佐劑包含編碼免疫刺激性細胞因子 的核苷酸分子。在另一個實施方案中，所述佐劑是或包含羽管糖苷（quillglycoside)。在 另一個實施方案中，所述佐劑是或包含細菌促分裂原。在另一個實施方案中，所述佐劑是或 包含細菌毒素。在另一個實施方案中，所述佐劑是或包含本領域已知的任意其它佐劑。每 種可能性代表本發明的一個單獨實施方案。
[0150] 在一個實施方案中，在本文提供的方法和組合物中使用的LLO是李斯特菌LL0。在 一個實施方案中，用於衍生出LLO的李斯特菌是單核細胞增生李斯特菌（Lm)。在另一個實 施方案中，所述李斯特菌是伊氏李斯特菌（Listeriaivanovii)。在另一個實施方案中，所 述李斯特菌是威氏李斯特菌（Listeriawelshimeri)。在另一個實施方案中，所述李斯特菌 是斯氏李斯特菌（Listeriaseeligeri)。
[0151] 在一個實施方案中，所述LLO蛋白由在（SEQIDN0:5)中闡述的下述核酸序列編 碼
[0152] atgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaa gcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcc taagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatg tattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgtt gtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaaccta tccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcat taacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaac gttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaa aattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaa ataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatt tactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgca agcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaat tatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgat gtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttca aatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggag ttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaa acaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttc ttgggatgaagtaaattatgatctcgag(SEQIDNO:5)。
[0153] 在另一個實施方案中，所述LLO蛋白具有序列SEQIDN0:6
[0154] MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENS ISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNN VLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNA DIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSL TLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNE KYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNN SLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRF FGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLST NSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVI YGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIA YTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSG GYVAQFNISffDEVNYDL(SEQIDNO:6)
[0155] 與該序列對應的前蛋白的前25個胺基酸是信號序列，其在LLO被細菌分泌時從 LLO切掉。因而，在該實施方案中，全長有活性的LLO蛋白的長度是504個殘基。在另一個 實施方案中，所述LLO蛋白具有在GenBank登記號DQ054588、DQ054589、AY878649、U25452 或U25452中所示的序列。在另一個實施方案中，所述LLO蛋白是LLO蛋白的變體。在另一 個實施方案中，所述LLO蛋白是LLO蛋白的同系物。每種可能性代表本發明的一個單獨實 施方案。
[0156] 在另一個實施方案中，"截短的LL0"或"tLLO"表示包含PEST-樣結構域的LLO片 段。在另一個實施方案中，該術語表示，在氨基端不含有活化結構域且不包括胱氨酸484的 LLO片段。在另一個實施方案中，所述LLO片段由PEST序列組成。在另一個實施方案中， 所述LLO片段包含PEST序列。在另一個實施方案中，所述LLO片段由529個胺基酸的全長 LLO蛋白的約前400-441個胺基酸組成。在另一個實施方案中，所述LLO片段是非溶血形式 的LLO蛋白。
[0157] 在一個實施方案中，所述LLO片段由約殘基1-25組成。在另一個實施方案中，所 述LLO片段由約殘基1-50組成。在另一個實施方案中，所述LLO片段由約殘基1-75組成。 在另一個實施方案中，所述LLO片段由約殘基1-100組成。在另一個實施方案中，所述LLO 片段由約殘基1-125組成。在另一個實施方案中，所述LLO片段由約殘基1-150組成。在 另一個實施方案中，所述LLO片段由約殘基1-175組成。在另一個實施方案中，所述LLO片 段由約殘基1-200組成。在另一個實施方案中，所述LLO片段由約殘基1-225組成。在另 一個實施方案中，所述LLO片段由約殘基1-250組成。在另一個實施方案中，所述LLO片段 由約殘基1-275組成。在另一個實施方案中，所述LLO片段由約殘基1-300組成。在另一 個實施方案中，所述LLO片段由約殘基1-325組成。在另一個實施方案中，所述LLO片段由 約殘基1-350組成。在另一個實施方案中，所述LLO片段由約殘基1-375組成。在另一個 實施方案中，所述LLO片段由約殘基1-400組成。在另一個實施方案中，所述LLO片段由約 殘基1-425組成。每種可能性代表本發明的一個單獨實施方案。
[0158] 在另一個實施方案中，在本發明中可以使用得自其它物種的LLO的同系物，包括 已知的溶解素，諸如鏈球菌溶血素〇、產氣莢膜梭菌細胞溶素〇、肺炎鏈球菌溶血素等或其 片段。
[0159] 在一個實施方案中，本文中提供的活減毒李斯特菌或重組李斯特菌會表達ActA 蛋白或其片段。在本發明的方法和組合物的另一個實施方案中，在本文中也提供了與異種 抗原或其片段融合的ActA蛋白的片段。在另一個實施方案中，ActA蛋白的片段具有以下 序列：
[0160] MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKEL EKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAI ASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDK IDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTD EELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPI PTEEELNGRGGRP(SEQIDN〇:7)。在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的ActA氨基 酸序列包含在SEQIDNo: 7中所示的序列。在另一個實施方案中，所述ActA胺基酸序列是 SEQIDN〇:7的同系物。在另一個實施方案中，所述ActA胺基酸序列是SEQIDN〇:7的變 體。在另一個實施方案中，所述ActA胺基酸序列是SEQIDNo: 7的片段。在另一個實施方 案中，所述ActA胺基酸序列是SEQIDNo: 5的異形體。每種可能性代表本發明的一個單獨 實施方案。
[0161] 在另一個實施方案中，所述ActA片段由包含以下序列的重組核苷酸編碼：
[0162] ATGCGTGCGATGATGGTGGTTTTCATTACTGCCAATTGCATTACGATTAACCCCGACATAATATTTGCA GCGACAGATAGCGAAGATTCTAGTCTAAACACAGATGAATGGGAAGAAGAAAAAACAGAAGAGCAACCAAGCGAGGT AAATACGGGACCAAGATACGAAACTGCACGTGAAGTAAGTTCACGTGATATTAAAGAACTAGAAAAATCGAATAAAG TGAGAAATACGAACAAAGCAGACCTAATAGCAATGTTGAAAGAAAAAGCAGAAAAAGGTCCAAATATCAATAATAAC AACAGTGAACAAACTGAGAATGCGGCTATAAATGAAGAGGCTTCAGGAGCCGACCGACCAGCTATACAAGTGGAGCG TCGTCATCCAGGATTGCCATCGGATAGCGCAGCGGAAATTAAAAAAAGAAGGAAAGCCATAGCATCATCGGATAGTG AGCTTGAAAGCCTTACTTATCCGGATAAACCAACAAAAGTAAATAAGAAAAAAGTGGCGAAAGAGTCAGTTGCGGAT GCTTCTGAAAGTGACTTAGATTCTAGCATGCAGTCAGCAGATGAGTCTTCACCACAACCTTTAAAAGCAAACCAACA ACCATTTTTCCCTAAAGTATTTAAAAAAATAAAAGATGCGGGGAAATGGGTACGTGATAAAATCGACGAAAATCCTG AAGTAAAGAAAGCGATTGTTGATAAAAGTGCAGGGTTAATTGACCAATTATTAACCAAAAAGAAAAGTGAAGAGGTA AATGCTTCGGACTTCCCGCCACCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACACCAATGCTTCTTGG TTTTAATGCTCCTGCTACATCAGAACCGAGCTCATTCGAATTTCCACCACCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTG CTTTGCCAGAGACGCCAATGCTTCTTGGTTTTAATGCTCCTGCTACATCGGAACCGAGCTCGTTCGAATTTCCACCG CCTCCAACAGAAGATGAACTAGAAATCATCCGGGAAACAGCATCCTCGCTAGATTCTAGTTTTACAAGAGGGGATTT AGCTAGTTTGAGAAATGCTATTAATCGCCATAGTCAAAATTTCTCTGATTTCCCACCAATCCCAACAGAAGAAGAGT TGAA
[0163] CGGGAGAGGCGGTAGACCA(SEQIDN0:8)。在另一個實施方案中，所述重組核苷酸具 有在SEQIDNO:8中所示的序列。在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的編碼ActA 的核苷酸包含在SEQIDNo:8中所不的序列。在另一個實施方案中，所述編碼ActA的核苷 酸是SEQIDNo:8的同系物。在另一個實施方案中，所述編碼ActA的核苷酸是SEQIDNo:8 的變體。在另一個實施方案中，所述編碼ActA的核苷酸是SEQIDNo:8的片段。在另一個 實施方案中，所述編碼ActA的核苷酸是SEQIDNo:8的異形體。每種可能性代表本發明的 一個單獨實施方案。
[0164] 在另一個實施方案中，所述ActA片段由包含以下序列的重組核苷酸編碼：
[0165] tttatcacgtacccatttccccgcatcttttatttttttaaatactttagggaaaaatggtttttgatt tgcttttaaaggttgtggtgtagactcgtctgctgactgcatgctagaatctaagtcactttcagaagcatccacaa ctgactctttcgccacttttctcttatttgcttttgttggtttatctggataagtaaggctttcaagctcactatcc gacgacgctatggcttttcttctttttttaatttccgctgcgctatccgatgacagacctggatgacgacgctccac ttgcagagttggtcggtcgactcctgaagcctcttcatttatagccacatttcctgtttgctcaccgttgttattat tgttattcggacctttctctgcttttgctttcaacattgctattaggtctgctttgttcgtatttttcactttattc gatttttctagttcctcaatatcacgtgaacttacttcacgtgcagtttcgtatcttggtcccgtatttacctcgct tggctgctcttctgttttttcttcttcccattcatctgtgtttagactggaatcttcgctatctgtcgctgcaaata ttatgtcggggttaatcgtaatgcagttggcagtaatgaaaactaccatcatcgcacgcat(SEQIDNO:9)。在 另一個實施方案中，所述重組核苷酸具有在SEQIDNO:9中所不的序列。在另一個實施方 案中，本發明的方法和組合物的編碼ActA的核苷酸包含在SEQIDNo:9中所示的序列。在 另一個實施方案中，所述編碼ActA的核苷酸是SEQIDN〇:9的同系物。在另一個實施方案 中，所述編碼ActA的核苷酸是SEQIDNo:9的變體。在另一個實施方案中，所述編碼ActA 的核苷酸是SEQIDNo:9的片段。在另一個實施方案中，所述編碼ActA的核苷酸是SEQID N〇:9的異形體。在另一個實施方案中，使用SEQIDN0:9獲得也在本文中提供的SEQID NO:2的構建體。每種可能性代表本發明的一個單獨實施方案。
[0166] 在本發明的方法和組合物的另一個實施方案中，將ActA蛋白片段與異種抗原或 其片段融合。在另一個實施方案中，所述ActA蛋白片段具有在Genbank登記號AAF04762 中闡述的序列。在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的ActA胺基酸序列包含在 Genbank登記號AAF04762中闡述的序列。在另一個實施方案中，所述ActA胺基酸序列 是Genbank登記號AAF04762的同系物。在另一個實施方案中，所述ActA胺基酸序列是 Genbank登記號AAF04762的變體。在另一個實施方案中，所述ActA胺基酸序列是Genbank 登記號AAF04762的片段。在另一個實施方案中，所述ActA胺基酸序列是Genbank登記號 AAF04762的異形體。每種可能性代表本發明的一個單獨實施方案。
[0167] 在另一個實施方案中，在本發明的方法和組合物中利用的N-端ActA蛋白片段具 有在SEQIDNO: 10中所示的序列：
[0168] MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKEL EKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAI ASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDK IDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTD EELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIP TEEELNGRGGRP。在另一個實施方案中，所述ActA片段包含在SEQIDN0:10中所示的序列。 在另一個實施方案中，所述ActA片段是本領域已知的任意其它ActA片段。每種可能性代 表本發明的一個單獨實施方案。
[0169] 在另一個實施方案中，所述編碼ActA蛋白片段的重組核苷酸包含在SEQIDNO: 11 中所示的序列：
[0170] Atgcgtgcgatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacataatatttgca gcgacagatagcgaagattctagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcaaccaagcgaggt aaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattaaagaactagaaaaatcgaataaag tgagaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagaaaaagcagaaaaaggtccaaatatcaataataac aacagtgaacaaactgagaatgcggctataaatgaagaggcttcaggagccgaccgaccagctatacaagtggagcg tcgtcatccaggattgccatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaaggaaagccatagcatcatcggatagtg agcttgaaagccttacttatccggataaaccaacaaaagtaaataagaaaaaagtggcgaaagagtcagttgcggat gcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagatgagtcttcaccacaacctttaaaagcaaaccaaca accatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctg aagtaaagaaagcgattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggta aatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacaccaatgcttcttgg ttttaatgctcctgctacatcagaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggatgaagagttaagacttg ctttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcgttcgaatttccaccg cctccaacagaagatgaactagaaatcatccgggaaacagcatcctcgctagattctagttttacaagaggggattt agctagtttgagaaatgctattaatcgccatagtcaaaatttctctgatttcccaccaatcccaacagaagaagagtt gaacgggagaggcggtagacca。在另一個實施方案中，所述重組核苷酸具有在SEQIDN0:11中 所示的序列。在另一個實施方案中，所述重組核苷酸包含編碼ActA蛋白片段的任意其它序 列。每種可能性代表本發明的一個單獨實施方案。
[0171] 在另一個實施方案中，所述ActA片段由包含在Genbank登記號AF103807中所示 的序列的重組核苷酸編碼。在另一個實施方案中，所述重組核苷酸具有在Genbank登記號 AF103807中所示的序列。在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的編碼ActA的核苷 酸包含在Genbank登記號AF103807中所示的序列。在另一個實施方案中，所述編碼ActA 的核苷酸是Genbank登記號AF103807的同系物。在另一個實施方案中，所述編碼ActA的 核苷酸是Genbank登記號AF103807的變體。在另一個實施方案中，所述編碼ActA的核苷 酸是Genbank登記號AF103807的片段。在另一個實施方案中，所述編碼ActA的核苷酸是 Genbank登記號AF103807的異形體。每種可能性代表本發明的一個單獨實施方案。
[0172] 在另一個實施方案中，所述ActA片段是本領域已知的任意其它ActA片段。在另 一個實施方案中，本發明的重組核苷酸包含編碼ActA蛋白片段的任意其它序列。在另一個 實施方案中，所述重組核苷酸包含編碼整個ActA蛋白的任意其它序列。每種可能性代表本 發明的一個單獨實施方案。
[0173] 在一個實施方案中，本文提供的活減毒李斯特菌或重組李斯特菌表達PEST序列 肽。在本發明的方法和組合物的另一個實施方案中，將PEST胺基酸序列與異種抗原或片段 融合。在另一個實施方案中，所述PEST胺基酸序列是KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEID K(SEQIDN0:12)。在另一個實施方案中，所述PEST序列是KENSISSMAPPASPPASPK(SEQID No: 13)。在另一個實施方案中，抗原與包含本文列舉的PEST胺基酸序列之一的任意LLO序 列的融合體可以增強細胞介導的針對HMW-MA的免疫。
[0174] 在另一個實施方案中，所述PEST胺基酸序列是得自李斯特菌ActA蛋白的PEST序 列。在另一個實施方案中，所述PEST序列是KTEEQPSEVNTGPR(SEQIDN0:14)、KASVTDTSEG DLDSSMQSADESTPQPLK(SEQIDN0:15)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQIDN0:16)*RGGIPTSE EFSSLNS⑶FTDDENSETTEEEIDR(SEQIDN0:17)。在另一個實施方案中，所述PEST-樣序列是 在上文中描述的PEST序列的變體，在一個實施方案中，其為KgSVYDASESDLDSSMQSADESTPQP LK(SEQIDN0:18)、KSEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQIDN0:19)或RGGSPTSEEFSSLNS⑶FTDDEN SETTEEEIDR(SEQIDN0:20)，這是技術人員會理解的。在另一個實施方案中，所述PEST-樣 序列得自斯氏李斯特菌溶細胞素，後者由Iso基因編碼。在另一個實施方案中，所述PEST 序列是RSEVTISPAETPESPPATP(SEQIDN0:21)。在另一個實施方案中，所述PEST序列得自 鏈球菌屬的鏈球菌溶血素〇蛋白。在另一個實施方案中，所述PEST序列得自釀膿鏈球菌 鏈球菌溶血素〇,例如在胺基酸35-51處的KQNTASTETTTTNEQPK(SEQIDN0:22)。在另一個 實施方案中，所述PEST-樣序列得自似馬鏈球菌鏈球菌溶血素0,例如在胺基酸38-54處的 KQNTANTETTTTNEQPK(SEQIDN0:23)。在另一個實施方案中，所述PEST-樣序列具有選自SEQ IDNO: 14-20的序列。在另一個實施方案中，所述PEST-樣序列具有選自SEQIDNO: 14-23 的序列。在另一個實施方案中，所述PEST序列是源自原核生物的另一個PEST胺基酸序列。
[0175] PEST序列的鑑別是本領域眾所周知的，且被描述在，例如，RogersS等人（Amino acidsequencescommontorapidlydegradedproteins:thePESThypothesis.Science 1986 ;234(4774) :364-8)和RechsteinerM等人（PESTsequencesandregulationby proteolysis.TrendsBiochemSci1996 ;21 (7) :267-71)。在另一個實施方案中，"PEST序 列"表示富含脯氨酸（P)、穀氨酸（E)、絲氨酸（S)和蘇氨酸（T)殘基的區域。在另一個實 施方案中，所述PEST序列側接一個或多個含有若干帶正電荷的胺基酸的簇。在另一個實施 方案中，所述PEST序列介導含有它的蛋白的快速細胞內降解。在另一個實施方案中，所述 PEST序列擬合在Rogers等人中公開的算法。在另一個實施方案中，所述PEST序列擬合在 Rechsteiner等人中公開的算法。在另一個實施方案中，所述PEST序列含有一個或多個內 部磷酸化位點，且在這些位點處的磷酸化先於蛋白降解。
[0176] 在一個實施方案中，根據諸如在下述文獻中描述的方法，鑑別原核生物的PEST序 列：例如關於LM的Rechsteiner和Rogers(1996,TrendsBiochem.Sci. 21:267-271)，和 RogersS等人（Science1986 ;234(4774) :364-8)。可替換地，基於該方法，還可以鑑別得 自其它原核生物的PEST胺基酸序列。在其中預見到PEST胺基酸序列的其它原核生物包括、 但不限於其它李斯特菌屬種。在一個實施方案中，所述PEST序列擬合在Rogers等人中公 開的算法。在另一個實施方案中，所述PEST序列擬合在Rechsteiner等人中公開的算法。 在另一個實施方案中，使用PEST-find程序鑑別PEST序列。
[0177] 在另一個實施方案中，通過在指定的蛋白序列內初步掃描帶正電荷的AAR、H和 K，實現PEST基序的鑑別。計數在帶正電荷的側翼之間的所有胺基酸，並且僅進一步考慮含 有等於或高於窗口大小參數的胺基酸數目的那些基序。在另一個實施方案中，PEST-樣序 列必須含有至少1個PU個D或E、和至少1個S或T。
[0178] 在另一個實施方案中，藉助於基於關鍵胺基酸的局部富集以及基序的疏水性的評 分參數，精化PEST基序的質量。以質量百分比（w/w)的方式表達D、E、P、S和T的富集，並 針對1當量的D或EU當量的P、和1當量的S或T進行校正。在另一個實施方案中，疏水 性的計算基本上遵循J.Kyte和R.F.Doolittle的方法（Kyte,J和Dootlittle,RF.J.Mol. Biol. 157, 105(1982)。
[0179] 在另一個實施方案中，將潛在PEST基序的疏水性計算為，每個胺基酸物質的摩爾 百分比和疏水性指數的乘積的總和。得到期望的PEST評分，其為由下述方程式表示的局部 富集項和疏水性項的組合：
[0180] PEST評分=0· 55*DEPST_0. 5* 疏水性指數。
[0181] 應當理解，術語"PEST序列"、"PEST-樣序列"或"PEST-樣序列肽"可以包括，使用 上述算法，具有至少+5的評分的肽。在另一個實施方案中，該術語表示具有至少6的評分 的肽。在另一個實施方案中，所述肽具有至少7的評分。在另一個實施方案中，所述評分是 至少8。在另一個實施方案中，所述評分是至少9。在另一個實施方案中，所述評分是至少 10。在另一個實施方案中，所述評分是至少11。在另一個實施方案中，所述評分是至少12。 在另一個實施方案中，所述評分是至少13。在另一個實施方案中，所述評分是至少14。在 另一個實施方案中，所述評分是至少15。在另一個實施方案中，所述評分是至少16。在另 一個實施方案中，所述評分是至少17。在另一個實施方案中，所述評分是至少18。在另一 個實施方案中，所述評分是至少19。在另一個實施方案中，所述評分是至少20。在另一個 實施方案中，所述評分是至少21。在另一個實施方案中，所述評分是至少22。在另一個實 施方案中，所述評分是至少22。在另一個實施方案中，所述評分是至少24。在另一個實施 方案中，所述評分是至少24。在另一個實施方案中，所述評分是至少25。在另一個實施方 案中，所述評分是至少26。在另一個實施方案中，所述評分是至少27。在另一個實施方案 中，所述評分是至少28。在另一個實施方案中，所述評分是至少29。在另一個實施方案中， 所述評分是至少30。在另一個實施方案中，所述評分是至少32。在另一個實施方案中，所 述評分是至少35。在另一個實施方案中，所述評分是至少38。在另一個實施方案中，所述 評分是至少40。在另一個實施方案中，所述評分是至少45。每種可能性代表本發明的一個 單獨實施方案。
[0182] 在另一個實施方案中，使用本領域已知的任意其它方法或算法，例 如CaSPredictor(Garay-MalpartidaHM,OcchiucciJM,AlvesJ,Belizario JE.Bioinformatics. 2005年6月21日增刊l:il69-76)，鑑別PEST序列。在另一個實施方 案中，使用下述方法：
[0183] 通過將1的值分配給胺基酸Ser、Thr、Pro、Glu、Asp、Asn或Gln,計算每個適當長 度段（例如30-35個胺基酸的段）的PEST指數。每個PEST殘基的係數值（CV)為1，且每 個其它胺基酸（非-PEST)的係數值為0。
[0184] 每種用於鑑別PEST-樣序列的方法代表本發明的一個單獨實施方案。
[0185] 在另一個實施方案中，所述PEST序列是本領域已知的任意其它PEST序列。每個 PEST序列及其類型代表本發明的一個單獨實施方案。
[0186] 應當理解，術語"與PEST序列融合"包括與包含PEST序列的蛋白片段融合。在另 一個實施方案中，該術語包括這樣的情況：其中所述蛋白片段包含除了PEST序列以外的周 圍序列。在另一個實施方案中，所述蛋白片段由PEST序列組成。還應當理解，術語"融合" 包括與2個肽或蛋白片段的融合：它們在各自的末端處連接在一起，或者一個嵌入在另一 個內。
[0187] 在另一個實施方案中，本文提供了疫苗，其包含本發明的重組形式的李斯特菌。
[0188] 在另一個實施方案中，本文提供了本發明的重組形式的李斯特菌的培養物。
[0189] 在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的李斯特菌是單核細胞增生李斯特 菌。在另一個實施方案中，所述李斯特菌是伊氏李斯特菌。在另一個實施方案中，所述李斯 特菌是威氏李斯特菌。在另一個實施方案中，所述李斯特菌是斯氏李斯特菌。每種類型的 李斯特菌代表本發明的一個單獨實施方案。
[0190] 在一個實施方案中，在本發明中使用減毒的李斯特菌菌株，諸如LMAactA突變 體、單核細胞增生李斯特菌八？1(^或八4(^4、八11-13、八11-(3。在另一個實施方案中， 如本領域普通技術人員在獲得本文的公開內容以後會理解的，通過引入一個或多個減毒突 變，構建減毒的李斯特菌菌株。這樣的菌株的例子包括、但不限於：芳族胺基酸營養缺陷型 的李斯特菌菌株和用於形成脂磷壁酸的突變體和通過缺失毒力基因而減毒的那些（參見 本文中的實施例）。
[0191] 在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的核酸分子可操作地連接至啟動子 /調節序列。在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的第一開放讀碼框可操作地連接 至啟動子/調節序列。在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的第二開放讀碼框可 操作地連接至啟動子/調節序列。在另一個實施方案中，每個開放讀碼框可操作地連接至 啟動子/調節序列。每種可能性代表本發明的一個單獨實施方案。
[0192] 技術人員在獲得本文提供的公開內容和方法後會容易地理解，不同的轉錄啟動 子、終止子、運輸載體或特定基因序列（例如在商購可得的克隆載體中的那些）可以成功 地用於本發明的方法和組合物中。如在本發明中所涵蓋的，這些功能性提供在例如被稱 作pUC系列的商購可得的載體中。在另一個實施方案中，除去非必需DNA序列（例如抗 生素抗性基因）。每種可能性代表本發明的一個單獨實施方案。在另一個實施方案中， 在本發明中使用商購可得的質粒。這樣的質粒可從多種來源得到，例如，Invitrogen(La Jolla,CA)，Stratagene(LaJolla,CA)，Clontech(PaloAlto,CA)，或者可以使用本領域眾 所周知的方法構建。
[0193] 另一個實施方案是質粒諸如pCR2.I(Invitrogen,LaJolla,CA)，其是一種原核表 達載體，具有用於促進在原核生物中的表達的原核複製起點和啟動子/調節元件。在另一 個實施方案中，除去外來核苷酸序列以減小質粒的大小和增加可以放入其中的盒的大小。
[0194] 這樣的方法是本領域眾所周知的，且被描述在，例如，Sambrook等人 (1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory Press,NewYork)和Ausubei等人（1997,CurrentProtocolsinMolecular Biology,Green&Wiley,NewYork)。
[0195] 抗生素抗性基因被用於在分子生物學和疫苗製備中常用的常規選擇和克隆過程 中。在本發明中涵蓋的抗生素抗性基因包括、但不限於這樣的基因產物：其賦予對氨苄西 林、青黴素、甲氧西林、鏈黴素、紅黴素、卡那黴素、四環素、氯黴素（CAT)、新黴素、潮黴素、慶 大黴素和本領域眾所周知的其它抗生素的抗性。每種基因代表本發明的一個單獨實施方 案。
[0196] 用於轉化細菌的方法是本領域眾所周知的，且包括基於氯化鈣感受態細胞的 方法、電穿孔方法、噬菌體介導的轉導、化學和物理轉化技術（deBoer等人，1989,Cell 56:641-649;Miller等人，1995,FASEBJ. ,9:190-199;Sambrook等人· 1989,Molecular Cloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork；Ausubel 等人，1997,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Johnffiley&Sons,NewYork； Gerhardt等人，編，1994,MethodsforGeneralandMolecularBacteriology,American SocietyforMicrobiology,Washington,DC；Miller,1992,AShortCourseinBacterial Genetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y. ) 〇 在另一 個實施方案中，通過電穿孔來轉化本發明的李斯特菌疫苗菌株。每種方法代表本發明的一 個單獨實施方案。
[0197] 在另一個實施方案中，使用接合將遺傳物質和/或質粒引入細菌中。接合方法 是本領域眾所周知的，且被描述在，例如，NikodinovicJ等人（Asecondgeneration snp-derivedEscherichiacoli-Streptomycesshuttleexpressionvectorthatis generallytransferablebyconjugation.Plasmid. 2006 年 11 月；56 (3):223-7)和 AuchtungJM等人（RegulationofaBacillussubtilismobilegeneticelementby intercellularsignalingandtheglobalDNAdamageresponse.ProcNatlAcadSci USA. 2005年8月30日；102 (35) :12554-9)。每種方法代表本發明的一個單獨實施方案。
[0198] 應當理解，術語"轉化"可以與術語"轉染"等同地使用，並表示工程化細菌細胞以 吸收質粒或其它異源DNA分子。還應該理解，術語"轉化"可以表示工程化細菌細胞以表達 質粒或其它異源DNA分子的基因。
[0199] 在本文別處描述了在本發明中可用的質粒和其它表達載體，且可以包括諸如啟動 子/調節序列、革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的複製起點、編碼融合蛋白的分離的核酸、和 編碼胺基酸代謝基因的分離的核酸等特徵。此外，編碼融合蛋白和胺基酸代謝基因的分離 核酸將具有適合驅動這樣的分離核酸的表達的啟動子。可用於驅動在細菌系統中的表達的 啟動子是本領域眾所周知的，且包括噬菌體λ、pBR322的β-內醯胺酶基因的bla啟動子、 和PBR325的氯黴素乙醯基轉移酶基因的CAT啟動子。原核啟動子的其它例子包括：噬菌體 λ的主要右和左啟動子（PL和PR)，大腸桿菌的丨印、1^(^、1&(^、1&(1和8 &1啟動子，枯草芽 孢桿菌的α-澱粉酶（Ulmanen等人，1985.J.Bacteriol. 162:176-182)和S28-特異性的啟 動子（Gilman等人，1984Gene32:11-20)，芽孢桿菌屬的噬菌體的啟動子（Gryczan, 1982， 見：TheMolecularBiologyoftheBacilli,AcademicPress,Inc.，NewYork),和鏈黴菌 屬啟動子（Ward等人，1986,Mol.Gen.Genet. 203:468-478)。在本發明中涵蓋的其它原核啟 動子綜述在，例如，Glick(1987,J.Ind.Microbiol. 1:277-282) ;Cenatiempo,（1986,Biochi mie, 68:505-516);和Gottesman, (1984，Ann.Rev.Genet. 18:415-442)。在本發明中涵蓋的 啟動子/調節元件的其它例子包括、但不限於：李斯特菌的PrfA啟動子、李斯特菌的hly啟 動子、李斯特菌的P60啟動子和李斯特菌的ActA啟動子（GenBankAcc.No.NC_003210)或 其片段。
[0200] 在一個實施方案中，使用DNA擴增方法，例如聚合酶鏈式反應（PCR)，生產編碼重 組非溶血性LLO的DNA。首先，單獨地擴增在新末端的任一側上的天然DNA區段。一個擴增 的序列的5'末端編碼肽接頭，而另一個擴增的序列的3'末端也編碼肽接頭。由於第一片 段的5'末端與第二片段的3'末端互補，可以在第三PCR反應中使用所述2個片段（例如 在LMP瓊脂糖上部分純化後）作為重疊模板。所述擴增的序列將含有：密碼子、在開放位點 的羧基側上的區段（現在形成氨基序列）、接頭和在開放位點的氨基側上的序列（現在形成 羧基序列）。將所述抗原連接進質粒中。每種方法代表本發明的一個單獨實施方案。
[0201] 在另一個實施方案中，使用重組DNA方法學，合成本發明的重組蛋白。在一個實 施方案中，這包括：製備DNA序列，將所述DNA放入表達盒（諸如本發明的質粒）中，置於 特定啟動子/調節元件的控制下，和表達所述蛋白。在另一個實施方案中，通過任意合適 的方法製備編碼本發明的蛋白（例如非溶血性LL0)的DNA，所述方法包括、例如，適當序 列的克隆和限制酶切，或通過諸如下述方法的直接化學合成：Narang等人（1979，Meth. Enzymol. 68:90-99)的憐酸三酯方法；Brown等人（1979,Meth.Enzymol68:109-151)的憐 酸二酯方法；Beaucage等人（1981，Tetra.Lett.，22:151859-1862)的二乙基氨基亞磷酸酯 方法；和美國專利號4, 458, 066的固體支持物方法。
[0202] 在另一個實施方案中，使用化學合成來生產單鏈的寡核苷酸。在不同的實施方案 中，如下將該單鏈的寡核苷酸轉化成雙鏈的DNA:通過與互補序列的雜交，或通過使用該單 鏈作為模板用DNA聚合酶進行聚合。本領域技術人員會認識到，儘管DNA的化學合成限於約 100個鹼基的序列，但是通過連接較短的序列可以得到較長的序列。在另一個實施方案中， 克隆子序列，並使用適當的限制性酶切割適當的子序列。然後連接片段以產生期望的DNA 序列。
[0203] 在另一個實施方案中，使用DNA擴增方法諸如聚合酶鏈式反應（PCR)，克隆編碼本 發明的重組蛋白的DNA。因而，使用包含合適的限制位點的同義引物和包含另一個限制位點 (例如用於促進克隆的不同限制位點）的反義引物，PCR擴增非溶血性LLO的基因。
[0204] 在另一個實施方案中，將重組融合蛋白基因可操作地連接至每種宿主的適當的表 達控制序列。在本文別處詳細描述了啟動子/調節序列。在另一個實施方案中，所述質粒 還包含其它啟動子調節元件、以及核糖體結合位點和轉錄終止信號。對於真核細胞，所述控 制序列將包括：源自例如免疫球蛋白基因、SV40、巨細胞病毒等的啟動子和增強子，以及聚 腺苷酸化序列。在另一個實施方案中，所述序列包括剪接供體和受體序列。
[0205] 在一個實施方案中，術語"可操作地連接"表示並列連接，其中如此描述的組件發 生關聯，從而允許它們以它們的預期方式起作用。與編碼序列"可操作地連接"的控制序列 是以這樣的方式連接：在與所述控制序列相容的條件下，實現所述編碼序列的表達。
[0206] 在另一個實施方案中，為了選擇包含質粒的營養缺陷型細菌，在將會選擇胺基酸 代謝基因的表達的培養基上培養轉化的營養缺陷型細菌。在另一個實施方案中，用包含 D-穀氨酸合成基因的質粒轉化D-穀氨酸合成營養缺陷型的細菌，並且所述營養缺陷型細 菌將在沒有D-穀氨酸存在下生長，而尚未被所述質粒轉化或者不表達編碼D-穀氨酸合成 蛋白的質粒的營養缺陷型細菌將不會生長。在另一個實施方案中，如果本發明的質粒包含 編碼負責D-丙氨酸合成的胺基酸代謝酶的分離核酸，D-丙氨酸合成營養缺陷型的細菌當 被轉化且表達所述質粒時，將在沒有D-丙氨酸存在下生長。這樣的用於製備適當的培養基 (其包含或缺少必需的生長因子、補充物、胺基酸、維生素、抗生素等）的方法是本領域眾所 周知的，且可商業得到（Becton-Dickinson,FranklinLakes,NJ)。每種方法代表本發明的 一個單獨實施方案。
[0207] 在另一個實施方案中，已經在適當的培養基上選擇包含本發明的質粒的營養缺陷 型細菌以後，在有選擇壓力存在下繁殖所述細菌。這樣的繁殖包括：在沒有營養缺陷因子存 在下，在培養基中培養所述細菌。表達胺基酸代謝酶的質粒在營養缺陷型細菌中的存在會 確保，所述質粒將與所述細菌一起複製，從而連續地選擇攜帶所述質粒的細菌。技術人員在 獲知本文的公開內容和方法後將能夠容易地通過調節培養基（在其中培養包含質粒的營 養缺陷型細菌）的體積來放大李斯特菌疫苗載體的生產。
[0208] 技術人員會明白，在另一個實施方案中，其它營養缺陷型菌株和互補系統適合與 本發明一起使用。
[0209] 在一個實施方案中，本文提供了施用本發明的組合物的方法。在另一個實施方案 中，本文提供了施用本發明的疫苗的方法。在另一個實施方案中，本文提供了施用本發明的 減毒重組形式的李斯特菌的方法。
[0210] 在另一個實施方案中，本發明的方法包括下述步驟：施用重組單核細胞增生李斯 特菌，其呈如本文中所述的任意形式或實施方案。在一個實施方案中，本發明的方法由下述 步驟組成：施用本發明的重組單核細胞增生李斯特菌，其呈如本文中所述的任意形式或實 施方案。在另一個實施方案中，本發明的方法基本上由下述步驟組成：施用本發明的重組單 核細胞增生李斯特菌，其呈如本文中所述的任意形式或實施方案。在一個實施方案中，術語 "包括"表示，在所述方法中包括施用重組單核細胞增生李斯特菌的步驟，以及包括本領域 可能已知的其它方法或治療。在另一個實施方案中，術語"基本上由......組成"表示這 樣的方法：其功能組分是重組單核細胞增生李斯特菌的施用，但是，可能包括與所述方法的 治療效果沒有直接關聯的其它方法步驟，且可以例如表示促進重組單核細胞增生李斯特菌 的施用效果的步驟。在一個實施方案中，術語"由……組成"表示，沒有其它步驟的施用重 組單核細胞增生李斯特菌的方法。
[0211] 在另一個實施方案中，由本發明的方法和組合物引起的免疫應答包括⑶8+T細胞 介導的應答。在另一個實施方案中，所述免疫應答主要由CD8+T細胞介導的應答組成。在 另一個實施方案中，所述免疫應答的唯一可檢測的組分是CD8+T細胞介導的應答。
[0212] 在另一個實施方案中，由本發明的方法和組合物引起的免疫應答包括⑶4+T細胞 介導的應答。在另一個實施方案中，所述免疫應答主要由CD4+T細胞介導的應答組成。在 另一個實施方案中，所述免疫應答的唯一可檢測的組分是CD4+T細胞介導的應答。
[0213] 在另一個實施方案中，由本發明的方法和組合物引起的免疫應答包括先天性免疫 應答。在另一個實施方案中，所述免疫應答主要由先天性免疫應答組成。在另一個實施方 案中，所述免疫應答的唯一可檢測的組分是先天性免疫應答。應當理解，先天性免疫應答的 活化涉及巨噬細胞（諸如Ml巨噬細胞）以及樹突細胞（DC)的活化。
[0214] 在另一個實施方案中，本發明提供了一種降低癌症或傳染性疾病或變態反應的發 病率的方法，所述方法包括：施用本發明的組合物。在另一個實施方案中，本發明提供了一 種改善癌症或傳染性疾病或變態反應的方法，所述方法包括：施用本發明的組合物。每種可 能性代表本發明的一個單獨實施方案。
[0215] 在一個實施方案中，用於本發明中的重組單核細胞增生李斯特菌會分泌異源肽。 在另一個實施方案中，用於本發明中的重組單核細胞增生李斯特菌會表達異源肽。在另一 個實施方案中，用於本發明中的重組單核細胞增生李斯特菌會表達和分泌如本文中所述的 非溶血性LL0。
[0216] 在一個實施方案中，本發明的治療方案是治療性的。在另一個實施方案中，所述方 案是預防性的。在另一個實施方案中，使用本發明的疫苗來保護處於癌症（諸如乳腺癌或 其它類型的腫瘤）風險中的人，所述風險歸因於家族性遺傳學或技術人員會理解的使他們 易患這些類型的疾病的其它情況。在另一個實施方案中，使用本發明的疫苗來治療具有癌 症（諸如乳腺癌或其它類型的腫瘤）的人，所述癌症歸因於家族性遺傳學或技術人員會理 解的使他們易患這些類型的疾病的其它情況。在另一個實施方案中，在替代治療之前將本 發明的疫苗用在具有癌症（諸如乳腺癌或其它類型的腫瘤）的人中，所述癌症歸因於家族 性遺傳學或技術人員會理解的使他們易患這些類型的疾病的其它情況。在另一個實施方案 中，這樣的治療包括化學療法、外科手術、輻射等。在這樣的治療之前，施用本發明的疫苗， 使得針對疫苗的腫瘤抗原的CTL應答會破壞剩餘的轉移灶和延長癌症緩解。在另一個實施 方案中，使用本發明的疫苗來影響以前建立的腫瘤的生長和殺死現存的腫瘤細胞。每種可 能性代表本發明的一個單獨實施方案。
[0217] 在另一個實施方案中，在上述的任意方法中使用的疫苗和免疫原性組合物具有本 發明的疫苗和免疫原性組合物的任意特徵。每種特徵代表本發明的一個單獨實施方案。
[0218] 本發明涵蓋劑量範圍的不同實施方案。在一個實施方案中，在疫苗載體的情況下， 所述劑量是在〇. 4LD5(I/劑的範圍內。在另一個實施方案中，所述劑量是約0. 4-4. 9LD5(/劑。 在另一個實施方案中，所述劑量是約〇. 5-0. 59LD5(I/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是 約0.6-0.69〇)5(|/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是約0.7-0.79〇) 5(|/劑。在另一個 實施方案中，所述劑量是約〇.SLD5tl/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是0. 4LD5(/劑至 0.8LD5Q/劑。
[0219] 在另一個實施方案中，所述劑量是IO7個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑 量是1.5xl07個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是2xl07個細菌/劑。在另一個 實施方案中，所述劑量是3xl07個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是4xl07個細 菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是6xl07個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述 劑量是8xl07個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是IxlO8個細菌/劑。在另一個 實施方案中，所述劑量是I. 5xl08個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是2xl08個 細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是3xl08個細菌/劑。在另一個實施方案中，所 述劑量是4xl08個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是6xl08個細菌/劑。在另一 個實施方案中，所述劑量是SxlO8個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是IxlO9個 細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是1.5xl09個細菌/劑。在另一個實施方案中， 所述劑量是2xl09個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是3xl09個細菌/劑。在另 一個實施方案中，所述劑量是5xl09個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是6xl09 個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是8xl09個細菌/劑。在另一個實施方案中， 所述劑量是IxlOici個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是1. 5χ101(ι個細菌/劑。 在另一個實施方案中，所述劑量是2χ101(ι個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是 3χ101(ι個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是5χ101(ι個細菌/劑。在另一個實施 方案中，所述劑量是6χ101(ι個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是8χ101(ι個細菌/ 齊U。在另一個實施方案中，所述劑量是SxlO9個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量 是IxlO11個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是1.5χ10η個細菌/劑。在另一個 實施方案中，所述劑量是2χ10η個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是3χ10η個細 菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是5χ10η個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述 劑量是6χ10η個細菌/劑。在另一個實施方案中，所述劑量是SxlO11個細菌/劑。每種可 能性代表本發明的一個單獨實施方案。
[0220] 在另一個實施方案中，本發明的方法另外包括下述步驟：給所述受試者施用強化 疫苗接種。在一個實施方案中，所述強化疫苗接種跟隨在單次初次疫苗接種之後。在另一個 實施方案中，在初次疫苗接種之後施用單次強化疫苗接種。在另一個實施方案中，在初次疫 苗接種之後施用2次強化疫苗接種。在另一個實施方案中，在初次疫苗接種之後施用3次 強化疫苗接種。在一個實施方案中，初次和強化疫苗之間的時段由技術人員通過實驗確定。 在另一個實施方案中，初次和強化疫苗之間的時段是1周，在另一個實施方案中，它是2周， 在另一個實施方案中，它是3周，在另一個實施方案中，它是4周，在另一個實施方案中，它 是5周，在另一個實施方案中，它是6-8周，在另一個實施方案中，在初次疫苗以後8-10周 施用強化疫苗。
[0221] 在一個實施方案中，將本發明的疫苗或免疫原性組合物單獨地施用給受試者。在 另一個實施方案中，將所述疫苗或免疫原性組合物與另一種療法一起施用。所述其它療法 可以是抗生素介導的針對感染性疾病的療法或化學療法、免疫療法、輻射、或針對癌症的外 科手術、或技術人員會理解的本領域可利用的任意其它類型的疾病療法。每種可能性代表 本發明的一個單獨實施方案。
[0222] 在另一個實施方案中，使用多種啟動子之一來表達含有它們的蛋白。在一個實施 方案中，使用LM啟動子，例如分別編碼李斯特菌蛋白溶血素、actA、磷脂醯肌醇-特異性的 磷脂酶、磷脂酶C和金屬蛋白酶的基因hly、actA、plcA、plcB和mpl的啟動子。每種可能 性代表本發明的一個單獨實施方案。
[0223] 在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物利用本發明的異種抗原或LLO序列 的同系物。當提及任何蛋白或肽時，術語"同源性"、"同源的"等在一個實施方案中表示，在 將序列對齊並在必要時引入缺口以達到最大同源性百分比後，且在不將任何保守置換視為 序列同一性的一部分的情況下，候選序列中與相應天然多肽的殘基相同的胺基酸殘基的百 分比。用於比對的方法和電腦程式是本領域眾所周知的。
[0224] 在另一個實施方案中，當提及任何核酸序列時，術語"同源性"類似地指示候選序 列中與相應天然核酸序列的核苷酸相同的核苷酸的百分比。
[0225] 在一個實施方案中，通過本領域熟知的方法，通過用於序列比對的計算機算法確 定同源性。例如，核酸序列同源性的計算機算法分析可以包括使用任何數目的可利用的 軟體包，例如，BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLASTEnhancedAlignmentUtility),GENPEPT和 TREMBL包。
[0226] 在另一個實施方案中，"同源性"表不與選自SEQIDNo: 1-76的序列大於60%的 同一性。在另一個實施方案中，"同源性"表不與選自SEQIDNo: 1-76的序列大於70%的 同一性。在另一個實施方案中，所述同一性是大於75%。在另一個實施方案中，所述同一 性是大於78%。在另一個實施方案中，所述同一性是大於80%。在另一個實施方案中，所 述同一性是大於82%。在另一個實施方案中，所述同一性是大於83%。在另一個實施方案 中，所述同一性是大於85%。在另一個實施方案中，所述同一性是大於87%。在另一個實 施方案中，所述同一'I"生是大於88%。在另一個實施方案中，所述同一'丨生是大於90%。在另 一個實施方案中，所述同一性是大於92%。在另一個實施方案中，所述同一性是大於93%。 在另一個實施方案中，所述同一性是大於95%。在另一個實施方案中，所述同一性是大於 96%。在另一個實施方案中，所述同一性是大於97%。在另一個實施方案中，所述同一性是 大於98%。在另一個實施方案中，所述同一'丨生是大於99%。在另一個實施方案中，所述同 一性是100%。每種可能性代表本發明的一個單獨實施方案。
[0227] 在另一個實施方案中，通過確定候選序列雜交而確定同源性，其方法在現有技 術中有充分描述（參見，例如，"NucleicAcidHybridization"Hames，B.D·，和Higgins S.J·，編（1985);Sambrook等人，2001,MolecularCloning,ALaboratoryManual,Cold SpringHarborPress,N.Y.;和Ausubel等人，1989,CurrentProtocolsinMolecular Biology,GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y) 〇 例如，可以在對 於編碼天然天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶肽的DNA的補體而言是中等至嚴謹條件下進 行雜交方法。雜交條件為，例如，在包含下述物質的溶液中在42°C溫育過夜：10-20%甲醯 胺、5XSSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸三鈉）、50mM磷酸鈉（pH7. 6)、5X登哈特溶液、10%硫 酸葡聚糖和20μg/ml變性的剪切的鮭魚精DNA。
[0228] 在一個實施方案中，如下確定本文中列出的任意胺基酸序列的蛋白和/或肽同源 性：通過本領域熟知的方法（包括免疫印跡分析），或通過利用許多可得到的軟體包中的 任一種進行胺基酸序列的計算機算法分析,通過確立的方法。這些包中的一些可以包括 FASTA、BLAST、MPsrch或Scanps包，且可以採用例如Smith和Waterman算法、和/或總體/ 局部或BLOCKS比對進行分析算法。每種確定同源性的方法代表本發明的一個單獨實施方 案。
[0229] 在另一個實施方案中，本發明提供了一種試劑盒，其包含用於實施本發明的方法 的試劑。在另一個實施方案中，本發明提供了一種試劑盒，其包含本發明的組合物、工具或 儀器。
[0230] 應當熟知，術語"接觸"或"施用"可以包括，使癌細胞、腫瘤或疾病部位與本發明 的組合物直接接觸。在另一個實施方案中，該術語表示，使癌細胞、腫瘤或疾病部位與本發 明的組合物間接接觸。在另一個實施方案中，本發明的方法包括這樣的方法：其中使受試者 與本發明的組合物接觸，然後使所述組合物通過擴散或本領域已知的任意其它主動轉運或 被動轉運過程（由此使化合物在體內循環）與癌細胞、腫瘤或疾病部位接觸。每種可能性 代表本發明的一個單獨實施方案。
[0231] 在另一個實施方案中，術語"基因"和"重組基因"表示，包含編碼本發明多肽的 開放讀碼框的核酸分子。這樣的天然等位基因變異通常可以導致給定基因的核苷酸序列 的1-5%差異。通過對許多不同個體或生物體中的目標基因測序，可以鑑別替代性的等位 基因。這可以如下容易地實現：使用雜交探針來鑑別多種個體或生物體中的相同遺傳基因 座。任意和所有這樣的核苷酸變異和產生的胺基酸多態性或變異（其歸因於天然的等位基 因變異，且其不會改變功能活性）意圖在本發明的範圍內。
[0232] 在另一個實施方案中，通過本領域技術人員已知的任意方法，諸如胃腸外地、癌旁 地、透黏膜地、透皮地、肌肉內地、靜脈內地、真皮內地、皮下地、腹膜內地、心室內地、顱內 地、陰道內地或腫瘤內地，將本發明的含有疫苗和組合物的藥物組合物施用給受試者。
[0233] 在本文提供的方法和組合物的另一個實施方案中，口服施用所述疫苗或組合物， 且因此將其被配製為適合口服施用的形式，即，作為固體或液體製劑。合適的固體口服製劑 包括片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、藥丸等。合適的液體口服製劑包括溶液、混懸液、分散劑、 乳劑、油劑等。在本發明的另一個實施方案中，所述活性成分被配製為膠囊劑。根據該實施 方案，本發明的組合物除了包含活性化合物和惰性載體或稀釋劑以外，還包含明膠膠囊。
[0234] 在另一個實施方案中，通過靜脈內、動脈內、或肌肉內注射液體製劑來施用所述疫 苗或組合物。合適的液體製劑包括溶液、混懸液、分散劑、乳劑、油劑等。在一個實施方案中， 靜脈內地施用所述藥物組合物，且因此將其配製為適合靜脈內施用的形式。在另一個實施 方案中，動脈內地施用所述藥物組合物，且因此將其配製為適合動脈內施用的形式。在另一 個實施方案中，肌肉內地施用所述藥物組合物，且因此將其配製為適合肌肉內施用的形式。
[0235] 應當理解，術語"治療"可以包括治癒疾病、預防疾病、降低疾病的發病率、改善疾 病的徵狀、誘導疾病的緩解、減慢疾病的進展。在另一個實施方案中，術語"減輕"、"遏制" 和"抑制"表示減少或降低。
[0236] 應當熟知，術語"治療有效劑量"或"治療有效量"可以包括產生期望的作用的劑 量，所述作用是施用的目的。確切劑量可以由本領域技術人員使用已知的技術確定。
[0237] 應當熟知，術語"約"可以包括以定量方式加或減5%，或在另一個實施方案中加或 減10%，或在另一個實施方案中加或減15%，或在另一個實施方案中加或減20%。
[0238] 應當熟知，術語"受試者"可以包括需要治療病症或其後遺症或者易感病症或其後 遺症的哺乳動物，包括人，且也可以包括狗、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬、大鼠和小鼠和人類。 術語"受試者"不排除在所有方面正常的個體。
[0239] 為了更充分地舉例說明本發明的優選實施方案，提供了下述實施例。但是，所述實 施例絕不應當解釋為限制本發明的寬範圍。
[0240] 實施例
[0241] 實施例1:LL0_抗原融合體誘導抗腫瘤免疫
[0242] 材料和實駘方法（實施例1-2)
[0243] 細胞系
[0244] 將C57BL/6同基因TC-I腫瘤用HPV-16E6和E7永生化，並用c-Ha-ras癌基因轉 化。由T.C.Wu(JohnsHopkinsUniversitySchoolofMedicine,Baltimore,MD)提供的 TC-I是高度致瘤肺上皮細胞，其表達低水平的HPV-16E6和E7並用c-Ha-ras癌基因轉化。 在1^]\0 1640、10%?05、211111^-穀氨醯胺、10(^/1111青黴素、10(^8/1111鏈黴素、10(^]\1非必 需胺基酸、ImM丙酮酸鈉、50 微摩爾（mcM)2-ME、400 微克（mcg)/mlG418 和 10%National CollectionTypeCulture-109培養基中在37。在 10%CO2下培養TC-UC3是得自C57BL/6 小鼠的小鼠胚胎細胞，其用HPV16的完整基因組永生化並用pEJ-ras轉化。EL-4/E7是通 過逆轉錄病毒用E7轉導的胸腺瘤EL-4。
[0245] 單核細胞增生李斯特菌菌株和繁殖
[0246] 使用的李斯特菌菌株是Lm-LL0-E7 (在附加型表達系統中的hly_E7融合基因；圖 1A)、Lm-E7(整合進李斯特菌基因組中的單拷貝E7基因盒）、Lm-LLO-NP( "DP-L2028" ；在 附加型表達系統中的hly-NP融合基因）和Lm-Gag( "ZY-18" ；整合進染色體中的單拷貝 HIV-IGag基因盒）。使用引物 5' -GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3'(SEQIDNo: 24;XhoI位點 標有下劃線）和 5' -GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(SEQIDNo: 25;SpeI位點標有下 劃線），PCR擴增E7,並將其連接進pCR2.I(Invitrogen,SanDiego,CA)。通過Xhol/Spel 消化從pCR2. 1切離E7,並將其連接進pGG-55。將hly-E7融合基因和多能轉錄因子prfA克 隆進pAM401，即一種多拷貝穿梭質粒（WirthR等人，JBacteriol, 165:831，1986)，從而產 生pGG-55。hly啟動子驅動hly基因產物（缺少溶血性C-端，在下文中被稱作"ALL0"） 的前441個胺基酸的表達，其通過XhoI位點連接至E7基因，從而產生hly-E7融合基因，其 被轉錄和分泌成LL0-E7。用為了在體內保留質粒而選擇的pGG-55,轉化李斯特菌的prfA 陰性菌株XFL-7 (提供人為HaoShen博士，UniversityofPennsylvania)(圖 1A-B)。使 用引物 5' -GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(SEQIDNo: 26;NheI位點標有下劃線） 和 5' -CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC-3'(SEQIDNo:27;XhoI位點標有下劃線），製備 hly啟動子和基因片段。使用引物 5'-GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAAT AAATCCGTTT-3'（SEQIDNo:28;XbaI位點標有下劃線）和 5'-CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTG AAG-3'（SEQIDNo:29;SalI位點標有下劃線），PCR擴增prfA基因。通過將含有hly啟動 子和信號序列（其驅動E7的表達和分泌）的表達盒引入LM基因組的orfZ結構域中，製備Lm-E7。#用引物 5' -GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC-3'(SEQIDNo: 30 位點標有下劃 線）和 5' -GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG-3'(SEQIDNo: 31;XbaI位點標有下劃線），PCR擴增E7。然後將E7連接進pZY-21穿梭載體中。用得到的質粒pZY-21-E7轉化LM菌株10403S， 所述ΡΖΥ-21-Ε7包括插入在與LM基因組的orfX、Y、Z結構域對應的I. 6-kb序列的中央的 表達盒。所述同源性結構域允許E7基因盒通過同源重組插入orfZ結構域中。針對E7基 因盒在orfZ結構域中的整合，篩選克隆。在含有（Lm-LL0-E7和Lm-LLO-ΝΡ)或不含（Lm-E7 和ZY-18)氯黴素COyg/ml)的腦心浸液培養基中培養細菌。在-80°C在等分試樣中冷凍 細菌。通過蛋白質印跡法驗證表達（圖2)。
[0247] 蛋白質印跡法
[0248] 將李斯特菌菌株在Luria-Bertoni培養基中在37°C培養，並在600nm測量的相同 光密度收穫。將上清液TCA沉澱，並再懸浮於補充了 0.INNaOH的Ix樣品緩衝液中。將相 同量的每種細胞沉澱物或每種TCA-沉澱的上清液加載上4-20%Tris-甘氨酸SDS-PAGE 凝膠（N0VEX，SanDiego，CA)。將凝膠轉移至聚偏氟乙烯，並用抗-E7單克隆抗體（mAb) (ZymedLaboratories,SouthSanFrancisco,CA)探測，然後與HRP-綴合的抗-小鼠第二 Ab(AmershamPharmaciaBiotech,LittleChalfont,U.K.) 一起溫育，用AmershamECL檢 測試劑顯影，並暴露於Hyperfilm(AmershamPharmaciaBiotech)。
[0249] 腫瘤生長的測量
[0250] 每隔日用跨最短和最長表面直徑的測徑器測量腫瘤。將這2個測量結果的平均值 繪圖為相對於不同時間點的平均腫瘤直徑（以毫米計）。當腫瘤直徑達到20mm時，處死小 鼠。僅顯示存活小鼠在每個時間點的腫瘤測量結果。
[0251] 李斯特菌重組體對建立的腫瘤生長的影響
[0252] 6-8周齡C57BL/6小鼠（CharlesRiver)在左脅腹皮下接受2xl05個TC-I細胞。 腫瘤接種後1周，腫瘤已經達到直徑為4-5_的可觸知大小。然後在第7和14天用0.ILD5tl 腹膜內Lm-LL0-E7 (IO7CFU)、Lm-E7 (IO6CFU)、Lm-LLO-NP(IO7CFU)或Lm-Gag(5xl05CFU)治療 8隻小鼠的組。
[0253] 51Cr釋放測定
[0254] 用 0·lLD5(lLm-LL0-E7、Lm-E7、Lm-LL0-NP或Lm-Gag腹膜內免疫6-8 周齡C57BL/6 小 鼠。免疫接種後10天，收穫脾。用照射的TC-I細胞作為飼養細胞，在培養物中建立脾細胞 (100:1，脾細胞：TC-1);在體外刺激5天，然後用在使用下述靶標的標準51Cr釋放測定中： EL-4、EL-4/E7 或用E7H-2b肽（RAHYNIVTF)(SEQIDN0:32)脈衝處理的EL-4。一式三份地 進行的￡:1'細胞比率為：80 :1、40:1、20:1、10:1、5:1和2.5:1。在371：溫育4-11以後，將細 胞沉澱，並從每個孔取出50μ1上清液。用Wallac1450閃爍計數器（Gaithersburg,MD)測 定樣品。將特異性裂解百分比確定為[(每分鐘的實驗計數（cpm)-自發cpm)/(總cpm-自 發cpm)]xlOO。
[0255] TC-I-特異性的增殖
[0256] 將C57BL/6小鼠用0.ILD5tl免疫，並在20天後通過腹膜內注射lLD5QLm-LL0-E7、 Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag進行強化。強化後6天，從經免疫的小鼠和原初小鼠收穫脾。 用2. 5xl04、I. 25xl04、6xl03或3xl03經照射的TC-I細胞/孔作為E7Ag的來源，或不用TC-I 細胞或用l〇yg/mlConA，在平底96-孔平板中在5xl05/孔的培養物中建立脾細胞。45h後用0. 5μCi[3H]胸苷/孔脈衝處理細胞。18h以後，使用Tomtec採集器96 (Orange,CT) 收穫平板，並用Wallac1450閃爍計數器評估增殖。將以cpm計的變化計算為實驗cpm-無Agcpm〇
[0257] 流式細胞計數分析
[0258] 將C57BL/6 小鼠用 0·lLD5QLm-LL0-E7 或Lm-E7 靜脈內地（i·V.)免疫，並 在30天後強化。使用FACSCalibur?:流式細胞計用CellQuest?·軟體（Becton Dickinson,MountainView,CA)進行CD8 (53-6. 7,PE綴合的）、CD62 配體（CD62L;MEL-14， APC綴合的）和E7H-2Db四聚體的三色流式細胞計量術。將強化後5天收穫的脾細胞在室溫 (rt)用加載了E7 肽（RAHYNIVTF)(SEQIDN0:32)或對照（HIV-Gag)肽的H-2Db四聚體染 色。以 1/200 稀釋度使用四聚體，其由LarryR.Pease博士（MayoClinic,Rochester,MN) 和NIAIDTetramerCoreFacility以及NIHAIDSResearchandReferenceReagent Program提供。分析四聚體+、⑶8+、⑶62Lffi細胞。
[0259] B16R)-〇va實驗
[0260] 給24隻C57BL/6小鼠接種5xl05個B16R)-〇va細胞。在第3、10和17天，將8隻 小鼠的組用〇.ILD5tlLm-OVA(IO6Cfu)、Lm-LLO-OVA(IO8Cfu)免疫，並將8隻動物保持不處理。
[0261] 統計學
[0262] 為了對比腫瘤直徑，確定每個組的腫瘤大小的平均值和SD，並通過Student氏t檢 驗確定統計顯著性。P< 〇. 05視作顯著的。
[0263] MS
[0264] 對比了Lm-E7和Lm-LL0-E7的影響TC-I生長的能力。在C57BL/6小鼠的左脅腹 上建立皮下腫瘤。7天後，腫瘤已經達到可觸知的大小（4-5mm)。在第7和14天，給小鼠接 種 0·lLD5(lLm-E7、Lm-LL0-E7 或作為對照的Lm-Gag和Lm-LL〇-NP。Lm-LL0-E7 誘導 75% 的 建立的TC-I腫瘤的完全消退，而在該組中的其它2隻小鼠中控制了腫瘤生長（圖3)。相 反，使用Lm-E7和Lm-Gag的免疫接種沒有誘導腫瘤消退。將該實驗重複多次，總是得到非 常類似的結果。另外，在不同的免疫接種方案下，Lm-LL0-E7得到了類似的結果。在另一個 實驗中，單次免疫接種能夠治癒建立的5mmTC-I腫瘤的小鼠。
[0265] 在其它實驗中，用另外2個表達E7的腫瘤細胞系得到了類似的結果：C3和EL-4/ E7。為了證實Lm-LL0-E7疫苗接種的效力，分別在第60天或第40天用TC-I或EL-4/E7腫 瘤細胞重新攻擊已經消除了它們的腫瘤的動物。用Lm-LL0-E7免疫的動物保持無腫瘤直到 實驗終止（就TC-I而言，第124天；就EL-4/E7而言，第54天）。
[0266] 因而，抗原作為與ALLO的融合蛋白的表達會增強所述抗原的免疫原性。
[0267] 實施例2:LM-LL0_E7治療會引起TC-I特異件的脾細朐增葙
[0268] 為了用Lm-LL0-E7測量Lm-E7對T細胞的誘導，在經免疫的小鼠中測量了E7-特 異性的增生性應答（抗原特異性的免疫活性的一種量度）。得自Lm-LL0-E7-免疫的小鼠的 脾細胞當以20:1、40:1、80:1和160:1的脾細胞：TC-I比率暴露於照射的TC-I細胞（作為 E7的來源）時發生增殖。（圖4)。相反，得自Lm-E7和rLm對照-免疫的小鼠的脾細胞僅 表現出背景增殖水平。
[0269] 實施例3:ActA_E7和PEST-E7融合體會賦予抗腫瘤免疫
[0270] 材料和實駘方法
[0271] Lm-ActA_E7 的構建
[0272] Lm-ActA_E7是LM的重組菌株，其包含表達與截短形式的actA蛋白融合的E7蛋 白的質粒。通過將質粒載體pDD-Ι(通過修飾pDP-2028而構建）引入李斯特菌中，製備 Lm-actA-E7。pDD-Ι包含這樣的表達盒，其表達：310bphly啟動子和hly信號序列（ss) 的一個拷貝，其驅動ActA-E7的表達和分泌；1170bp的actA基因，其包含4個PEST序 列（SEQIDNO: 11)(截短的ActA多肽由該分子的前390個胺基酸組成，SEQIDNO: 10); 300bpHPVE7基因；1019bpprfA基因（控制毒力基因的表達）；和CAT基因（氯黴素抗 性基因），用於選擇轉化的細菌克隆（Sewell等人（2004) ,Arch.Otolaryngol.HeadNeck Surg. , 130:92-97) 〇
[0273] 使用引物 5' -GGGGTCTAGACCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(XbaI位點標有下劃線；SEQ IDNO:33)和引物 5' -ATCTTCGCTATCTGTCGCCGCGGCGCGTGCTTCAGTTTGTTGCGC-' 3(NotI位點 標有下劃線，前18個核苷酸是ActA基因重疊；SEQIDNO: 34)，從pGG55(實施例1)PCR擴增 hly啟動子（pHly)和基因片段。使用引物 5'-GCGCAACAAACTGAAGCAGCGGCCGCGGCGACAGATAG CGAAGAT-3'（NotI位點標有下劃線；SEQIDN0:35)和引物 5'-TGTAGGTGTATCTCCATGCTCGAG AGCTAGGCGATCAATTTC-3'（XhoI位點標有下劃線；SEQIDN0:36)，從LM10403s野生型基因 組PCR擴增actA基因。使用引物 5' -GGAATTGATCGCCTAGCTCTCGAGCATGGAGATACACCTACA-3' (XhoI位點標有下劃線；SEQIDNO: 37)和引物 5'-AAACGGATTTATTTAGATCCCGGGTTATGGTTTC TGAGAACA-3'（XmaI位點標有下劃線；SEQIDN0:38)，從pGG55(pLL0-E7)PCR擴增E7基因。 使用引物 5' -TGTTCTCAGAAACCATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3'(XmaI位點標有下劃線； SEQIDNO: 39)和引物 5' -GGGGGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(Sail位點標有下劃線；SEQ IDNO: 40)，從LM10403s野生型基因組PCR擴增prfA基因。PCR製備hly啟動子-actA基 因融合體（pHly-actA)，並使用上遊pHly引物（SEQIDN0:33)和下遊actA引物（SEQID NO: 36)從純化的pHlyDNA和純化的actADNA進行擴增。
[0274] PCR製備與prfA基因融合的E7基因（E7-prfA)，並使用上遊E7引物（SEQID NO: 37)和下遊prfA基因引物（SEQIDNO:40)從純化的E7DNA和純化的prfADNA進行擴 增。
[0275] PCR製備與E7_prfA融合產物融合的pHly-actA融合產物，並使用上遊pHly引 物（SEQIDN0:33)和下遊prfA基因引物（SEQIDN0:40)從純化的融合的pHly-actA DNA產物和純化的融合的E7-prfADNA產物擴增，並連接進pCRII(Invitrogen，La Jolla,Calif.)。用pCRII_ActAE7 轉化感受態的大腸桿菌（T0P10'F,Invitrogen,La Jolla,Calif.)。裂解和分離以後，使用BamHI(預期的片段大小770bp和6400bp(或當將 插入片段返回載體時：2500bp和4100bp))和BstXI(預期的片段大小2800bp和3900bp) 通過限制性分析來篩選質粒，並且還使用上遊pHly引物（SEQIDNO: 33)和下遊prfA基因 引物（SEQIDNO:40)通過PCR分析進行篩選。
[0276] 將pHly-actA_E7-prfADNA插入片段通過XbaI和SalI雙重消化從pCRII切離， 並連接進也用XbaI和SalI消化的pDP-2028中。在用表達系統pActAE7轉化T0P10'F感 受態大腸桿菌（Invitrogen,LaJolla,Calif.)以後，使用上遊pHly引物（SEQIDNO: 33) 和下遊PrfA基因引物（SEQIDN0:40)通過PCR分析來篩選氯黴素抗性的克隆。在腦心 浸液培養基（含有氯黴素（20111(^(微克）/1111(毫升），0丨化〇,0的1' 〇^，1^(*.)中培養包含pActAE7的克隆，並使用midiprepDNA純化系統試劑盒（Promega,Madison,Wis.)從細菌細 胞分離pActAE7。如在Ikonomidis等人（1994,J.Exp.Med. 180:2209-2218)中所述，用表達 系統pActAE7轉化青黴素處理的李斯特菌的prfA-陰性菌株（菌株XFL-7)，並針對體內質 粒保留來選擇克隆。在37°C在含有氯黴素（20微克/ml)的腦心浸液中培養克隆。在-80°C 在等分試樣中冷凍細菌。
[0277] 抗原表達的免疫印跡驗證
[0278] 為 了驗證Lm-ActA_E7 分泌ActA_E7 (約 64kD)，在Luria-Bertoni(LB)培養基中 在37°C培養李斯特菌菌株。用三氯乙酸（TCA)從培養物上清液中沉澱蛋白，並再懸浮於含 有0.IN氫氧化鈉的Ix樣品緩衝液中。將相等量的每種TCA沉澱的上清液加載上4%至 20%Tris-甘氨酸十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠（NOVEX，SanDiego,Calif)。將凝膠 轉移至聚偏氟乙烯膜，並用1:2500抗-E7單克隆抗體（ZymedLaboratories,SouthSan Francisco,Calif)探測，然後用1:5000辣根過氧化物酶-綴合的抗-小鼠IgG(Amersham PharmaciaBiotech,LittleChalfont,英國）探測。將印跡用Amersham增強的化學發光 檢測試劑顯影，並暴露於放射自顯影術膠片（Amersham)(圖5A)。
[0279] Lm-PEST-E7、Lm-ΛPEST-E7 和Lm-E7印i的構建（圖 6A)
[0280] Lm-PEST-E7與Lm-LL0-E7相同，但是它僅含有hly基因的啟動子和PEST序列，具 體而言，LLO的前50個胺基酸。為了構建Lm-PEST-E7,使用SOE(通過重疊延伸實現的基因 剪接）PCR技術，使hly啟動子和PEST區域與全長E7基因融合。從質粒pGG-55 (其含有LLO 的前441個胺基酸）擴增E7基因和hly-PEST基因片段，並通過常規PCR技術剪接到一起。 為了建立最終的質粒PVS16. 5,將hly-PEST-E7片段和prfA基因亞克隆進質粒pAM401 (其 包括用於體外選擇的氯黴素抗性基因）中，並使用得到的質粒轉化XFL-7。
[0281] Lm-ΛPEST-E7是與Lm-LL0-E7相同的重組李斯特菌菌株，但是它缺少PEST序列。 基本上如關於Lm-PEST-E7所述製備它，但是使用被設計成從hly-E7融合基因除去含有 PEST的區域（bp333-387)的引物構建附加型表達系統。Lm-E7印i是分泌不含PEST區域 或LLO的E7的重組菌株。用於轉化該菌株的質粒含有與E7基因融合的hly啟動子和信號 序列的基因片段。該構建體不同於原始的Lm-E7,所述Lm-E7表達整合進染色體中的E7基 因的單個拷貝。除了表達的E7抗原的形式以外，Lm-E7印i是與Lm-LL0-E7、Lm-PEST-E7和 Lm-ΛPEST-E7完全同基因的。
[0282] MS
[0283] 為了對比Lm-ActA-E7相對於Lm-LL0-E7誘導的抗腫瘤免疫，將2χ105個TC-I腫瘤 細胞皮下地植入小鼠中，並允許其生長至可觸知的大小（大約5毫米[mm])。在第7和14天， 用ILD5tl 的Lm-ActA-E7 (5xl08CFU)(交叉）、Lm-LL0-E7 (IO8CFU)(正方形）或Lm-E7 (IO6CFU) (圓形）腹膜內免疫小鼠。在第26天之前，在Lm-LL0-E7和Lm-ActA-E7中的所有動物都沒 有腫瘤且保持如此,而所有原初動物（三角形）和用Lm-E7免疫的動物生長出大腫瘤（圖 5B)。因而，使用ActA-E7融合體的疫苗接種造成腫瘤消退。
[0284] 另外，針對它們的造成表達E7的腫瘤的消退的能力，對比了Lm-LL0-E7、 Lm-PEST-E7、Lm-APEST-E7和Lm-E7印i。在40隻C57BL/6小鼠的左脅腹上建立皮下TC-I 腫瘤。在腫瘤已經達到4-5mm以後，將小鼠分成5個8隻小鼠的組。每組用4種重組LM疫 苗之一治療，並且1個組保持不治療。Lm-LL0-E7和Lm-PEST-E7分別在5/8和3/8的病例 中誘導了建立的腫瘤的消退。在任何時間點在用Lm-PEST-E7或Lm-LL0-E7治療的小鼠的平 均腫瘤大小之間沒有統計差異。但是，表達不含PEST序列的E7、Lm-ΛPEST-E7和Lm-E7印i 的疫苗在除了 1隻以外的所有小鼠中沒有造成腫瘤消退（圖6B，上圖）。這是2個實驗的 代表，其中在用Lm-LL0-E7或Lm-PEST-E7治療的腫瘤與用Lm-E7印i或Lm-ΛPEST-E7治療 的腫瘤之間，觀察到在第28天時平均腫瘤大小的統計上顯著的差異；Ρ〈0. 001，Student氏 t檢驗；圖6B，下圖）。另外，在用含有PEST的疫苗接種的小鼠的脾中，在3個實驗中可再 現地觀察到四聚體陽性脾細胞的增加的百分比（圖6C)。因而，使用PEST-E7融合體的疫苗 接種造成腫瘤消退。
[0285] 實施例4 :E7與LLO、ActA、或PEST-樣序列的融合會增強E7-特異件的免疫和產 牛潯潤腫瘤的E7-特異件的⑶81細朐
[0286] 材料和實駘方法
[0287] 在12隻C57BL/6小鼠（η= 3)的左脅腹皮下地植入500mcl(微 升）MATRIGEL·?,其包含100微升的在磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)中的2xl05個TC-I腫瘤 細胞和 400 微升的MATRIGEL?I(BDBiosciences,FranklinLakes,N.J.)。在第 7、14 和21天腹膜內地免疫小鼠，並在第28天收穫脾和腫瘤。將腫瘤MATRIGEL從小鼠取出，並 在含有2毫升（ml)RP10培養基的試管中在冰上在4°C溫育過夜。將腫瘤用鑷子切碎，切成 2mm塊，並與3ml酶混合物（0· 2mg/ml膠原酶-P、lmg/mlDNA酶-1在PBS中）一起在37°C 溫育1小時。將組織混懸液穿過尼龍網過濾，並用5 %胎牛血清+0. 05%的NaN3在PBS中 的溶液洗滌進行四聚體和IFN-Y染色。
[0288] 在有布雷菲德菌素A存在下以IO7個細胞/ml，將脾細胞和腫瘤細胞與1微摩爾 (mcm)E7肽一起溫育5小時。將細胞洗滌2次，並在50微升的抗-小鼠Fc受體上清液 (2. 4G2)中在4°C溫育1小時或過夜。針對表面分子⑶8和⑶62L將細胞染色，滲透化處 理，使用透化試劑盒G〇lgi_St〇p? 或Golgi-P丨Ug?彳（Pharmingen,SanDiego,Calif.)固 定，並針對IFN-γ染色。使用雙雷射流式細胞計FACSCalibur獲取500, 000個事件，並使 用Cellquest軟體（BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)分析。計算在活化的（CD62L ffi)⑶8+T細胞內的IFN-Y分泌細胞的百分比。
[0289] 對於四聚體染色，給H_2Db四聚體加載藻紅蛋白（PE)-綴合的E7肽 (RAHYNIVTF，SEQIDN0:32)，在室溫染色1小時，並用抗-別藻藍蛋白（APC)綴合的 MEL-14(⑶62L)和FITC-綴合的⑶8β在4°C染色30min。通過對比脾中和腫瘤中的四聚體 +CD8+CD62Lffi細胞，分析細胞。
[0290] 益果
[0291] 為了分析Lm-ActA-E7的增強抗原特異性的免疫的能力，給小鼠植入TC-I腫瘤細 胞，並用Lm-LL0-E7 (IxlO7CFU)、Lm-E7 (IxlO6CFU)或Lm-ActA-E7 (2xl08CFU)免疫，或者不處 理（原初）。得自Lm-LL0-E7和Lm-ActA-E7組的小鼠腫瘤含有比在Lm-E7或原初小鼠中更 高百分比的分泌IFN-γ的⑶8+T細胞（圖7A)和四聚體-特異性的⑶8+細胞（圖7B)。
[0292] 在另一個實驗中，給荷瘤小鼠施用Lm-LL0-E7、Lm-PEST-E7、Lm-ΛPEST-E7或 Lm-E7epi，並測量腫瘤內的Ε7-特異性的淋巴細胞的水平。在第7和14天用0.ILD5tl的4種 疫苗治療小鼠。在第21天收穫腫瘤，並用針對CD62L、CD8的抗體和用E7/Db四聚體染色。 在接種Lm-LL0-E7和Lm-PEST-E7的小鼠中觀察到四聚體-陽性的淋巴細胞在腫瘤內增加 的百分比（圖8A)。該結果在3個實驗中是可再現的（圖8B)。
[0293] 因而，Lm-LL0-E7、Lm-ActA-E7和Lm-PEST-E7各自有效地誘導浸潤腫瘤的CD8+T細 胞和腫瘤消退。
[0294] 材料和實駘方法（參見實施例5-10)
[0295] 細菌菌株、轉化和選擇
[0296] 使用標準方案，將大腸桿菌菌株MB2159用於轉化。通過用H2O洗滌，將細菌細胞 準備用於電穿孔。
[0297] 大腸桿菌菌株MB2159(StrychU等人，FEMSMicrobiolLett. 2001Marl5 ; 196(2) :93-8)是不能合成D-丙氨酸消旋酶的air(-)/dadX(_)缺陷型突變體。李斯特菌菌 株Lmdal(-)/dat(_) (Lmdd)由於dal和dat基因的部分缺失同樣不能合成D-丙氨酸消旋 酶。
[0298] 質粒構建
[0299] 使用公開的plcA基因的序列（Mengaud等人，Infect.Tmmun. 198957, 3695-3701)， 使用PCR擴增來自染色體DNA的基因。然後使用Sail-和XbaI產生的DNA末端將擴增產 物連接進PAM401中，以產生pDP1462。
[0300] 如下構建含有單獨prfA的質粒pDP1500 :在用XbaI和PstI限制酶切以後，從 PDP1462刪除plcA基因，即鹼基429-1349 (Mengaud等人，出處同上），用T4DNA聚合酶處 理DNA末端以使它們成為鈍端，並進行分子內連接。
[0301] 如下構建含有plcA啟動子和plcA的3'末端的一部分的質粒pDP1499:在用 PstI和NsiI限制酶切以後，從pDP1339刪除plcA內部片段，即鹼基428-882 (Mengaud等 人，Infect.Immun. 198957, 3695-3701)，並進行分子內連接。
[0302] 通過單次連接下述3部分，構建pDP1526(pKSV7 :AplcA):用BAMHI和XbaI限制 酶切的PKSV7 ;得自pAM401的XbaI和NsiI產生的468鹼基對片段：含有plcA的5'末端 的plcA(鹼基882-1351 ;Mengaud等人，出處同上）；和，得自pAM401的PstI-和BamHI-產 生的501鹼基對片段：含有plcA的3'末端的plcAprfA(鹼基77-429 ;Mengaud等人，出 處同上）。
[0303] 通過EcoRI和PstI雙重消化pDP1462,分離出prfA啟動子，即鹼基1-429(Mengaud 等人，出處同上），隨後將該片段連接進EcoRI-和PstI-限制酶切的pKSV7中，以產生 PDP1498。將2個隨機的HindIII-產生的10403S染色體DNA片段（長度為大約3kb)連接 進HindIII-限制酶切的pKSV7中，以產生隨機的整合控制質粒pDP1519和pDP1521。
[0304] 產單核細胞李斯特菌突變株的構建
[0305] 從如以前所述構建的SLCC5764的Tn917-LTV3庫（Camilli等人，J. Bacteriol. 1990, 172, 3738-3744)，分離出產單核細胞李斯特菌菌株DP-L1387作為具有減 少的卵磷脂酶的突變體（PC-PLC)。通過如以前所述對一個轉座子-染色體DNA連接部測 序（Sun等人，Infect.Immun. 199058, 3770-3778)，確定Tn917-LTV3 插入位點。如以前所 述（Camilli等人，出處同上），用質粒DNA轉化產單核細胞李斯特菌。在有IOyg氯黴素 /ml培養基存在下，施加用於維持PAM401、pKSV7和它們在產單核細胞李斯特菌中的衍生物 的選擇壓力。另外，PKSV7衍生物的維持需要在30°C(革蘭氏陽性細菌中的質粒複製的許 可溫度）生長。
[0306] pKSV7衍生物向產單核細胞李斯特菌染色體中的整合，通過質粒上的產單核細 胞李斯特菌DNA序列和它們的對應染色體等位基因之間的同源重組而發生。通過在含有 10μg氯黴素/ml培養基的腦心浸液（BHI)液體培養基中在40°C(pKSV7複製的非許可溫 度）培養大約30代，富集整合突變體。隨後在含有10μg氯黴素/ml培養基的BHI瓊脂上 菌落純化每個整合菌株，並在40°C溫育。從每個整合菌株分離出的染色體DNA的DNA印跡 分析證實了整合的質粒的存在。
[0307] 如上所述，通過pKSV7衍生物pDP1526的整合，實現DP-L1552的構建，以產生部分 二倍體中間體。整合的質粒通過分子內同源重組實現的自發切除以低頻率發生。通過在BHI 液體培養基中在30°C培養大約50代，富集這樣的細菌：其中質粒已經從染色體切離。在該 步驟中的選擇壓力的性質是未知的，但是可能是由於含有整合的溫度敏感質粒的菌株的輕 微生長缺陷。大約50%的切除事件，S卩，由缺失的3'側的序列之間的同源重組產生的那些， 導致AplcA對染色體上的野生型等位基因的等位基因交換。
[0308] 通過將所述細菌在BHI中在40°C培養大約30代，使切離的質粒自愈。如下鑑別在 染色體上保留ΛplcA等位基因的自愈質粒的細菌：在含有5mlBHI瓊脂/2. 5 %蛋黃/2. 5 % 磷酸鹽緩衝鹽水（PBS) (BHI/蛋黃瓊脂）的覆蓋層的BHI瓊脂平板上培養以後，它們不能在 菌落周圍產生渾濁地帶。渾濁地帶源自蛋黃中的PI的PI-PLC水解，從而產生不溶性的二 醯甘油沉澱物。通過使用PCR擴增缺失的等位基因和對缺失測序，證實在產單核細胞李斯 特菌染色體上的正確PlcA缺失。
[0309] 因而，根據本發明，可以使用PI-PLC陰性突變體（plcA缺失突變體）來產生減毒 的產單核細胞李斯特菌疫苗。使用相同方法製備其它突變體，即，actA缺失突變體、plcB缺 失突變體和缺失PlcA和plcB二者的雙重突變體，它們也都可以根據本公開內容用於產生 減毒的產單核細胞李斯特菌疫苗。鑑於本公開內容，本領域技術人員將能夠製備除了上述 的那些以外的其它減毒的突變體。
[0310] Lmdd的構建
[0311] 首先藉助於染色體基因和溫度敏感的穿梭質粒PKSV7之間的雙等位基因交換 (SmithK等人，Biochimie. 1992Jul_Aug;74 (7-8) : 705-11)，將dal基因滅活，所述穿梭質 粒PKSV7攜帶在得自原始850-bpdal基因PCR產物的Y末端的450-bp片段和得自dal 基因PCR產物的3'末端的450-bp片段之間的紅黴素抗性基因。隨後，通過使用pKSV7的 類似交換反應，構建覆蓋82 %的基因的dal缺失突變體，所述pKSV7攜帶得自期望的缺失周 圍的完整基因（包括所述基因的上遊和下遊序列）的5'和3'末端的同源性區域。使用 PCR分析確認該染色體缺失的結構。
[0312] 通過類似的等位基因交換反應，將染色體dat基因滅活。將pKSV7修飾成攜帶 450-bp片段，該片段通過PCR衍生自完整dat基因（包括所述基因的上遊和下遊序列）的 5'和3'末端。通過適當的PCR，連接這2個片段。該構建體向染色體中的交換，會導致 dat基因的30%的中央鹼基的缺失，這通過PCR分析進行證實。
[0313] 李斯特菌的細菌培養物和體內傳代
[0314] 按照標準方法，培養大腸桿菌。在含有50μg/ml鏈黴素的LB培養基 (Difc〇，Detr〇it，MI)中在37°C、250rpm搖動下培養李斯特菌，並在指數生長期中收穫。對 於Lm-LL0E7,將37yg/ml氯黴素加入培養基中。對於生長動力學確定，在IOmlLB+抗生素 中培養細菌16小時。測量OD6tltlmi，並將培養物密度在菌株之間標準化。將培養物1:50稀釋 進LB+合適的抗生素和D-丙氨酸（如果適用的話）中。
[0315] LM在小鼠中的傳代
[0316] 將lxIO8個CFU腹膜內地（ip.)注射進C57BL/6小鼠。在第3天，分離脾，並在 PBS中均質化。將脾混懸液的等分試樣鋪板在含有抗生素（如果適用的話）的LB平板上。 繁殖幾個菌落，並混合，以建立注射儲備液。
[0317] 不含抗生素抗性因子的質粒pTV3的構建
[0318] p60_dal盒的構建。構建不含抗生素抗性基因的載體的第一步是，構建截短的p60 啟動子與dal基因的融合體。通過從LM菌株10403S的基因組PCR擴增，分離出LM丙氨酸 消旋酶（dal)基因（正向引物：5'-CCATGGTGACAGGCTGGCATC-3'；SEQIDN0:41)(反 向引物：5'-GCTAGCCTAATGGATGTATTTTCTAGG-3'；SEQIDN0:42)和最小p60 啟動 子序列（正向引物：5'-TTAATTAACAAATAGTTGGTATAGTCC-3'；SEQIDNo:43)(反 向引物：5'-GACGATGCCAGCCTGTCACCATGGAAAACTCCTCTC-3'；SEQIDNo:44)。 所述引物會引入p60序列的上遊PacI位點、dal序列的下遊NheI位點（限制位點以粗體 顯示）和p60啟動子的下遊重疊dal序列（前18個鹼基對），用於隨後通過剪接重疊延伸 (SOE)-PCR融合p60 和dal。截短的p60 啟動子的序列為：CAAATAGTTGGTATAGTCCTCTTTAG CCTTTGGAGTATTATCTCATCATTTGTTTTTTAGGTGAAAACTGGGTAAACTTAGTATTATCAATATAAAATTAATT CTCAAATACTTAATTACGTACTGGGATTTTCTGAAAAAAGAGAGGAGTTTTCC(SEQIDN0:45)(Kohler等 人，JBacteriol173:4668-74,1991)。使用S0E-PCR，融合p60和dalPCR產物，並克隆進 克隆載體pCR2.1(Invitrogen，LaJolla，CA)中。
[0319] 從pGG55除去抗生素抗性基因。從pGG55除去氯黴素乙醯基轉移酶（CAT)基因和 引入p60-dal盒的後續克隆策略也會間斷地導致革蘭氏陽性複製區域（oriRep;Brantl等 人，NucleicAcidRes18:4783-4790, 1990)的除去。為了重新引入革蘭氏陽性oriR印， 使用在該序列上遊添加Narl/Ehel位點的5' -引物（GGCGCCACTAACTCAACGCTAGTAG，SEQID NO: 46)和在該序列下遊添加NheI位點的 3' -引物（GCTAGCCAGCAAAGAAAAACAAACACG,SEQID N0:47)，從pGG55PCR擴增oriRep。將PCR產物克隆進克隆載體pCR2. 1中，並驗證序列。
[0320] 為了將p60_dal序列整合進pGG55載體中，通過Pacl/Nhel雙消化，從pCR_p60dal 切離p60-dal表達盒。通過PCR(引物 1，5'-GTCGACGGTCACCGGCGCCACTAACTCAAC GCTAGTAG-3，；SEQIDNo:48)、（引物2, 5,-TTAATTAAGCTAGCCAGCAAAGAAMACAA ACACG-3'；SEQIDNo:49)，從pCR-oriR印擴增革蘭氏陽性細菌在pGG55中的複製區域，以 引入另外的EheI和NheI限制位點。將PCR產物連接進pCR2.l-T0P0(Invitrogen，Carlsb ad，Calif.)中，並驗證序列。通過Ehel/Nhel消化，切離複製區域，並用EheI和NheI雙重 消化載體PGG55,從而從質粒同時除去2個CAT基因。將2個插入片段（p60-dal和oriR印） 和PGG55片段連接到一起，產生pTV3(圖9)。pTV3也含有prfA(致病性調節因子A)基因。 該基因不是PTV3的功能所必需的，但是可以用於這樣的情形：其中需要或期望另外的選擇 的標誌物。
[0321] 用於實時PCR的DNA的製備
[0322] 使用Masterpure?'TotalDNA試劑盒（Epicentre,Madison,WI)，製備全李斯特 菌DNA。將李斯特菌在25mlLuria-Bertoni液體培養基（LB)中在37°C和250rpm搖動下培 養24小時。通過離心使細菌細胞沉澱，再懸浮於補充了 5mg/ml溶菌酶的PBS中，並在37°C 溫育20分鐘，此後分尚DNA。
[0323] 為了得到用於實時PCR的標準靶DNA，從pGG55PCR擴增LL0-E7基因（(5'-ATGAAA AAAATAATGCTAGTTTTTATTAC-3'（SEQIDN0:50) ;5'-GCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGTGGT TTCTGAGAACAGATG-3'（SEQIDN0:51))，並克隆進載體pETbluel(Novagen，SanDiego，CA)。 類似地，將PlcA擴增子克隆進pCR2. 1。分別用pET-LL0E7和pCR-plcA轉化大腸桿菌，並制 備純化的質粒DNA用於實時PCR。
[0324] 實時PCR
[0325] 使用下述引物：5'-GCAAGTGTGACTCTACGCTTCG-3'（SEQIDN0:52); 5'-TGCCCATTAACAGGTCTTCCA-3'（SEQIDN0:53) ;5'-FAM-TGCGTACAAAGCACACACGTAGACAT TCGTAC-TAMRA-3'（SEQIDN0:54)和單拷貝基因plcA(TGACATCGTTTGTGTTTGAGCTAG-3'（SE QIDN0:55)、5'-GCAGCGCTCTCTATACCAGGTAC-3'（SEQIDN0:56) ;5'-TET-TTAATGTCCATGTT ATGTCTCCGTTATAGCTCATCGTA-TAMRA-3'；SEQIDN0:57)作為李斯特菌基因組靶標，使用ABI PrimerExpress軟體（AppliedBiosystems)，用E7作為質粒祀標，設計Taqman引物-探針 集合（AppliedBiosystems，FosterCity,CA)。
[0326] 按照生產商的推薦，將(λ4μM引物和(λ05mM探針與PuRETaqRTGPCR珠子 (Amersham,Piscataway,NJ)混合。使用純化的質粒DNA、pET_LL0E7 和pCR-plcA(內部標 準品），製備每種靶標的標準曲線，並用於計算未知樣品中的基因拷貝數。基於標準曲線，計 算E7拷貝/plcA拷貝的平均比率，並通過將Lmdd-TV3和Lm-LL0E7的結果除以得自Lm-E7 的結果來進行校準，所述Lm-E7是含有整合進基因組中的E7基因的單個拷貝的李斯特菌菌 株。在每個重複3次的qPCR測定中，一式三份地運行所有樣品。使用KyPlot軟體，通過雙 因素方差分析（Two-WayAN0VA)，分析樣品之間的變異。如果p〈0. 05,將結果視作統計上顯 著的。
[0327] 生長測量
[0328] 在LuriaBertani(LB)培養基 ± 100 微克（μg)/mlD-丙氨酸和 / 或 37μg/ml 氯黴素中，在37°C、250rpm搖動下培養細菌。基於0D6(l(lnm測量結果，調節起始接種物至所 有菌株為相同值。
[0329] 溶血裂解測定
[0330] 融化4xl09CFU的李斯特菌，通過離心（1分鐘，HOOOrpm)進行沉澱，並再懸浮於 100μ1含有IM半胱氨酸的PBS(pH5. 5)中。將細菌進行系列1:2稀釋，並在37°C溫育45 分鐘，以便活化分泌的LL0。將去纖維蛋白的全綿羊血液（Cedarlane,Hornby,Ontario,加 拿大）用5體積的PBS洗滌2次，並用6體積的PBS-半胱氨酸洗滌3-4次，直到上清液保 持澄清，在洗滌步驟之間將細胞在3000xg沉澱8分鐘，然後在PBS-半胱氨酸中再懸浮至 10% (v/v)的終濃度。將100μ1 10%經洗滌的血細胞與100μ1李斯特菌混懸液混合，並 在37°C溫育另外45分鐘。然後通過離心（10分鐘，IOOOxg)，沉澱未裂解的血細胞。將 100μ1上清液轉移進新平板，並確定OD53tlnm，相對於樣品稀釋度繪圖。
[0331] Lmdd_Tv3的治療效果
[0332] 將IO5TC-I(ATCC，馬納薩斯，VA)皮下地植入C57BL/6小鼠（η= 8)中，並允許其 生長約7天，此後，腫瘤是可觸知的。TC-I是用HPVE6和E7永生化並用活化的ras轉化的 C57BL/6上皮細胞系，其在皮下植入後形成腫瘤。在腫瘤細胞植入後第7和14天，用0.ILD5tl 的適當的李斯特菌菌株免疫小鼠。還包括未免疫的對照組（原初）。用電子測徑器測量腫 瘤生長。
[0333] ActA缺失突變體的製備
[0334] 通過致病因子ActA的不可逆缺失，使菌株Lmdaldat(Lmdd)減毒。構建actA在 Lmdaldat(Lmdd)背景下的框架內缺失，以避免對下遊基因的表達的任何極化效應。Lmdal datΛactA含有在N-端處的前19個胺基酸和C-端的28個胺基酸殘基，缺失了ActA的 591個胺基酸。使用與actA缺失區域的外部對合的引物，驗證所述基因在染色體斑點中的 缺失。這些是如圖 12 所示的引物 3(Adv305_tgggatggccaagaaattc)(SEQIDN0:58)和 4(Adv304_ctaccatgtcttccgttgcttg)(SEQIDN0:59)。對分離自Lmdd和Lm-ddAactA的 染色體DNA進行PCR分析。預期在Lm-dd染色體DNA中用2組不同的引物對I、2和3、4擴 增以後的DNA片段的大小為3.OKb和3. 4Kb。但是，對於Lm-ddAactA，使用引物對1、2和 3、4的PCR的預期大小為I. 2Kb和I. 6Kb。因而，在圖12中的PCR分析證實，actA的I. 8kb 區域在菌株Lm-ddΔactA中缺失。還對PCR產物進行了DNA測序，以證實含有actA的區域 在菌株Lm-ddΛactA中的缺失（圖13)。
[0335] gcgccaaatcattggttgattggtgaggatgtctgtgtgcgtgggtcgcgagatgggcgaataagaagc attaaagatcctgacaaatataatcaagcggctcatatgaaagattacgaatcgcttccactcacagaggaaggcga ctggggcggagttcattataatagtggtatcccgaataaagcagcctataatactatcactaaacttggaaaagaaa aaacagaacagctttattttcgcgccttaaagtactatttaacgaaaaaatcccagtttaccgatgcgaaaaaagcg cttcaacaagcagcgaaagatttatatggtgaagatgcttctaaaaaagttgctgaagcttgggaagcagttggggt taactgattaacaaatgttagagaaaaattaattctccaagtgatattcttaaaataattcatgaatattttttctt atattagctaattaagaagataactaactgctaatccaatttttaacggaacaaattagtgaaaatgaaggccgaat tttccttgttctaaaaaggttgtattagcgtatcacgaggagggagtataagtgggattaaacagatttatgcgtgc gatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacgtcgacccatacgacgttaattcttgca atgttagctattggcgtgttctctttaggggcgtttatcaaaattattcaattaagaaaaaataattaaaaacacag aacgaaagaaaaagtgaggtgaatgatatgaaattcaaaaaggtggttctaggtatgtgcttgatcgcaagtgttct agtctttccggtaacgataaaagcaaatgcctgttgtgatgaatacttacaaacacccgcagctccgcatgatattg acagcaaattaccacataaacttagttggtccgcggataacccgacaaatactgacgtaaatacgcactattggctt tttaaacaagcggaaaaaatactagctaaagatgtaaatcatatgcgagctaatttaatgaatgaacttaaaaaatt cgataaacaaatagctcaaggaatatatgatgcggatcataaaaatccatattatgatactagtacatttttatetc atttttataatcctgatagagataatacttatttgccgggttttgctaatgcgaaaataacaggagcaaagtatttc aatcaatcggtgactgattaccgagaagggaa(SEQIDNO:60)。
[0336] 炎症性細胞因子的產生：
[0337] 用不同的李斯特菌骨架諸如LmprfA-(pGG55)、Lmdaldat、LmdaldatactA、Lm daldatactAAinlC和LmdaldatAinlC感染巨噬細胞諸如RAW264. 7,並在不同的時間 點收穫上清液，以使用不同的基於ELISA的試劑盒定量不同細胞因子的水平。定量的細胞 因子包括IFN-γ、TNF-α和IL-6。
[0338] 體內細胞因子產生：
[0339] 為了測量體內細胞因子產生和嗜中性粒細胞募集，給C57BL/6小鼠腹膜內地注射 不同的IO8CFU的LmprfA_(pGG55)、Lmdaldat、LmdaldatactA、LmdaldatactAAinlC 和LmdaldatAinlC、李斯特菌對照或等體積的鹽水。12h後，殺死小鼠，並用2mLPBS洗 滌腹膜腔。在生長培養基上鋪板以後，檢查腹膜洗液的細菌載荷，並使用流式細胞計量術分 析促炎性細胞因子諸如MIP-Ia、KC、MCP等。在用標誌物諸如Gr-U⑶Ilb和F4/80染色 以後，確定嗜中性粒細胞和巨噬細胞的數目，並進一步使用CellQuest軟體定量這些群體。
[0340] Transwell遷移測定：
[0341] 進行該測定，以確定在用inlC缺失菌株感染源自骨髓的巨噬細胞或樹突細胞以 後，是否存在嗜中性粒細胞遷移的增加。從小鼠諸如C57BL/6分離源自骨髓的巨噬細胞 或樹突細胞，並用inlC缺失突變體或對照李斯特菌感染。使用感染的細胞，使用corning costarTranswell平板，建立transwell測定。最初使用3、5或8微米孔transwell平板， 將測定標準化。為了試驗嗜中性粒細胞遷移，將受感染的APC鋪板在平板的底部，並將嗜中 性粒細胞鋪板在室的孔的頂部。在不同的時間點，計數細胞，以確定已經遷移至底部的嗜中 性粒細胞的數目。
[0342] LmdaldatactAΔinlC突變體的治療效果：
[0343] 為了確定inlC突變體的治療效果，使用人前列腺特異性抗原（PSA)作為腫瘤抗 原，作為概念的證據。用質粒pAdvl42(其含有人PSA的表達盒）轉化骨架Lmdaldat actAinlC，從而產生LmddAinlC142。針對融合蛋白tLLO-PSA的表達和分泌，表徵菌株 LmddAinlC142。此外，將菌株LmddAinlC142在小鼠體內傳代2次，並針對融合蛋白tLLO-PSA 的表達和分泌，檢查在2次體內傳代以後得到的菌落。從第二次體內傳代以後得到的菌落 製備疫苗工作儲備液，並將其用於評估治療效果和免疫原性。
[0344] 對腫瘤微環境的影響：
[0345] 確定了LmddA、LmddAΔactA、LmddAΔPlcA、LmddAΔPlcB、LmddAΔprfA、 LmddAinlC142、LmddA142和其它對照菌株的造成免疫細胞在腫瘤微環境中的滲入的能力。 在該研究中，在第〇天給小鼠接種lxIO6個TPSA23腫瘤細胞，並在第7、14和21天接種 IO8CFU的LmddAinlC142、LmddA142和其它對照菌株。在第28天收穫腫瘤，並處理，用於使 用不同的細胞表面標誌物諸如Gr-1、CDllb、CD3、CD4、CD8、CD25、Foxp3、NKL1和CD62L進 一步染色。使用這些標誌物檢查的不同細胞群體包括巨噬細胞（CDllb+)、NK細胞（NK1.Γ)、 嗜中性粒細胞（Gr-Γ⑶Ilb+)、源自骨髓的抑制細胞（MDSC) (Gr-Γ⑶Ilb+)、調節性T細胞 (⑶4+CD25+Foxp3+)和效應T細胞（⑶8+⑶3+CD62Lffi)。此外，表徵了效應T細胞的產生效應 細胞因子諸如IFN-γ、TNF-a和IL-2的功能能力。試驗了瘤內調節性T細胞和MDSC的造 成T細胞增殖抑制的能力。
[0346] MS
[0347] 實施例5 :含有氨某酸代謝酶而不是抗牛素抗件某閔的質粒在體外和在體內都被 保留在大腸杆囷和LM中
[0348] 使用基於D-丙氨酸消旋酶的營養缺陷型互補系統來介導LM中的質粒保留，而 不使用抗生素抗性基因。大腸桿菌菌株MB2159是不能合成D-丙氨酸消旋酶的air(-)/ dadX(-)缺陷型突變體。李斯特菌菌株Lmdal(_)/dat(_)(Lmdd)由於dal和dat基因的部 分缺失同樣不能合成D-丙氨酸消旋酶。如下修飾基於大腸桿菌-李斯特菌穿梭載體pAM401 的質粒PGG55 :除去2個CAT基因，並用在李斯特菌p60啟動子控制下的p60-dal表達盒替 換它們，以產生PTV3 (圖9)。從幾個菌落純化DNA。
[0349] 實施例6 :含有代謝酶的質粒不會增加細菌的毒力
[0350] 由於毒力與LLO功能有關，對比了Lmdd-TV3和Lm-LL0E7之間的溶血裂解活性。該 測定通過紅血細胞的裂解來試驗LLO功能，且可以用培養物上清液、純化的LLO或細菌細胞 進行。Lmdd-TV3顯示出比Lm-LL0E7更高的溶血裂解活性。
[0351] 還通過確定LD5tl值來測量體內毒力，所述LD5tl值是測量毒力的更直接的、且因此更 準確的方式。Lmdd-TV3的LD5tl (0. 75xl09)非常接近於Lm-LL0E7的LD5tl (IxlO9)，從而表明含 有代謝酶的質粒不會增加細菌的毒力。
[0352] 實施例7 :用含有代謝酶的質粒誘導抗腫瘤免疫
[0353] 在腫瘤消退模型中確定了含有代謝酶的質粒作為癌症疫苗的效力。使用TC-I 細胞系模型，其針對HPV疫苗開發進行了確定表徵，且其允許受控地對比在免疫接種 Lmdd-TV3或Lm-LL0E7以後建立的類似大小的腫瘤的消退。在2個單獨的實驗中，Lmdd-TV3 和Lm-LL0E7對小鼠的免疫接種導致了類似的腫瘤消退（圖14)，在接種疫苗的組之間沒有 統計上顯著的差異（P〈〇. 05)。所有免疫的小鼠在63天後仍然存活，而未免疫的小鼠在它們 的腫瘤達到20mm直徑時必須處死。治癒的小鼠保持無腫瘤至實驗結束。
[0354] 因而,含有代謝酶的質粒作為治療性癌症疫苗是有效的。因為治療性癌症疫苗需 要的免疫應答強於預防性癌症疫苗需要的免疫應答，這些結果證實了同樣作為預防性癌症 疫苗的實用性。
[0355] 實施例8 :inlC_缺失突奪體產牛顯著高水平的趨化閔子和細朐閔子
[0356] inlC缺失突變體產生顯著高水平的趨化因子諸如MIP-Ia、KC(IL_8的小鼠同系 物）、MCP，從而導致嗜中性粒細胞和白細胞向感染部位的滲入。因而，當腹膜內地施用不同 的李斯特菌菌株時，inlC突變體表現出這些細胞因子和趨化因子的產生的增加，它們將嗜 中性粒細胞和巨噬細胞吸引到注射後12h得到的腹膜液中。此外，與對照菌株相比，inlC缺 失突變體產生顯著高水平的炎症性細胞因子。
[0357] 實施例9:inlC-缺失突奪體會誘導嗜中件粒細朐訐移
[0358] 與其它對照菌株相比，被inlC缺失突變體感染的巨噬細胞在不同的時間點表現 出嗜中性粒細胞遷移的顯著增加。該實驗的結果有力地支持了該菌株在感染過程中吸引免 疫細胞（諸如嗜中性粒細胞）的能力。
[0359] 實施例10:inlC-缺失突奪體會實現治療件抗腫瘤應答
[0360] 使用LmddA142和LmddAinlC142的抗腫瘤研究的結果彼此非常相當，且觀察到腫 瘤的治療消退。此外，2劑LmddAinlC142與3劑菌株LmddA142相當，因為它的產生高水平 的先天性應答的能力和增加的促炎性細胞因子分泌。
[0361] 材料和方法（實施例11-16)
[0362] 寡核苷酸由Invitrogen(Carlsbad，CA)合成，並且由GenewizInc,South Plainfield,NJ進行DNA測序。流式細胞計量術試劑購自BectonDickinson Biosciences(BD，SanDiego,CA)。除非指出，否則細胞培養基、添加物和所有其它試劑得 自（St.Louise,MO)。由EZbiolabs(Westfield,IN)合成Her2/neuHLA-A2 肽。完全RPMI 1640(C-RPMI)培養基含有2mM穀氨醯胺、0.ImM非必需胺基酸和ImM丙酮酸鈉、10%胎牛血 清、青黴素/鏈黴素、Hepes(25mM)。以前描述了多克隆抗-LLO抗體，抗-Her2/neu抗體購 自Sigma。
[0363] 小鼠和細胞系
[0364] 根據IAQJC核准的方案在賓夕法尼亞大學（UniversityofPennsylvania)或羅 格斯大學（RutgersUniversity)進行所有動物實驗。FVB/N小鼠購自Jackson實驗室（Bar Harbor,ME)。在賓夕法尼亞大學的動物中心機構圈養和飼養FVB/NHer2/neu轉基因小鼠， 其過表達大鼠Her2/neu腫瘤蛋白。NT-2腫瘤細胞系表達高水平的大鼠Her2/neu蛋白，其 源自這些小鼠的自發性乳腺腫瘤，如之前描述培養。DHFR-G8(3T3/neu)細胞得自ATCC，並 且根據ATCC建議進行培養。EMT6-LUC細胞系是得自JohnOhlfest博士（明尼蘇達大學 (UniversityofMinnesota) ,MN)的慷慨禮物，並且在完全C-RPMI培養基中培養。在賓夕 法尼亞大學（Philadelphia，PA)小動物成像機構（SAIF)的指導下進行生物發光工作。
[0365] 李斯特菌構建體和抗原表達
[0366] Her2/neu_pGEM7Z由賓夕法尼亞大學的MarkGreene博士友好提供，其含有克隆 進pGEM7Z質粒（Promega，MadisonWI)中的全長人Her2/neu(hHer2)基因。該質粒用作模 板，使用表1所示的pfxDNA聚合酶（Invitrogen)和寡物，通過PCR擴增hHer-2/neu的三 個區段，g卩，EC1、EC2和IC1。
[0367] 表1 :用於複製人her-2-嵌合體的引物
[0368]

【權利要求】
1. 一種在具有疾病的受試者中或在所述受試者內的疾病部位中增加T浸潤性淋巴細 胞/抑制細胞比率的方法，所述方法包括下述步驟：給所述受試者施用包含活減毒李斯特 菌疫苗菌株的組合物。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述T浸潤性淋巴細胞是CD8+T細胞或CD4+T細 胞。
3. 根據權利要求1-2中的任一項所述的方法，其中所述抑制細胞是T調節細胞（Treg) 或源自骨髓的抑制細胞（MDSC)。
4. 根據權利要求1-3中的任一項所述的方法，其中所述李斯特菌包含重組核酸序列， 所述重組核酸序列包含各自編碼多肽或其功能片段的開放讀碼框，其中所述多肽或其功能 片段是內源性含有PEST的多肽。
5. 根據權利要求1-3中的任一項所述的方法，其中所述李斯特菌包含重組核酸序列， 所述重組核酸序列包含各自編碼第一種多肽和至少第二種多肽的第一個開放讀碼框和至 少第二個開放讀碼框，其中所述第一種多肽和所述第二種多肽各自包含與內源性含有PEST 的多肽融合的異種抗原或其功能片段。
6. 根據權利要求5所述的方法，其中所述核酸還包含編碼第三種多肽的第三個開放讀 碼框，其中所述第三種多肽包含與內源性含有PEST的多肽融合的異種抗原或其功能片段。
7. 根據權利要求1-3或5-6中的任一項所述的方法，其中所述第一種、所述第二種或所 述第三種異種抗原或其功能片段由傳染性病原體或腫瘤細胞表達或源自傳染性病原體或 腫瘤細胞。
8. 根據權利要求1-7中的任一項所述的方法，其中所述核酸分子還包含編碼代謝酶的 另外的開放讀碼框，其中所述代謝酶補足在所述重組李斯特菌菌株的染色體中缺少的內源 基因。
9. 根據權利要求8所述的方法，其中由所述另外的開放讀碼框編碼的所述代謝酶是丙 氨酸消旋酶。
10. 根據權利要求1-9中的任一項所述的方法，其中所述李斯特菌還包含編碼第二種 代謝酶的另外的開放讀碼框。
11. 根據權利要求10所述的方法，其中所述代謝酶是D-胺基酸轉移酶。
12. 根據權利要求1-11中的任一項所述的方法，其中所述重組李斯特菌包含基因組 ActA基因、PlcA基因、PrfA基因或PlcB基因的突變或缺失。
13. 根據權利要求1-12中的任一項所述的方法，其中所述核酸分子整合在所述李斯特 菌基因組中。
14. 根據權利要求1-13中的任一項所述的方法，其中所述核酸分子是在質粒中，所述 質粒在沒有抗生素選擇存在下穩定地維持在所述重組李斯特菌疫苗菌株中。
15. 根據權利要求1-14中的任一項所述的方法，其中所述含有PEST的多肽是N-端截 短的LLO多肽、N-端ActA多肽或PEST-肽或其功能片段。
16. 根據權利要求1-3或5-16中的任一項所述的方法，其中所述第一種、所述第二種 或所述第三種抗原與局部組織環境有關，所述局部組織環境進一步與癌症的發展或轉移有 關，與腫瘤逃避或癌症抗性有關，是血管生成性抗原，或者是在宿主中造成變應性炎症反應 的變應原。
17. 根據權利要求1-16中的任一項所述的方法，其中所述疾病局部化至特定疾病部 位，或其中所述疾病是全身性的。
18. 根據權利要求1-17中的任一項所述的方法，其中所述疾病是傳染性疾病、呼吸或 炎性疾病或癌症或腫瘤。
19. 根據權利要求1-18中的任一項所述的方法，其中所述呼吸或炎性疾病是哮喘。
20. 根據權利要求1-19中的任一項所述的方法，其中減少在腫瘤部位處的所述抑制細 胞的數目在具有所述腫瘤的所述受試者中增強抗腫瘤免疫應答。
21. 根據權利要求1-20中的任一項所述的方法，其中所述受試者是人。
22. -種降低受試者的疾病中的抑制細胞百分比的方法，所述方法包括下述步驟：給 所述受試者施用活減毒李斯特菌疫苗菌株。
23. 根據權利要求22所述的方法，其中所述李斯特菌包含重組核酸序列，所述重組核 酸序列包含各自編碼多肽或其功能片段的開放讀碼框，其中所述多肽或其功能片段是內源 性含有PEST的多肽。
24. 根據權利要求22所述的方法，其中所述李斯特菌包含重組核酸序列，所述重組核 酸序列包含各自編碼第一種多肽和至少第二種多肽的第一個開放讀碼框和至少第二個開 放讀碼框，其中所述第一種多肽和所述第二種多肽各自包含與內源性含有PEST的多肽融 合的異種抗原或其功能片段。
25. 根據權利要求24所述的方法，其中所述核酸還包含編碼第三種多肽的第三個開放 讀碼框，其中所述第三種多肽包含與內源性含有PEST的多肽融合的異種抗原或其功能片 段。
26. 根據權利要求22-25所述的方法，其中所述核酸分子還包含編碼代謝酶的另外的 開放讀碼框，其中所述代謝酶補足在所述重組李斯特菌菌株的染色體中缺少的內源基因。
27. 根據權利要求26所述的方法，其中由所述另外的開放讀碼框編碼的所述代謝酶是 丙氨酸消旋酶。
28. 根據權利要求22-27中的任一項所述的方法，其中所述李斯特菌還包含編碼第二 種代謝酶的另外的開放讀碼框。
29. 根據權利要求28所述的方法，其中所述代謝酶是D-胺基酸轉移酶。
30. 根據權利要求22-29中的任一項所述的方法，其中所述重組李斯特菌包含基因組 ActA基因、PlcA基因、PrfA基因或PlcB基因的突變或缺失。
31. 根據權利要求22-30中的任一項所述的方法，其中所述核酸分子整合在所述李斯 特菌基因組中。
32. 根據權利要求22-31中的任一項所述的方法，其中所述核酸分子是在質粒中，所述 質粒在沒有抗生素選擇存在下穩定地維持在所述重組李斯特菌疫苗菌株中。
33. 根據權利要求22-32中的任一項所述的方法，其中所述受試者是人。
34. 根據權利要求22-33中的任一項所述的方法，其中所述含有PEST的多肽是N-端截 短的LLO多肽、N-端ActA多肽或PEST-肽或其功能片段。
35. 根據權利要求22或24-34中的任一項所述的方法，其中所述第一種、所述第二種或 所述第三種異種抗原或其功能片段由傳染性病原體或腫瘤細胞表達或源自傳染性病原體 或腫瘤細胞。
36. 根據權利要求22或24-35中的任一項所述的方法，其中所述第一種、所述第二種 或所述第三種抗原與局部組織環境有關，所述局部組織環境進一步與癌症的發展或轉移有 關，與腫瘤逃避或癌症抗性有關，是血管生成性抗原，或者是在宿主中造成變應性炎症反應 的變應原。
37. 根據權利要求22-36中的任一項所述的方法，其中所述疾病局部化至特定疾病部 位，或其中所述疾病是全身性的。
38. 根據權利要求22-37中的任一項所述的方法，其中所述疾病是傳染性疾病、呼吸或 炎性疾病或癌症或腫瘤。
39. 根據權利要求38所述的方法，其中所述呼吸或炎性疾病是哮喘。
40. 根據權利要求22-39中的任一項所述的方法，其中減少在腫瘤部位處的所述抑制 細胞的數目在具有所述腫瘤的所述受試者中增強抗腫瘤免疫應答。
41. 根據權利要求22-40中的任一項所述的方法，其中所述抑制細胞是T調節細胞 (Treg) 〇
42. 根據權利要求22-41中的任一項所述的方法，其中所述抑制細胞是源自骨髓的抑 制細胞（MDSC)。
43. 根據權利要求22-42中的任一項所述的方法，其中所述抑制細胞抑制受試者中的 抗腫瘤T細胞應答。
【文檔編號】A61K39/02GK104411327SQ201380024754
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2013年3月12日 優先權日:2012年3月12日
【發明者】R·辛格, A·瓦勒查 申請人:阿德瓦希斯公司