能在體內或體外改變卵泡生長的卵母細胞因子的核苷酸序列和胺基酸序列的製作方法

2023-10-24 05:39:12 1

專利名稱：：能在體內或體外改變卵泡生長的卵母細胞因子的核苷酸序列和胺基酸序列的製作方法
技術領域：
：本發明涉及在體內或體外改變卵泡生長的卵母細胞因子的核苷酸序列和胺基酸序列。本發明還涉及新的同二聚體多肽和異二聚體多肽以及它們在體內或體外改變哺乳動物卵泡生長的用途。具體地，本發明廣泛涉及針對這些同或異二聚體多肽或其功能性片段或變體的主動或被動免疫，從而能在體內或體外改變卵泡生長。
背景技術：
：目前對負責刺激卵泡發生的早期相(即原始卵泡向初級，次級，和前囊狀卵泡的生長和分化)的調節分子了解不多。另一方面，卵泡刺激素(FSH)和黃體化激素都是源自垂體的糖蛋白激素。一般被作為調節卵泡發生的晚期相的關鍵因素。FSH還作為刺激超正常數量的卵泡排卵的單個最重要因素，如目前在醫學和獸醫學中將商品化的FSH製劑廣泛應用於卵巢過度刺激方案中。近期研究表明，早期的卵泡發生受到卵巢內因子的控制，其中源自粒層細胞的幹細胞因子(c-kit配體)和源自卵母細胞的生長分化因子-9(GDF-9)最受重視，因為它們都很可能是哺乳動物卵泡發生的早期所必需的。GDF-9首先是在1993年，作為轉化生長因子β(TGF-β)超家族中特異性表達在卵巢內的一種新成員而被描述的(McPherron和Lee，1993)。與TGF-β家族中其它成員相似，GDF-9被編碼成一種前原肽，其組成為信號肽，原區，和所謂的C-末端成熟區，該成熟區可通過屬於弗林蛋白酶樣蛋白酶組的一種細胞內蛋白酶從前體肽上切割下來。TGF-β家族的生長因子的特徵是，幾乎在該家族所有成員中都有的成熟區內可以找到一種共有的半胱氨酸殘基模式；這是TGF-β家族成員的單體形式中，一種被稱為「半胱氨酸結(cysteineknot)」的剛性分子內結構，它由6個Cys殘基組成3個特徵性二硫橋(Daopin等，1992；Schlunegger和Grutter，1992和1993；Griffith等，1996；Scheufler等，1999)。TGF-β絕大多數成員都具有保守的第七Cys殘基，它負責使兩個相同的單體共價結合成同二聚體，或者使TGF-β家族的一種成員與該家族另一種成員形成異二聚體。在小鼠中，GDF9從卵泡發育的初期直到排卵期都在卵母細胞中表達(McGrath等，1995；Laitinen等，1998)。利用小鼠GDF-9序列作為測試序列在資料庫中檢索，我們從一種2-細胞小鼠胚胎庫中鑑定出一種GDF-9樣表達序列標籤(EST)cDNA(Laitinen等，1998)。我們顯示，這種新因子的轉錄物，GDF-9B，與GDF-9有55％同源性，它在小鼠卵巢卵母細胞中與GDF-9同時表達(Laitinen等，1998)。我們利用來自小鼠EST序列的引物，經過PCR從人的基因組DNA擴增得到相應基因片段，並將該基因定位在染色體Xp11.2，還從分離的粘粒克隆推導出人的GDF-9B的結構(Aaltonen等，1999)。有趣的是在人的卵巢中GDF-9mRNA的表達在初級卵泡中略早於GDF-9B(Aaltonen等，1999)。目前已克隆了小鼠和人的GDF-9B基因，將該基因編碼的蛋白命名為骨形態發生蛋白15(BMP-15)(Dube等，1998)。GDF-9很可能是卵泡發生所必需的。從文獻可知，GDF-9缺陷型小鼠(GDF-9-/-)都因卵泡發生的早期停滯而不育(Dong等，1996)。在GDF-9-/-卵巢中，在初級卵泡階段，當一層立方形粒層細胞圍繞卵母細胞時，卵泡發生停止。即使卵母細胞繼續生長，但粒層細胞不能再增殖，伴隨著卵泡增大也不再有膜細胞分化。Inverdale高生育力基因(FecXI)被鑑定為影響羅姆尼(Romney)羊群綿羊生育力的主要基因(Davis等，1991)。隔離分析表明，該基因位於X染色體上，攜有該基因的單個拷貝(I/+)的母羊比未攜帶該基因的母羊(+/+)一窩多產仔大約0.6隻羊羔。所生羊羔的數量增加直接與已改變的卵泡發育模式以及排卵率相對於野生型的-1.0而提高(Shackell等，1993；Davis等，1991)有關。相反，攜有該基因的兩個拷貝的純合型母羊(I/I)都為不育者；因為它們的卵巢喪失了功能(Davis等，1992)。在(I/I)母羊的卵巢中，卵泡發生在初級卵泡階段便停止，該表型與在GDF-9(-/-)小鼠中所見不同(Braw-Tal等，1993；McNatty等，1995；Smith等，1997)。第二個高產的羅姆尼羊群(Hanna，1995)也攜有與Inverdale羊群表型相似的X-連鎖的突變，但未發現它與Inverdale羊群有關聯。將攜帶Inverdale的公羊與攜帶Hanna的母羊交配，得到無生育能力的雌性動物，由此證實，Hanna動物在與Inverdale相同的基因中包含突變(FecXH)(Davis等，1995)。這一Hanna品系在InvermayAgResearchCentre作為區別於Inverdale品系的另一個群體而被保留下來。在紐西蘭專利申請500844中，我們，本發明的發明人，在Inverdale綿羊中鑑定了一種位於GDF-9B基因的成熟肽加工位點遠端(beyond)的核苷酸取代，它將密碼子GTC(纈氨酸(V))轉換為GAC(天冬氨酸(D))。我們還證實，在Hanna綿羊中，位於所述成熟肽加工位點遠端的C核苷酸變成了T。這使得密碼子CAG(編碼穀氨醯胺(Q))轉換成密碼子TAG(編碼終止)，從而產生截短的成熟蛋白。在Inverdale和Hanna中的這每一種突變都被認為是在純合型Inverdale或Hanna母羊以及在Inverdale與Hanna雜交的母羊中，出現″條紋狀(streak)″卵巢和不排卵情況的根本原因。此前已顯示GDF-9-/-小鼠不育，表明GDF-9在某些哺乳動物中對正常生育力是很重要的。但是，隨著相關的卵母細胞特異性因子GDF-9B的發現，我們又有了新的發現可以支持以下觀點(1)GDF-9B在某些哺乳動物中是正常的卵泡發生所必需的；(2)GDF-9B在決定某些哺乳動物的排卵率方面起著十分關鍵的重要作用；(3)由於卵母細胞共表達GDF-9和GDF-9B，它們可協同促進卵泡發育和排卵率。總之，這些新假說僅因我們關於綿羊中Inverdale和HannaGDF-9B突變的發現而成為可能。本發明人首次測定了編碼野生型蛋白的綿羊GDF-9B基因的全長基因結構，並顯示它是在綿羊中維持正常的卵泡發生所必需的。本發明人還鑑定了Inverdale和Hanna綿羊中GDF-9B變體的全長基因結構，所述變體使得雜合型動物中排卵率高於正常水平，而純合型動物不育。本發明涉及野生型和突變型GDF-9B全長序列和其變體，以及它們在調節哺乳動物生育力方面的應用。本說明書中引用的所有文獻，包括專利或專利申請都是作為參考而引入。並非認可任何參考文獻組成現有技術。這些參考文獻中的討論表明了它們的作者的觀點，本申請人保留對所引用的文件的準確性和針對性進行爭辯的權利。顯然，儘管本文引用了多篇現有技術的出版物，但無論是在紐西蘭還是任何其它國家，這種引用並不意味著認可這些文件就是現有技術中公知常識的一部分。
發明內容相應地，本發明第一方面提供了一種分離的野生型GDF-9B核酸分子，它包含選自下組的核苷酸序列a)SEQIDNO1；b)能在嚴格條件下與a)所述分子雜交的序列；c)一種序列，其為a)所述分子的功能性變體或片段；d)與a)，b)或c)所定義的分子互補的序列；以及e)反義序列，對應於a)-d)中任一項所述分子。本發明第二方面提供了一種分離的突變的GDF-9B全長核酸分子，它包含選自下組的核苷酸序列a)SEQIDNO3或SEQIDNO5；b)能在嚴格條件下與a)所述分子雜交的序列；c)一種序列，其為a)所述分子的功能性變體或片段；d)與a)，b)或c)所定義的分子互補的序列；以及e)反義序列，對應於a)-d)中任一項所述分子。所述核酸分子可以是RNA，cRNA，基因組DNA或cDNA分子，而且可以是單鏈或雙鏈形式。這樣的核酸分子還可以選擇包含一或多個人工合成的、非天然的或改變的核苷酸鹼基，或它們的組合。本發明第三方面提供了一種分離的全長GDF-9B多肽，它包含選自下組的胺基酸序列a)SEQIDNO2，SEQIDNO4，或SEQIDNO6；和b)按照a)所述的序列的功能性變體或片段；本發明第四方面提供了同二聚體成熟GDF-9B多肽，它具有含以下胺基酸序列的亞單位，所述序列選自SEQIDNO2或該序列的功能性片段或變體。本發明第五方面提供了異二聚體多肽，其具有選自下組的亞單位a)成熟的GDF-9B多肽，含有衍生自SEQIDNO2或該序列的功能性片段或變體的胺基酸序列；和b)成熟的GDF-9多肽或其功能性變體或片段。本發明第六方面提供了一種表達具有生物活性的經過加工的同二聚體GDF-9B多肽的方法，該方法包括以下步驟a)製備含有以下核酸分子的表達構建體，所述分子含有選自SEQIDNO1或該序列的功能性片段或變體的核酸序列；b)用上述構建體轉染適當的細胞；c)選擇穩定的克隆；和d)分離並純化所表達的多肽。本發明第七方面提供了一種表達具有生物活性的經過加工的異二聚體GDF-9B和GDF-9多肽的方法，該方法包括以下步驟a)製備含有以下核酸分子的表達構建體，所述分子含有(i)選自SEQIDNO1或該序列的功能性片段或變體的核酸序列；(ii)編碼GDF-9或其功能性片段或變體的核酸分子；b)用上述構建體轉染適當的細胞；c)選擇穩定的克隆；以及分離並純化所表達的多肽。優選被轉染的細胞是脊椎動物的細胞，但也可以使用其它類型的細胞。GDF-9的核酸和蛋白序列可以在公用資料庫如GENbank和SWISS-PROT中找到。綿羊GDF-9核酸的登錄號為AF078545，其蛋白登錄號AAC28089。本發明還提供了一種重組表達載體，它含有本發明的DNA分子或其功能性變體，本發明還提供了用本發明的能表達本發明多肽的載體轉化的宿主。本發明另一方面提供了能與本發明多肽結合的配體。最優選所述配體是一種抗體。術語「抗體」包含保留了結合本發明多肽的能力的抗體片段或類似物，包括但不限於Fv，F(ab)2片段，ScFv分子等。抗體可以是單克隆或多克隆，優選單克隆。在一些實施方案中，配體可以是針對本發明多肽的噬菌體展示分子、單個細胞表面受體或複合的細胞表面受體。所述多肽或態可以是單體，二聚體，異二聚體，多體或它們的變體。本發明第八方面提供了評估GDF-9B同二聚體和/或GDF-9B/GDF-9異二聚體的活性的方法，該方法包括以下步驟a)將有效量的GDF-9B同二聚體多肽；和/或GDF-9B/GDF-9異二聚體多肽加入到具有或不具有其它卵巢生長因子的卵巢細胞或器官培養物中，所述其它的卵巢生長因子如IGF-1和/或轉化生長因子超家族的其它成員(如活化素，BMP2，TGFβ1)；和b)對上述細胞或器官培養物進行生物試驗，以便評估上述同二聚體多肽和異二聚體多肽的生物活性。本發明第九方面提供了一種轉基因動物模型，它可用於確定GDF-9B同二聚體和GDF-9B/GDF-9異二聚體的系統性生成(systemicproduction)對卵泡生長的影響。本發明第十方面提供了將GDF-9B表達盒或GDF-9表達盒，通過腺病毒、逆轉錄病毒或α病毒，轉移至宿主細胞或生物，從而體內表達GDF-9B同二聚體或GDF-9B/GDF-9異二聚體的方法，該方法包括將含有表達盒的重組腺病毒轉移至受者細胞、器官培養物或受體動物的步驟，其中所述表達盒含有一種核酸分子，該核酸分子具有選自SEQIDNO1或該序列的功能性片段或變體的核苷酸序列，並且該核酸分子與表達調控序列可操作地相連。本發明第十一方面提供了選自下組的製劑的用途a)一種同二聚體多肽，其具有含GDF-9B或其功能性變體或片段的亞單位，還有或不具有如下的同二聚體多肽，所述多肽具有含GDF-9多肽或其功能性變體或片段的亞單位；b)一種異二聚體多肽，其具有含GDF-9B多肽和GDF-9多肽、或者所述GDF-9B或GDF-9多肽的功能性片段或變體的亞單位；所述製劑還配有或未配有補加的促性腺激素(如FSH和/或LH)和/或其它卵巢生長因子，如IGF-1，kit配體(幹細胞因子)，表皮生長因子或TGFβ超家族的成員(即，激動劑或拮抗劑)，所述用途是1)在體內或體外改變哺乳動物或其它脊椎動物卵巢中卵泡的生長；或ii)體外改變分離的卵巢細胞的生長/成熟(如卵母細胞-卵丘細胞和/或粒層細胞)。本發明第十二方面提供了一種組合物，它含有有效量的選自下組的製劑，以及可藥用或獸用的載體(包括佐劑)或稀釋劑；並任選包括補加的促性腺激素和/或其它相關的卵巢生長因子激動劑/拮抗劑a)一種同二聚體多肽，其具有含GDF-9B多肽或其功能性變體或片段的亞單位，還有或不具有如下的同二聚體多肽，所述多肽具有含GDF-9多肽或其功能性變體或片段的亞單位；b)一種異二聚體多肽，其具有含GDF-9B多肽和GDF-9多肽、或者所述GDF-9B或GDF-9多肽的功能性片段或變體的亞單位。本發明第十三方面提供了在體內改變雌性哺乳動物或其它雌性脊椎動物卵泡的生長的方法，該方法包括用GDF-9B和GDF-9表達盒轉化哺乳動物和其它脊椎動物卵巢宿主細胞，使GDF-9B同二聚體和GDF-9B/GDF-9異二聚體過度表達。本發明第十四方面提供了在體外改變雌性哺乳動物或其它雌性脊椎動物卵泡的生長的方法，該方法包括用GDF-9B和GDF-9表達盒轉化哺乳動物和其它脊椎動物卵巢宿主細胞，使GDF-9B同二聚體和GDF-9B/GDF-9異二聚體過度表達。本發明還有一方面提供了一種核酸分子，它包含選自下組的核苷酸序列SEQIDNO11，SEQIDNO13和SEQIDNO15，或所述序列的功能性片段或變體。本發明還有一方面提供了一種多肽，它包含選自下組的胺基酸序列SEQIDNO12和SEQIDNO16，或所述序列的功能性片段或變體。本發明另一方面提供了改變卵泡的生長的方法，該方法包括導入權利要求9-15中任一項所述的配體的步驟，以便ii)在體內或體外改變哺乳動物或其它脊椎動物卵巢中卵泡的生長；或iii)在體外改變分離的卵巢細胞的生長/成熟。優選地，所述哺乳動物選自綿羊、牛、山羊、鹿、豬、人、馬、camelids、負鼠、貓和狗以及商業上重要的、具有基本上與本發明GDF-9B序列相同的GDF-9B基因的、其它任何物種。所述脊椎動物優選選自小雞、鴨、鵝、鮭魚和商業上重要的、具有基本上與本發明GDF-9B序列相同序列的、其它任何物種。具體地，本發明優選的方面將參照附圖予以描述，附圖中圖1顯示綿羊中野生型GDF-9B的核苷酸序列。圖2顯示圖1的核苷酸序列的一部分，並指明Inverdale突變。圖3顯示圖1的核苷酸序列的一部分，並指明Hanna突變。圖4綿羊中野生型GDF-9B的推測胺基酸序列。圖5顯示圖1的胺基酸序列的一部分，並指明Inverdale突變。圖6顯示圖1的胺基酸序列的一部分，並指明Hanna突變。圖7顯示綿羊GDF-9B的信號序列多態性。圖8顯示綿羊中另外的上遊ATG密碼子。圖9的照片顯示卵母細胞中GDF-9B的位置。發明詳述如上所述，本發明的主要焦點在於通過GDF-9B同二聚體和GDF-9B/GDF-9異二聚體的活性，在體外和體內調節卵泡的生長。術語「分離的」是指基本上從天然能產生所述核酸的細胞或生物所含的各種雜質序列中分離或純化出來，包括經標準純化技術純化的核酸，通過重組技術(包括PCR技術)製備的核酸，以及化學合成的核酸。優選地，SEQIDNO1所示核酸分子分離自綿羊基因組DNA，SEQIDNO3和SEQIDNO5所示核酸分子分離自表達Inverdale或Hanna表型的綿羊的DNA。需要注意，綿羊GDF-9B的信號肽可能出現多態性(SEQIDNO7，SEQIDNO8)。預測的信號序列很可能大約有25個胺基酸長，正如用SignalP程序(SignalPV1.L，見http//genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP)(Neilsen等，1997)預測的，在SEQIDNO7和SEQIDNO8中從ATG(Met)至ACA(Thr)。某些綿羊中發現缺失了3個鹼基對，其中不含有兩個CTT序列中的一個。因此，某些綿羊具有較短的信號序列，而大多數綿羊則具有全長信號序列。根據對Hanna，Hanna與Inverdale的雜交品系，Inverdale以及與Inverdale或Hanna有關或無關的野生型綿羊的研究，絕大多數綿羊是含有兩個CTT的純合子，而部分綿羊是含有一個CTT的雜合子。短型信號肽在美利奴(Merino)綿羊中較多見，而在羅姆尼綿羊中較少見，這表明，上述多態性可能與品系有關。絕大多數羅姆尼綿羊無論攜帶Inverdale還是Hanna，都攜帶較長的信號序列。儘管這種多態性還有待研究，但它不會影響或改變本發明的權利要求還需注意，在綿羊基因組DNA序列中，在GDF-9B的起始密碼子ATG的上遊27個核苷酸處，出現一個額外的「框內」ATG起始密碼子(SEQIDNO9，SEQIDNO10)。該序列出現在所有被測序的綿羊中，不論野生型、Inverdale或Hanna攜帶者都有，而且顯然與Inverdale和Hanna突變無關。目前尚不知，這一上遊起始密碼子是否用於綿羊的蛋白翻譯階段(SEQIDNO9，SEQIDNO10)。如果確實如此，它將產生另外9個胺基酸的信號序列。綿羊與其它哺乳動物在GDF-9B蛋白中的這種差異不太可能影響成熟蛋白的功能，因為上述分子的這一部分在有活性的成熟GDF-9B中被切除，但我們提到綿羊中可能存在另一蛋白翻譯起始點。信號肽預測程序(Neilsen等，1997)顯示，上述另外的9個胺基酸的序列可能具有信號肽的功能，而且信號肽的可能的端點仍然是SEQIDNO7和SEQIDNO8中所示的Thr(T)。本發明另一方面提供了一種分離的多肽，其選自胺基酸序列SEQIDNO2，SEQIDNO4和SEQIDNO6或其功能性變體，它們具有在雌性哺乳動物中調節卵泡生長的功能。所述多肽可以如下製備使得包含本發明核酸分子或其功能性變體的適當載體在適當的宿主細胞中表達。本領域技術人員對此能理解。本文中術語「變體」是指下述核苷酸序列和多肽序列，它們與SEQIDNOS1-6分別有至少50％同源性，優選與本發明的序列有75％同源性，更優選與本發明序列有90-95％同源性，只要這些變體具有本文所述的生物活性。變體可通過對天然核苷酸序列或胺基酸序列進行修飾而獲得，也可以是天然產生的變體，所述修飾如插入、取代或缺失一或多個核苷酸或胺基酸。術語「變體」還包括能與本發明序列在本領域技術人員熟知的標準條件下，或優選在嚴格條件下雜交的同源序列。常用的原位雜交方法可參見(Tisdall等，1999)；(Juengel等，2000)。當需要這樣的變體時，可相應地改變天然DNA的核苷酸序列。這種改變可通過選擇性合成DNA或通過對天然DNA進行，例如，位點特異性誘變或盒式誘變而實現。優選地，當cDNA或基因組DNA的多個部分需要進行序列修飾時，用本領域標準技術進行位點特異性引物介導的誘變。核酸的「片段」是核酸的一部分，其比全長核酸短，並至少包含一段在下述嚴格條件下可與本發明核酸分子或其互補序列特異性雜交的最短序列。多肽的「片段」是多肽的一部分，其比全長多肽短，但仍然保留了本文所述的生物活性。術語「生物活性」是指本發明的能在哺乳動物或其它脊椎動物卵巢或卵巢細胞中表現出可檢測的生理效應的多肽。所述生理效應可以通過諸如氚標記的胸腺嘧啶向粒層細胞中摻入的試驗來測定。在一個這類試驗的實例中，切出卵泡(直徑1-2.5mm)，使其不帶有分離自膜(theca)和卵母細胞卵丘複合體(oocytecumuluscomplexes)卵巢基質和粒層細胞。洗滌細胞，並將其重懸在新鮮培養基中，使其用於生物測定法的終濃度達到每孔100,000個活細胞，在有或沒有多肽的條件下溫育48小時。此時，測定氚標記的胸腺嘧啶的摻入量。術語「蛋白(或多肽)」是指由本發明核酸分子編碼的蛋白，包括具有相同生物活性(即調節排卵的能力)的片段、突變體和同系物。本發明的多肽可從天然來源分離，通過重組核酸分子的表達產生，或者化學合成。術語「配體」是指能與另一分子(如多肽或肽)結合的任何分子，應包括，但不限於抗體，細胞表面分子和噬菌體展示分子。此外，與本發明的核苷酸序列和胺基酸序列基本相同的核苷酸或肽也可以應用在優選的實施方案中。這裡所述的「基本相同」是指兩種序列，當它們通過諸如GAP或BESTFIT(肽)程序用默認的缺口權重進行對比排列時，或者通過計算機算法BLASTX或BLASTP計算時，共享至少50％，優選75％，最優選90-95％的序列同一性。優選地，不相同的殘基位置是由保守胺基酸取代產生的不同。例如，具有類似的化學特性如荷電性或極性的胺基酸的取代不太可能影響蛋白的特性。非限制性實例包括用穀氨醯胺取代天冬醯胺，或者用穀氨酸取代天冬氨酸。本發明另一方面提供了適用於製備本發明多肽或肽的可複製型轉移載體。這些載體可根據本領域已知技術構建，或者從本領域現有的克隆載體中篩選出來。克隆載體可以根據所使用的宿主或宿主細胞來選擇。有效載體通常具備以下特徵(a)自我複製的能力；(b)針對任何特定的限制性內切核酸酶具有唯一的靶點；以及(c)優選，攜帶編碼易於篩選的標記(如抗生素抗性)的基因。具有這些特性的兩種主要載體是質粒和細菌病毒(噬菌體)。目前優選的載體包括細菌載體，昆蟲載體，或哺乳動物載體，如pUC，pBlueScript，pGEM，PGEX，pBK-CMV，λZAP，λGEM，pEFIRES-P，pUB6/V5/His，pBCl，pADTrack-CMV，pAdenovator，pAdEasy-1，pSFV-PD，pCA3，pBABE，pPIC9，pA0815，pET和pSP系列。但上述所列並非限制本發明的範圍。優選的表達系統的實例如下1.體外細胞表達系統可以使用帶有pEFIRES-P載體(HobbsS等，1998)從而賦予嘌呤黴素抗性的293T細胞系統。對兩基因進行共表達時，可將上述載體的抗生素抗性基因改為博萊黴素抗性基因。或者，可通過構建三順反子(tricistronic)表達載體，而實現兩基因和上述選擇基因的共表達。也可以使用相應的穩定轉染型昆蟲細胞系統，如使用「DES」載體表達系統的S2細胞系統；www.invitrogen.Com。2.關於在轉基因動物的所有組織中表達GDF，一種方法是使用pUB6/V5-HisA載體(www.invitrogen.com)製備構建體。為了進行組織特異性表達，可以在該構建體中包含用於肝和腎的表達的大鼠PEPCK0.6kb啟動子，方法是將pUB6/V5-HisA載體中的Ubi-C啟動子用PEPCK啟動子代替。在哺乳動物組織中表達GDF，優選使用另一啟動子系統。這時，可以使用牛β-乳球蛋白基因啟動子和/或牛αS1酪蛋白啟動子(如pBCl載體，www.invitrogen.com)來驅動GDF表達到奶中。希望在轉基因動物全身各處過度表達時，也可以使用CMV增強型β-肌動蛋白啟動子(OkabeM，等；FEBSLetters407313-319，1997)或改良型EF1α-啟動子(TaboitDameronF，等，TransgenicResearch8223-235，1998)。腺病毒，逆轉錄病毒和α病毒也是適合的哺乳動物表達系統。本領域技術人員常用的一種方法見(TCHe等，1998)。為了GDF的表達，可以使用pAdTrack-CMV載體或pAdenovator載體(www.qbiogene.com)製備構建體，然後將該構建體與pAdEasy-1腺病毒質粒共轉化至大腸桿菌中，得到重組腺病毒基因組，它含有由CMV-啟動子驅動的GDF表達盒。然後，將所述重組腺病毒基因組轉染至293T細胞中，獲得病毒原種。也可以使用其它獲得腺病毒的方法實現相同的目的(如，基於PCA3質粒的基因轉移(www.microbix.com)；或COS-TPC方法(MiyakeS等，1996)。3.表達GDF的非-致細胞病變塞姆利基森林病毒(SemlikiForestvirus)可以使用，例如，Lundstrom等，HistochemCellBiol1158391，2001所述的pSFV-PD載體來製備。此外，基於諸如pBABE載體的逆轉錄病毒表達系統可以用於在哺乳動物細胞中表達GDF(Morgenstern，JP和Land，H，1990；NucleicAcidsRes183587-3596)。4.酵母細胞(如，巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))是另一類本領域技術人員很熟悉的表達系統(CHadfield，等，1993)；(MARomanos等，1992)。例如，pPIC9載體(www.invitrogen.com)可以用在巴斯德畢赤酵母中，來表達GDF。優選用載體pA0815(www.invitrogen.com)來進行兩基因的表達。5.大腸桿菌(Echerichiacoli，E.coli)是廣泛應用的實驗室標準表達系統。例如，pET表達系統(www.novagen.com)可以用於表達重組哺乳動物GDF-9和GDF-9B([email protected])。本發明的DNA分子可通過與適當的調控序列可操作地連接在具有複製能力的表達載體中而被表達。調控序列可包括如複製起點，啟動子，增強子和轉錄終止序列。對表達載體中包含的調控序列的選擇取決於被用來表達所述DNA的宿主或宿主細胞的類型，本領域技術人員對此能理解。可用於本發明的表達載體包含至少一個表達調控序列，該調控序列與將要表達的DNA序列或片段可操作地連接。所述調控序列插入載體以便控制並調節所克隆的DNA序列的表達。可用的表達調控序列的實例如lac系統，trp系統，tac系統，trc系統，λ噬菌體的主要操縱子和啟動子區域，酵母酸性磷酸酶的糖酵解啟動子(如Pho5)，酵母α接合因子的啟動子，以及來源於多形瘤、腺病毒、反轉錄病毒、猿猴病毒和巨細胞病毒的啟動子(如SV40的早期和晚期啟動子)，以及其它已知可以控制原核和真核細胞和它們的病毒的基因表達的序列，或其組合。在載體的構建中，最好能鑑別攜帶插入了異源DNA的載體的細菌克隆。這類分析包括可檢測的顏色變化，抗生素抗性等。一種優選的載體中使用了β-半乳糖苷酶基因，該基因通過在X-gal平板上有藍色表型的克隆來檢測。這便於進行選擇。一旦選定，就可按照常規方法從培養物中分離載體。基於所使用的宿主，用適合於所述細胞的標準技術進行轉化和轉染。對於原核細胞或包含細胞壁實質的其它細胞，可使用鈣處理方法(Cohen，SNProceedings，NationalAcademyofScience，USA692110(1972))。對於不具有這種細胞壁的哺乳動物細胞，優選Graeme和VanDerEb的磷酸鈣沉澱法(Virology52546(1978))或脂質體試劑。當用合適的載體轉化了選定的宿主後，通過培養宿主細胞，可產生所述被編碼的多肽，它通常是融合蛋白的形式。本發明的多肽可通過上述快速分析來檢測。然後根據需要回收並純化這些多肽。回收和純化可利用本領域任何已知方法進行，如吸附於陰離子交換樹脂，並隨後洗脫。這種產生本發明多肽的方法組成了本發明的另一方面。用本發明載體轉化，轉染或感染的宿主細胞(包括完整動物宿主)也形成本發明的又一方面。本發明還有一方面提供了能與本發明多肽或肽結合的抗體，抗體片段，細胞表面單個受體，或複合型細胞表面受體，或噬菌體展示分子。所述多肽或肽可以是它們的單體，二聚體，異二聚體，多體或變體。更具體地，本發明提供了製備抗體的方法，所述抗體針對野生型(SEQIDNO2)或突變型(SEQIDNO4和SEQIDNO6)GDF-9B多肽序列，所述多肽序列為單體，或同二聚體，或者與GDF-9組合成異二聚體。所述抗體可用於鑑定野生型內源蛋白，或肽片段以及表達的重組蛋白，或肽片段，還可用於對哺乳動物受體進行被動免疫，從而在其體內調節卵泡的生長。本發明還有一方面涉及，本發明多肽在製備用於檢測其它GDF-9B-樣多肽的抗血清中的用途。多克隆抗體可根據引入本文參考的(Koelle等，1991)所述方法製備。有效的抗體製備方案概述於美國專利5,514,578。單克隆抗體可通過本領域已知的方法製備。這些方法包括(Kohler和Milstein，1975)所述免疫學方法，以及(Huse等，1989)所述重組DNA方法。本發明還有一方面提供了在培養物和/或轉基因動物的細胞中，操縱卵泡生長的方法。在培養的細胞或轉基因動物中，通過過度表達GDF-9B同二聚體和GDF-9B/GDF-9異二聚體，可以改變特異性卵泡蛋白基因表達的時間和水平，例如，可將GDF-9B同二聚體或GDF-9B/GDF-9異二聚體的編碼序列插入基因表達盒，使所述序列受控於特定啟動子或者能在所有細胞類型中表達的啟動子的控制之下(參見以下實施例)(組成型表達)。該表達盒還包含能穩定mRNA的3′側翼DNA，還任選包含下遊調節序列。可以將這種DNA盒引入哺乳動物基因組中，方法是將DNA顯微注射至卵子的原核中(LHuillier等，1996)，然後將此受精卵重新放回受體動物體內，使它發育到足月。這種產生轉基因動物的技術如(Hogan等，1996)所述。轉基因動物可以如下產生轉染來自胚胎，或胎兒，或成人組織的培養物中的細胞；然後通過核轉移和胚胎轉移而至受體動物。或者，可將上述基因盒與哺乳動物精子(sperm)結合，通過體外或體內受精而轉移至卵子，由此產生非人類的轉基因動物。對GDF-9B同二聚體或GDF-9B/GDF-9異二聚體的發育調節或表達水平的操縱，可用於改變卵泡蛋白的合成或生產的水平。本發明還包括基於腺病毒的基因治療技術，用於在細胞培養物、器官培養物以及完整的實驗動物中表達GDF-9B和GDF-9/GDF-9B，從而操縱卵泡蛋白的合成或生產。下面提供本發明的非限制性實施例。應理解，上述說明僅供舉例，本領域技術人員已知的其它材料和方法都包括在本發明範圍之內。實施例實施例1分離綿羊的野生型GDF-9BDNA並鑑定綿羊的突變型GDF-9BDNA序列將來自我們此前所克隆的人/小鼠/大鼠GDF-9B序列的寡核苷酸引物進行不同組合，用於對綿羊基因組DNA進行PCR，獲得綿羊GDF-9B基因的片段，以備測序。用功能性引物對從陣列庫(arrayedlibraries)中獲得野生型綿羊基因組克隆，並從野生型綿羊的卵巢cDNA獲得cDNA序列。通過對來自不同基因組DNA的相關PCR片段進行測序，獲得了Inverdale和Hanna的全長編碼區的序列。野生型GDF-9B的序列見SEQIDNO1，Inverdale的序列見SEQIDNO3，Hanna的序列見SEQIDNO5。實施例2製備特異性抗體並證實哺乳動物卵巢中的天然同二聚體GDF-9B和異二聚體GDF-9B/GDF-9蛋白。將本發明公開的核苷酸序列SEQIDNO1，SEQIDNO3，和SEQIDNO5或它們的變體，與能促使蛋白在大腸桿菌中表達的表達調控序列操作性連接，用於製備免疫哺乳動物或鳥類所需的抗原。另一種方法是，製備針對特異性肽序列的抗-肽抗體，所述肽來自SEQIDNO2，SEQIDNO4，SEQIDNO6或它們的變體。可以用標準方法(如ELISA)分析免疫反應性，和/或藉此獲得能識別GDF-9B同二聚體和GDF-9B/GDF-9蛋白異二聚體(來自天然來源以及過度表達各自重組蛋白的細胞/組織)的特異性IgG。發明人工作組此前的研究(如Aaltonen等(1999)和Jaatinen等，1999)表明，在齧齒動物和靈長類的前囊狀(preantral)卵泡卵母細胞中存在GDF-9mRNA和蛋白。本文中，我們通過用小鼠抗體進行免疫細胞化學研究，而提供了綿羊卵巢中存在GDF-9B蛋白的證據(Fig.9)。所述免疫組織化學方法類似於Tisdall等(1999)Stemcellfactorandc-kitgeneexpressionandproteinlocalisationinthesheepovaryduringfetaldevelopment，JReprodFert116277-291所述。唯一不同之處在於本研究中還包括酪醯胺(tyramide)信號擴增步驟(TSABiotinSystem，NENLifeScienceProducts)。將大腸桿菌產生的綿羊GDF-9B成熟肽(0.2mg)在弗氏完全佐劑(FCA)中的製劑腹膜內注射(i.p.)，然後以2周的間隔，先用0.1mg抗原，隨後用0.05mg抗原，i.p.加強免疫，所用抗原是在Span/Tween/油混合物中的製劑，末次加強免疫的1周後處死動物，收集血清，獲得小鼠抗體M10。這些以及其它信息總體表明，GDF-9和GDF-9B的mRNA和蛋白都存在於哺乳動物的卵母細胞中(Aaltonen等，1999；Galloway等，2000)。針對特異性肽序列的抗肽抗體能影響哺乳動物卵巢的活性，相關證據見表1。表1在給予了含有針對匙孔嘁血藍(KLH)偶聯型GDF-9B肽的抗體的血漿後，綿羊的排卵率*p＜0.05(studentst-檢驗)在該項研究中，10隻母羊用前列腺素F2α(Estrumate，125μgi.m.)使它們的發情周期(即排卵周期)同步。通過切除了輸精管的公羊發現所有母羊都顯示同步的發情期。在黃體期的第5天，5隻母羊給藥來自另一群母羊的混合血漿，所述另一群母羊已經每月一次用偶聯了匙孔嘁血藍(KLH)的15體GDF-9B肽連續免疫了7個月。這種混合血清含有高滴度的針對GDF-9B的抗體，可用大腸桿菌表達的全長GDF-9B作為抗原經過ELISA試驗來測定。另外5隻母羊給藥針對KLH的混合血漿，該血漿來自另一個也已經每月一次、連續免疫了7個月的母羊群。來自這些動物的混合血漿不含有可以檢測到的GDF-9B抗體。將上述免疫血漿稀釋1∶50000後，用ELISA方法測量抗體水平。ELISA方法包括，用100ng/孔大腸桿菌表達的全長GDF-9B包被96孔板，經過適當的封閉處理和連續洗滌後，用100μl稀釋的綿羊血漿和100μl試驗緩衝液溫育。用綿羊血漿溫育並洗滌數次後，加入兔抗-綿羊-HRP，37℃溫育1小時。然後洗孔，用鄰苯二胺加過氧化氫顯色，用硫酸終止顯色反應。每隻母羊靜脈給予100ml無菌血漿，4天後給予第二劑前列腺素F2α以使發情期同步。在給藥血漿的14天後，通過腹腔鏡檢來檢查排卵率。我們的在先專利500844已經證實小鼠用大腸桿菌產生的成熟的綿羊GDF-9B免疫後，卵泡的發育明顯波動。在此項研究中，10隻雌性小鼠用大腸桿菌來源的綿羊GDF-9B成熟蛋白(0.2mg)在弗氏完全佐劑(FCA)中的製劑(0.2ml)經腹膜內(i.p.)免疫，另外10隻雌性小鼠用牛α乳清蛋白(0.2mg)在FCA中的製劑(0.22ml)經腹膜內免疫作為對照。隨後，以2周的間隔用相應抗原(第一次加強針為0.1mg，第2和第3次加強針為0.05mg)進行3次加強注射，所用抗原是在Span/Tween/油混合物中的製劑，末次加強注射的1周後處死動物。我們在此提供了，在這些被GDF-9B免疫的小鼠中，GDF-9和GDF-9B的外源生物活性很可能因為這些動物含有針對兩種生長因子的交叉抗體而受到影響的證據(表2)。表2小鼠用牛α乳清蛋白或綿羊GDF-9B免疫後，血漿中平均(±s.e.m.)抗體水平。表中的值是490nm的吸光值，它代表了針對GDF-9B或GDF-9的抗體的水平。我們因此認為，能調節內源性GDF-9和GDF-9B的方法將改變卵巢的功能。支持我們這一觀點(即調節同二聚體GDF-9B，或GDF-9與GDF-9B的同二聚體混合物或異二聚體)的進一步證據，是在我們對綿羊(3-5隻/處理組)用KLH(對照)、偶聯了KLH的GDF-9B肽、或偶聯了KLH的GDF-9肽致敏後的新發現。使動物接受每月一次連續7個月的免疫，處死動物，回收卵巢，然後用標準的形態測定法評估卵巢體積以及1，1a和2型卵泡的數量(Smith等，1997)。此外還明示囊狀卵泡的存在與否。結果見表3。表3用KLH、偶聯了KLH的GDF-9B肽、或偶聯了KLH的GDF-9肽免疫綿羊後的平均卵巢體積，以及1-2，3-4型卵泡和囊狀卵泡的數量。這些研究中，GDF-9B肽的序列為SEVPGPSREHDGPESC(SEQIDNO17)，GDF-9肽序列為KKPLVPASVNLSEYFC(SEQIDNO18)。給羅姆尼母羊按照0.4mg/只母羊的劑量注射KLH或KLH-GDF-9B肽或KLH-GDF-9肽在弗氏完全佐劑中的製劑。隨後按照每月一次再加強注射(s.c.)6次(0.2mg/只母羊/次)，所用抗原為在Span/Tween/油混合物中的製劑。結果顯示與對照(KLH免疫)相比(1)GDF-9-KLH和GDF-9B-KLH免疫分別能抑制囊狀卵泡的發育，從而證實，GDF-9和GDF-9B都是某些動物中正常卵泡發育所必需的。實施例3重組同二聚體GDF-9B和異二聚體GDF-9B/GDF-9蛋白在哺乳動物細胞中的體外和體內表達。將表達構建體轉染/轉移至哺乳動物細胞，用抗生素選擇標記篩選穩定克隆，所述表達構建體在質粒載體上，該構建體含有本發明公開的核苷酸序列SEQIDNO1，SEQIDNO3，和SEQIDNO5或它們的變體，這些序列與表達調控序列(CMV，EF1，和哺乳動物特異性啟動子序列)可操作地相連。為了優化對表達的重組多肽序列的加工，使弗林蛋白酶加工位點突變，導入一個輔助表達盒，它在生產型細胞中驅動弗林蛋白酶的過度表達。我們製備了用pEFIRES-P載體轉化的人類293T細胞系，作為產生oGDF-9B同二聚體蛋白的有效哺乳動物表達系統的實例，這種載體含有與大鼠GDF-9B原區融合的綿羊GDF-9B成熟區序列(SEQIDNO1和NO2)(Jaatinen等，Mol細胞Endocrinol.156189-93，1999)。弗林蛋白酶加工位點已經經過改造，使其含有被有效切割的RRRR序列。選出能耐受120-150μg/ml嘌呤黴素的細胞，在不含血清的HamF12/DMEM中培養4天，以便在上清中產生綿羊GDF-9B，隨後在實施例4所述的生物測定法中使用。為獲得綿羊GDF-9B與GDF-9發生物理性異二聚體化的生物化學證據，使用了以下方法。一種類似上述的大鼠/綿羊嵌合型GDF-9B開放讀框在C末端含有8個胺基酸的FLAG表位，將該讀框克隆至pSFV-PD塞姆利基森林病毒載體，在BHK細胞中獲得了SFV-PD-oGDF-9B-FLAG的高滴度原種，如Lundstrom等，HistochemcellBiol11583-91，2001所述。高滴度SFV-PD-oGDF-9B-FLAG被視為能十分有效地感染人的293T細胞，並能在這些細胞中高水平表達oGDF-9B-FLAG。感染後，在4天的培養期間，經過加工的oGDF-9B-FLAG被分泌至培養基中，在用抗-FLAGM2抗體進行的Western印跡中可以清楚地觀察到，它是一條18kd的帶。用包含編碼前原GDF-9多肽的開放讀框的pEFIRES-P載體製備另一種293T細胞系，用來共表達綿羊GDF-9B-FLAG和綿羊GDF-9。親代293T細胞和能穩定表達oGDF-9的293T細胞用等量的SFV-PD-oGDF-9B-FLAG病毒感染，培養4天後收集上清。用1ml來自未感染細胞以及被SFV-PD-oGDF-9B-FLAG感染的細胞的上清，與1μg/ml抗FLAG-M2抗體進行免疫沉澱，用蛋白G瓊脂糖回收複合物。在Western印跡中用抗-FLAG-M2抗體和抗GDF-9抗體評估洗脫物。儘管抗FLAGM2抗體不與綿羊GDF-9反應，但在已經被SFV-PDoGDF-9B-FLAG病毒感染的GDF-9表達細胞的上清液中，能觀察到一種免疫反應性20kd的GDF-9成熟肽，它能與抗FLAGM2抗體發生免疫沉澱。這些共免疫沉澱實驗表明，重組表達的綿羊GDF-9B與GDF-9存在直接物理性相互作用，還證實存在綿羊GDF-9/GDF-9B異二聚體。本文還描述了在轉基因動物的數個卵巢外部位過度表達本發明公開的核苷酸序列SEQIDNO1，SEQIDNO3，和SEQIDNO5或它們的變體的多種方法，以便模擬重組同二聚體GDF-9B和異二聚體GDF-9B/GDF-9蛋白的系統性給藥。相關的GDF編碼序列可以分別表達或與表達調控序列可操作相連後共表達。GDF-9B同二聚體和GDF-9B/GDF-9異二聚體對這些轉基因動物中卵泡的生長的影響，可以通過形態測定法或激素分析來評估。該途徑提供了一種改變轉基因動物中排卵率的通用方法。通過乳腺的過度表達而在奶中產生GDF，這提供了另一種生產大量醫用或藥用試劑的方法。該方法對轉基因動物的健康無損，因為未觀察到與其相關的禁忌症。本發明還描述了將重組腺病毒中的表達盒有效轉移至受體細胞或器官培養物或受體動物，從而在體外或體內改變卵泡生長的方法，所述表達盒由本發明公開的核苷酸序列SEQIDNO1，SEQIDNO3，和SEQIDNO5或它們的變體與表達調控序列(CMV啟動子)可操作地連接在重組腺病毒中而形成。例如，所述方法允許用攜帶GDF-9B和GDF-9表達盒的腺病毒對哺乳動物受體進行系統性感染併集中在宿主肝臟，還允許肝臟衍生的高水平重組蛋白釋放至循環系統中。對卵泡生長的影響可通過以下一或多項標準來評估腹腔鏡檢，形態測定法，或激素分析。可以用α病毒或逆轉錄病毒實現GDF-9B和GDF-9序列和轉錄單位的類似的體內經病毒轉移，並獲得相應的轉錄單位。這些病毒性方法提供了體內檢驗不同的GDF-9B和GDF-9基因構建體生物活性的方式，還提供了另外的使動物被GDF-9B和GDF-9致敏的方法。實施例4測量同二聚體GDF-9B和異二聚體GDF-9B/GDF-9蛋白在卵巢細胞培養物中的生物活性。為了評估本發明公開的核苷酸序列SEQIDNO1，SEQIDNO3，和SEQIDNO5或它們的變體表達的蛋白的生物活性，使用卵巢細胞和器官培養物模型。評估同二聚體GDF-9B的生物活性的實例見下表4，它通過測定分離的綿羊粒層細胞在37℃溫育48小時期間，[3H]胸腺嘧啶的摻入量，來評估部分純化的重組(r)綿羊(o)GDF-9B提取物。結果顯示，roGDF-9B使粒層細胞的氚標記胸腺嘧啶的摻入量增加1.9倍，表明roGDF-9B具有生物活性。為了獲得粒層細胞，從母羊收穫卵巢，剝離卵泡(1-2.5mm直徑)，分離所述細胞並使之與膜和卵母細胞-卵丘複合體隔離。洗滌所述細胞，將其重懸於新鮮培養基中，使得用於生物測定法的終濃度為1×105活細胞/孔。表4綿羊(o)粒層細胞暴露於roGDF-9B或培養基對照以後，[3H]胸腺嘧啶摻入量的平均增加值±s.e.m.(每項實驗的例數n＝3)RoGDF-9B由轉染的293T細胞產生，通過肝素-sepharose層析進行部分純化，用0.5MNaCl洗脫，用組織培養基透析過夜。該項實驗的對照是暴露於未轉染的293T細胞、並經過肝素-sepharose層析、NaCl洗脫和透析的培養基。***P＜0.001，ANOVA討論已知的人的GDF-9B序列及其衍生的寡核苷酸引物，使得本發明人能測定綿羊GDF-9B的基因組序列和cDNA序列，並能評估在綿羊卵巢中GDF-9B轉錄物的表達(Galloway等，2000)。根據文獻，GDF-9似乎是粒層細胞的分裂和膜細胞的分化所必需。事實上，重組大鼠GDF-9在體外刺激大鼠卵泡的生長(Hayashi等，1999)以及培養的大鼠粒層細胞的增生(Vitt等，2000)。重組GDF-9還調節小鼠和大鼠粒層細胞中膽固醇的生成和促性腺激素受體的表達(Elvin等，1999；Vitt等，2000)。此外，GDF-9刺激人類粒層細胞培養中抑制素B的生成(Vuojolainen等，inpreparation)。這些近期研究清楚表明，GDF-9同二聚體在多種動物中對卵泡的生長和分化有很明顯的影響，但直到本文所述的本發明之前，對卵巢中GDF-9B可能的生物學效應一無所知。在我們的在先紐西蘭專利說明書500844號中，本發明人證實，Inverdale基因經過作圖而定位在綿羊X-染色體上含有與人類Xp11.2-11.4同線的基因的區域(Galloway等，2000)，本發明人還測定了在這些動物中GDF-9B基因是否受到影響，結果表明，Inverdale基因事實上是綿羊GDF-9B基因的滅活形式。在Inverdale動物中，成熟肽加工位點遠端(beyond)第92位的核苷酸T變成殘基A，使密碼子GTC變成GAC，導致纈氨酸(V)被天冬氨酸(D)取代。在TGF-β家族的所有成員中，這一特定胺基酸可以是纈氨酸、異亮氨酸或亮氨酸，它們都有疏水殘基，而天冬氨酸則帶有負電荷。這種胺基酸取代導致該分子中與二聚化過程有關的特定區域的表面電荷改變，這一點可由TGF-β2，BMP-2和BMP-7的晶體結構證實(Schlunegger和Grutter，1993；Griffith等，1996；Scheufler等，1999)。紐西蘭專利500844還提供證據表明，在另一個綿羊群體，Hanna綿羊中鑑定了另一種GDF-9B基因突變，而這種綿羊群體與Inverdale母羊具有實質上相同的雜合型和純合型基因攜帶表型。Hanna動物中，那些在成熟肽加工位點遠端第67位核苷酸上具有C→T點突變的綿羊在穀氨醯胺(Q)殘基的位置上導入了一個提前終止密碼子。這一改變導致成熟肽區的嚴重截短，使蛋白產物失活。Inverdale與Hanna家族的雜交產生50％的不育母羊，這說明兩種突變都顯然能使GDF-9B基因的產物失活。參考文獻AaltonenJ，LaitinenM，VuojolainenK，JaatinenR，Horelli-KuitunenN，SeppaL，LouhioH，TuuriT，SjobergJ，ButzowR，HovattaO，DaleL，RitvosOHumangrowthdifferentiationfactor-9(GDF-9)anditsnovelhomologGDF-9Bareexpressedduringearlyfolliculogenesis.JClinEndocrinolMetab842744-2750，1999Braw-TalR，McNattyKP，SmithP，HeathDA，HudsonNL，PhillipsDJ，McLeodBJ，DavisGHOvariesofeweshomozygousfortheX-linkedInverdalegene(FecXI)aredevoidofsecondaryandtertiaryfolliclesbutcontainmanyabnormalstructures.BiolReprod49895-907，1993.CHadfield，KKRaina，KShashi-Menon，RCMount(1993)Theexpressionandperformanceofclonedgenes.YeastMycolRes9，897-944DaopinS，PiezKA，OgawaY，DaviesDRCrystalstructureoftransforminggrowthfactor-beta2anunusualfoldforthesuperfamily.Science257369-373，1992.DavisGH，McEwanJC，FennessyPF，DoddsKG，FarquharPAEvidenceforthepresenceofamajorgeneinfluencingovulationrateontheXchromosomeofsheep.BiolReprod44620-624，1991.DavisGH，McEwanJC，FennessyPF，DoddsKG，McNattyKP，OWSInfertilityduetobilateralovarianhypoplasiainsheephonozygous(FecXIFecXI)fortheInverdaleprolificacygenelocatedontheXchromosome.BiolReprod46636-640，1992DavisGH，McEwanJC，FennessyPF，DoddsKGDiscoveryoftheInverdalegene(FecX).ProcNZSocAnimProd95289-290，1995.DongJ，AlbertiniDF，NishimoriK，KumarTR，LuN，MatzukMMGrowthdifferentiationfactor-9isrequiredduringearlyovarianfolliculogenesis，Nature383531-535，1996DubeJL，WangP，ElvinJ，LyonsKM，CelesteAJ，MatzukMMThehonemorphogeneticprotein15geneisX-linkedandexpressedinoocytes.MolEndocrinol121809-1817，1998ElvinJA，ClarkAT，WangP，WolfmanNM，MatzukMMParacrineactionsofgrowthdifferentiationfactor-9inthemammalianovary.MolEndocrinol131035-1048，1999GallowaySM，McNattyKP，CambridgeLM，LaitinenMPE，JuengelJL，JokirantaTS，McLarenRJ，LuiroK，DoddsKG，MontgomeryGW，BeattieAE，DavisGH，RitvosOMutationsinanoocyte-derivedgrowthfactorgene(BMP15)causeincreasedovulationrateandinfertilityinadosage-sensitivemanner，NatureGenetics25279-283，2000.GriffithDL，KeckPC，SampathTK，RuegerDC，CarlsonWDThree-dimensionalstructureofrecombinanthumanosteogenicprotein1structuralparadigmforthetransforminggrowtbfactorbetasuperfamily.ProcNatlAcadSciUSA93878-883，1996.HannaMMLivingwiththeInverdalegene(FecX)inaRomneyflock.ProcNZSocAnimProd55296-297，1995.HayashiM，McGeeEA，MinG，KleinC，RoseUM，vanDuinM，HsuehAJRecombinantgrowthdifferentiationfactor-9(GDF-9)enhancesgrowthanddifferentiationofculturedearlyovarianfollicles.Endocrinology1401236-1244，1999HobbsS，JitrapakdeeS，WallaceJC(1998)Developmentofabicistronicvectordrivenbythehumanpolypeptidechainelongationfactor1alphapromoterforcreationofstablemammaliancelllinesthatexpressveryhighlevelsofrecombinantproteins.BiochemBiophysResCommun252，368-372Hoganetal(1；InManipulatingthemouseembryo，ColdSpringHarborLaboratory.Press1996)Huseetal.，Science2461275-1281(1989).Koelleetal.，Cell6759-77，1991.KohlerandMilsteininNature256495-497(1975).Juetgeletal.(2000)GeneexpressioninabnormalovarianstructuresofeweshomozygousfortheInverdaleprolificacygene，BiolReprod，62，1467-1478.LaitinenM，VuojolainenK，JaatinenR，KetolaI，AaltonenJ，LehtonenE，HeikinheimoM，RitvosOAnovelgrowthdifferentiationfactor-9(GDF-9)relatedfactorisco-expressedwithGDF-9inmouseoocytesduringfolliculogenesis.MechDev78135-140，1998LHuillieretalPNAS93；6698-6703(1996)MARomanos，CAScorer，JJCIare(1992)Foreigngeneexpressioninyeastareview.Yeast8，423-488.McGrathSA，EsquelaAF，LeeSJOocyte-specificexpressionofgrowthdifferentiationfactor-9.MolEndocrinol9131-136，1995.McNattyKP，SmithP，HudsonNL，HeathDA，TisdallDJ，OWS，Braw-TalRDevelopmentofthesheepovaryduringfetalandearlyneonatallifeandtheeffectoffecunditygenes.JReprodFertilSuppl49123-135，1995.McPherronAC，LeeSJGDF-3andGDF-9twonewmembersofthetransforminggrowthfactor-betasuperfamilycontaininganovelpatternofcysteines.JBiolChem2683444-3449，1993MiyakeS，MakimuraM，KanegaeY，HaradaS，SatoY，TakamoriK，TokudaC，SaitoI.EfficientgenerationofrecombinantadenovirusesusingadenovirusDNA-terminalproteincomplexandacosmidbearingthefull-lengthvirusgenome.ProcNatlAcadSciUSA.931320-1324，1996.NeilsenH.，EngelbrechtJ，BrunakS，vonHeijneGIdentificationofprokaryoticandeukaryoticsignalpeptidesandpredietionoftheircleavagesites.ProteinEng101-6ScheuflerC，SebaldW，HulsmeyerMCrystalstructureofhumanbonemorphogeneticprotein-2at2.7Aresolution.JMolBiol287103-115，1999SchluneggerMP，GrutterMGAnunusualfeaturerevealedbythecrystalstructureat2.2Aresolutionofhumantransforminggrowthfactor-beta2.Nature358430-434，1992.SchluneggerMP，GrutterMGRefinedcrystalstructureofhumantransforminggrowthfactorbeta2at1.95Aresolution.JMolBiol231445-458，1993.ShackellGH，HudsonNL，HeathDA，LunS，ShawL，CondellL，BlayLR，McNattyKPPlasmagonadotrophinconcentrationsandovariancharacteristicsinInverdaleewesthatareheterozygousforamajorgene(FecX1)ontheXchromosomethatinfluencesovulationrate.BiolReprod481150-1156，1993.SmithP，OWS，CorriganKA，SmithT，LundyT，DavisGH，McNattyKPOvarianmorphologyandendocrinecharacteristicsoffemalesheepfetusesthatareheterozygousorhomozygousfortheInverdaleprolificacygene(fecX1).BiolReprod571183-1192，1997TCHe，SZhou，LTdaCosta，J.Yu，KWKinzler，B.Vogelstein(1998)Asimplifiedsystemforgeneeratingrecombinantadenoviruses.ProcNatlAcadSciUSA95，2509-2514.Tisdalletal.(1999)Stemcellfactorandc-kitgeneexpressionandproteinlocalisationinthesheepovaryduringfetaldevelopment，JReprodFert116277-291.VittUA，HayashiM，KleinC，HsuehAJWGrowthdifferentiationfactor-9stimulatesproliferationbutsuppressesthefollicle-stimulatinghormone-induceddifferentiationofculturegranulosacellsfromsmallantralandpreovulatoryratfollicles.BiolReprod，62，370-377，2000.VuojolainenK，BondestamJ，HayashiM，RaivioT，EvansL，GroomeNP，HsuehAJW，RitvosOGDF-9regulatesinhibinBproductioninculturedhumangranulosa-lutealcells.Manuscriptinpreparation.序列表110農業研究有限公司(AgResearchLimited)喬治，戴維斯(Davis，George)蘇珊，加洛韋(Galloway，Susan)珍妮，於恩格爾(Juengel，Jenny)米卡，萊廷南(Laitinen，Mika)肯尼思，麥克納蒂(McNatty，Kenneth)奧利，裡特沃斯(Ritvos，Olli)凱薩，沃喬萊南(Vuojolainen，Kaisa)120能在體內或體外改變卵泡生長的卵母細胞因子的核苷酸序列和胺基酸序列130NZ50279616015June2000170PatentInversion3.021012112044212DNA213土耳其盤羊(Ovisaries)2202215』UTR222(1)..(234)220221misc_feature222(235)..(237)223atg起始密碼子220221misc_feature222(208)..(210)223與5』atg密碼子在同一讀碼框中220221CDS222(235)..(559)220221sig_peptide222(235)..(309)220221CDS222(1175)..(2028)220221Intron222(560)..(1174)220221mat_peptide222(1654)..220221misc_feature222(784)..223n代表大約5.4kb的未測序的內含子220221misc_feature222(2029)..(2031)223tga終止密碼子2202213』UTR222(2032)..(2044)4001ctgctgtttctgtttgtttgatgcaaagaggacaatttagaagacctctttttggttcag60gagatcctaccagaggaagaaacataggacctgcctgccagcctttcatttttccttgcc120ctatcctttgtggtagtggagcctggatgctgttacccatgtaaaaggaaaggtttaaag180cgttatcctttgggcttttatcagaacatgttgctgaacaccaagcttttcaagatg237Metgtcctcctgagcatccttagaatccttctttggggactggtgctt282ValLeuLeuSerIleLeuArgIleLeuLeuTrpGlyLeuValLeu-265-260-255tttatggaacatagggtccaaatgacacaggtagggcagccctct327PheMetGluHisArgValGlnMetThrGlnValGlyGlnProSer-250-245-240attgcccacctgcctgaggcccctaccttgcccctgattcaggag372IleAlaHisLeuProGluAlaProThrLeuProLeuIleGlnGlu-235-230-225ctgctagaagaagcccctggcaagcagcagaggaagccgcgggtc417LeuLeuGluGluAlaProGlyLysGlnGlnArgLysProArgVal-220-215-210ttagggcatcccttacggtatatgctggagctgtaccagcgttca462LeuGlyHisProLeuArgTyrMetLeuGluLeuTyrGlnArgSer-205-200-195gctgacgcaagtggacaccctagggaaaaccgcaccattggggcc507AlaAspAlaSerGlyHisProArgGluAsnArgThrIleGlyAla-190-185-180accatggtgaggctggtgaggccgctggctagtgtagcaaggcct552ThrMetValArgLeuValArgProLeuAlaSerValAlaArgPro-175-170-165ctcagaggtgagttatcatactatattgttctggtgggagggggggagaaaatgggg609LeuArgaagaaaagtgtagaaaaaagtggatctgtcagttttctgtcaggcttcacattgcctaca669gggtaggtggttttcaaaagatggcacccttgggagaacctggctccaaatttgcttccc729tttagggctccaatttaagaacagattgccttggggcctccctgaggactttctnagttc789tgtatttgaggtgtttttctccgtctaggggtatgagtgatctaaaaatgagccacaatt849tgtcatcttaagggaaaaagacttggactcaaatctttattctaacaaacactggcttgt909gtgtcctctggcatagcttctctgagcttcagtttcctcgtctgcaaaatgggaatagca969actatctcataaggctattgtggattcaagagcaaatgcatgtaaagcatctaatacatt1029atataagtgctcaatagatcgctattatgatcttaaattcatctcaaggctgcttgtcag1089tttgtactgagcaggtctgttagagagactaaggctaggatataagaagctaacgctttg1149ctcttgttccctcttactaatgcaggctcctggcacatacagaccctggac1200GlySerTrpHisIleGlnThrLeuAsp-160-155tttcctctgagaccaaaccgggtagcataccaactagtcagagcc1245PheProLeuArgProAsnArgValAlaTyrGlnLeuValArgAla-150-145-140actgtggtttaccgccatcagcttcacctaactcattcccacctc1290ThrValValTyrArgHisGlnLeuHisLeuThrHisSerHisLeu-135-130-125tcctgccatgtggagccctgggtccagaaaagcccaaccaatcac1335SerCysHisValGluProTrpValGlnLysSerProThrAsnHis-120-115-110tttccttcttcaggaagaggctcctcaaagccttccctgttgcccaaa1383PheProSerSerGlyArgGlySerSerLysProSerLeuLeuProLys-105-100-95acttggacagagatggatatcatggaacatgttgggcaaaagctctgg1431ThrTrpThrGluMetAspIleMetGluHisValGlyGlnLysLeuTrp-90-85-80-75aatcacaaggggcgcagggttctacgactccgcttcgtgtgtcagcag1479AsnHisLysGlyArgArgValLeuArgLeuArgPheValCysGlnGln-70-65-60ccaagaggtagtgaggttcttgagttctggtggcatggcacttcatca1527ProArgGlySerGluValLeuGluPheTrpTrpHisGlyThrSerSer-55-50-45ttggacactgtcttcttgttactgtatttcaatgacactcagagtgtt1575LeuAspThrValPheLeuLeuLeuTyrPheAsnAspThrGlnSerVal-40-35-30cagaagaccaaacctctccctaaaggcctgaaagagtttacagaaaaa1623GlnLysThrLysProLeuProLysGlyLeuLysGluPheThrGluLys-25-20-15gacccttctcttctcttgaggagggctcgtcaagcaggcagtattgca1671AspProSerLeuLeuLeuArgArgAlaArgGlnAlaGlySerIleAla-10-5-115tcggaagttcctggcccctccagggagcatgatgggcctgaaagtaac1719SerGluValProGlyProSerArgGluHisAspGlyProGluSerAsn101520cagtgttccctccacccttttcaagtcagcttccagcagctgggctgg1767GlnCysSerLeuHisProPheGlnValSerPheGlnGlnLeuGlyTrp253035gatcactggatcattgctccccatctctataccccaaactactgtaag1815AspHisTrpIleIleAlaProHisLeuTyrThrProAsnTyrCysLys404550ggagtatgtcctcgggtactacactatggtctcaattctcccaatcat1863GlyValCysProArgValLeuHisTyrGlyLeuAsnSerProAsnHis55606570gccatcatccagaaccttgtcagtgagctggtggatcagaatgtccct1911AlaIleIleGlnAsnLeuValSerGluLeuValAspGlnAsnValPro758085cagccttcctgtgtcccttataagtatgttcccattagcatccttctg1959GlnProSerCysValProTyrLysTyrValProIleSerIleLeuLeu9095100attgaggcaaatgggagtatcttgtacaaggagtatgagggtatgatt2007IleGluAlaAsnGlySerIleLeuTyrLysGluTyrGluGlyMetIle105110115gcccagtcctgcacatgcaggtgacggcaaaggtgca2044AlaGlnSerCysThrCysArg1201252102211393212PRT213土耳其盤羊(Ovisaries)220221misc_feature222(235)..(237)223atg起始密碼子220221misc_feature222(208)..(210)223與5』atg密碼子在同一讀碼框中220221misc_feature222(784)..223n代表大約5.4kb的未測序的內含子220221misc_feature222(2029)..(2031)223tga終止密碼子4002MetValLeuLeuSerIleLeuArgIleLeuLeuTrpGlyLeuVal-265-260-255LeuPheMetGluHisArgValGlnMetThrGlnValGlyGlnPro-250-245-240SerIleAlaHisLeuProGluAlaProThrLeuProLeuIleGln-235-230-225GluLeuLeuGluGluAlaProGlyLysGlnGlnArgLysProArg-220-215-210ValLeuGlyHisProLeuArgTyrMetLeuGluLeuTyrGlnArg-205-200-195SerAlaAspAlaSerGlyHisProArgGluAsnArgThrIleGly-190-185-180AlaThrMetValArgLeuValArgProLeuAlaSerValAlaArg-175-170-165ProLeuArgGlySerTrpHisIleGlnThrLeuAspPheProLeu-160-155-150ArgProAsnArgValAlaTyrGlnLeuValArgAlaThrValVal-145-140-135TyrArgHisGlnLeuHisLeuThrHisSerHisLeuSerCysHis-130-125-120ValGluProTrpValGlnLysSerProThrAsnHisPheProSer-115-110-105SerGlyArgGlySerSerLysProSerLeuLeuProLysThrTrpThr-100-95-90GluMetAspIleMetGluHisValGlyGlnLysLeuTrpAsnHisLys-85-80-75GlyArgArgValLeuArgLeuArgPheValCysGlnGlnProArgGly-70-65-60SerGluValLeuGluPheTrpTrpHisGlyThrSerSerLeuAspThr-55-50-45-40ValPheLeuLeuLeuTyrPheAsnAspThrGlnSerValGlnLysThr-35-30-25LysProLeuProLysGlyLeuLysGluPheThrGluLysAspProSer-20-15-10LeuLeuLeuArgArgAlaArgGlnAlaGlySerIleAlaSerGluVal-5-115ProGlyProSerArgGluHisAspGlyProGluSerAsnGlnCysSer10152025LeuHisProPheGlnValSerPheGlnGlnLeuGlyTrpAspHisTrp303540IleIleAlaProHisLeuTyrThrProAsnTyrCysLysGlyValCys455055ProArgValLeuHisTyrGlyLeuAsnSerProAsnHisAlaIleIle606570GlnAsnLeuValSerGluLeuValAspGlnAsnValProGlnProSer758085CysValProTyrLysTyrValProIleSerIleLeuLeuIleGluAla9095100105AsnGlySerIleLeuTyrLysGluTyrGluGlyMetIleAlaGlnSer110115120CysThrCysArg12521032111195212DNA213土耳其盤羊(Ovisaries)220221CDS222(1)..(1179)220221misc_feature222(325)..(326)223內含子在基因組序列中的位置220221misc_feature222(793)..(804)223弗林蛋白酶切割序列220221mat_peptide222(805)..220221misc_feature222(896)..223Inverdale突變的位置4003atggtcctcctgagcatccttagaatccttctttggggactggtg45MetValLeuLeuSerIleLeuArgIleLeuLeuTrpGlyLeuVal-265-260-255ctttttatggaacatagggtccaaatgacacaggtagggcagccc90LeuPheMetGluHisArgValGlnMetThrGlnValGlyGlnPro-250-245-240tctattgcccacctgcctgaggcccctaccttgcccctgattcag135SerIleAlaHisLeuProGluAlaProThrLeuProLeuIleGln-235-230-225gagctgctagaagaagcccctggcaagcagcagaggaagccgcgg180GluLeuLeuGluGluAlaProGlyLysGlnGlnArgLysProArg-220-215-210gtcttagggcatcccttacggtatatgctggagctgtaccagcgt225ValLeuGlyHisProLeuArgTyrMetLeuGluLeuTyrGlnArg-205-200-195tcagctgacgcaagtggacaccctagggaaaaccgcaccattggg270SerAlaAspAlaSerGlyHisProArgGluAsnArgThrIleGly-190-185-180gccaccatggtgaggctggtgaggccgctggctagtgtagcaagg315AlaThrMetValArgLeuValArgProLeuAlaSerValAlaArg-175-170-165cctctcagaggctcctggcacatacagaccctggactttcctctg360ProLeuArgGlySerTrpHisIleGlnThrLeuAspPheProLeu-160-155-150agaccaaaccgggtagcataccaactagtcagagccactgtggtt405ArgProAsnArgValAlaTyrGlnLeuValArgAlaThrValVal-145-140-135taccgccatcagcttcacctaactcattcccacctctcctgccat450TyrArgHisGlnLeuHisLeuThrHisSerHisLeuSerCysHis-130-125-120gtggagccctgggtccagaaaagcccaaccaatcactttccttct495ValGluProTrpValGlnLysSerProThrAsnHisPheProSer-115-110-105tcaggaagaggctcctcaaagccttccctgttgcccaaaacttggaca543SerGlyArgGlySerSerLysProSerLeuLeuProLysThrTrpThr-100-95-90gagatggatatcatggaacatgttgggcaaaagctctggaatcacaag591GluMetAspIleMetGluHisValGlyGlnLysLeuTrpAsnHisLys-85-80-75gggcgcagggttctacgactccgcttcgtgtgtcagcagccaagaggt639GlyArgArgValLeuArgLeuArgPheValCysGlnGlnProArgGly-70-65-60agtgaggttcttgagttctggtggcatggcacttcatcattggacact687SerGluValLeuGluPheTrpTrpHisGlyThrSerSerLeuAspThr-55-50-45-40gtcttcttgttactgtatttcaatgacactcagagtgttcagaagacc735ValPheLeuLeuLeuTyrPheAsnAspThrGlnSerValGlnLysThr-35-30-25aaacctctccctaaaggcctgaaagagtttacagaaaaagacccttct783LysProLeuProLysGlyLeuLysGluPheThrGluLysAspProSer-20-15-10cttctcttgaggagggctcgtcaagcaggcagtattgcatcggaagtt831LeuLeuLeuArgArgAlaArgGlnAlaGlySerIleAlaSerGluVal-5-115cctggcccctccagggagcatgatgggcctgaaagtaaccagtgttcc879ProGlyProSerArgGluHisAspGlyProGluSerAsnGlnCysSer10152025ctccacccttttcaagacagcttccagcagctgggctgggatcactgg927LeuHisProPheGlnAspSerPheGlnGlnLeuGlyTrpAspHisTrp303540atcattgctccccatctctataccccaaactactgtaagggagtatgt975IleIleAlaProHisLeuTyrThrProAsnTyrCysLysGlyValCys455055cctcgggtactacactatggtctcaattctcccaatcatgccatcatc1023ProArgValLeuHisTyrGlyLeuAsnSerProAsnHisAlaIleIle606570cagaaccttgtcagtgagctggtggatcagaatgtccctcagccttcc1071GlnAsnLeuValSerGluLeuValAspGlnAsnValProGlnProSer758085tgtgtcccttataagtatgttcccattagcatccttctgattgaggca1119CysValProTyrLysTyrValProIleSerIleLeuLeuIleGluAla9095100105aatgggagtatcttgtacaaggagtatgagggtatgattgcccagtcc1167AsnGlySerIleLeuTyrLysGluTyrGluGlyMetIleAlaGlnSer110115120tgcacatgcaggtgacggcaaaggtgca1195CysThrCysArg1252104211393212PRT213土耳其盤羊(Ovisaries)220221misc_feature222(325)..(326)223內含子在基因組序列中的位置220221misc_feature222(793)..(804)223弗林蛋白酶切割序列220221misc_feature222(896)..223Inverdale突變的位置4004MetValLeuLeuSerIleLeuArgIleLeuLeuTrpGlyLeuVal-265-260-255LeuPheMetGluHisArgValGlnMetThrGlnValGlyGlnPro-250-245-240SerIleAlaHisLeuProGluAlaProThrLeuProLeuIleGln-235-230-225GluLeuLeuGluGluAlaProGlyLysGlnGlnArgLysProArg-220-215-210ValLeuGlyHisProLeuArgTyrMetLeuGluLeuTyrGlnArg-205-200-195SerAlaAspAlaSerGlyHisProArgGluAsnArgThrIleGly-190-185-180AlaThrMetValArgLeuValArgProLeuAlaSerValAlaArg-175-170-165ProLeuArgGlySerTrpHisIleGlnThrLeuAspPheProLeu-160-155-150ArgProAsnArgValAlaTyrGlnLeuValArgAlaThrValVal-145-140-135TyrArgHisGlnLeuHisLeuThrHisSerHisLeuSerCysHis-130-125-120ValGluProTrpValGlnLysSerProThrAsnHisPheProSer-115-110-105SerGlyArgGlySerSerLysProSerLeuLeuProLysThrTrpThr-100-95-90GluMetAspIleMetGluHisValGlyGlnLysLeuTrpAsnHisLys-85-80-75GlyArgArgValLeuArgLeuArgPheValCysGlnGlnProArgGly-70-65-60SerGluValLeuGluPheTrpTrpHisGlyThrSerSerLeuAspThr-55-50-45-40ValPheLeuLeuLeuTyrPheAsnAspThrGlnSerValGlnLysThr-35-30-25LysProLeuProLysGlyLeuLysGluPheThrGluLysAspProSer-20-15-10LeuLeuLeuArgArgAlaArgGlnAlaGlySerIleAlaSerGluVal-5-115ProGlyProSerArgGluHisAspGlyProGluSerAsnGlnCysSer10152025LeuHisProPheGlnAspSerPheGlnGlnLeuGlyTrpAspHisTrp303540IleIleAlaProHisLeuTyrThrProAsnTyrCysLysGlyValCys455055ProArgValLeuHisTyrGlyLeuAsnSerProAsnHisAlaIleIle606570GlnAsnLeuValSerGluLeuValAspGlnAsnValProGlnProSer758085CysValProTyrLysTyrValProIleSerIleLeuLeuIleGluAla9095100105AsnGlySerIleLeuTyrLysGluTyrGluGlyMetIleAlaGlnSer110115120CysThrCysArg12521052111195212DNA213土耳其盤羊(Ovisaries)220221CDS222(1)..(870)220221misc_feature222(325)..(326)223內含子在基因組序列中的位置220221misc_feature222(793)..(804)223弗林蛋白酶切割序列220221mat_peptide222(805)..220221misc_feature222(871)..223Hanna突變的位置4005atggtcctcctgagcatccttagaatccttctttggggactggtg45MetValLeuLeuSerIleLeuArgIleLeuLeuTrpGlyLeuVal-265-260-255ctttttatggaacatagggtccaaatgacacaggtagggcagccc90LeuPheMetGluHisArgValGlnMetThrGlnValGlyGlnPro-250-245-240tctattgcccacctgcctgaggcccctaccttgcccctgattcag135SerIleAlaHisLeuProGluAlaProThrLeuProLeuIleGln-235-230-225gagctgctagaagaagcccctggcaagcagcagaggaagccgcgg180GluLeuLeuGluGluAlaProGlyLysGlnGlnArgLysProArg-220-215-210gtcttagggcatcccttacggtatatgctggagctgtaccagcgt225ValLeuGlyHisProLeuArgTyrMetLeuGluLeuTyrGlnArg-205-200-195tcagctgacgcaagtggacaccctagggaaaaccgcaccattggg270SerAlaAspAlaSerGlyHisProArgGluAsnArgThrIleGly-190-185-180gccaccatggtgaggctggtgaggccgctggctagtgtagcaagg315AlaThrMetValArgLeuValArgProLeuAlaSerValAlaArg-175-170-165cctctcagaggctcctggcacatacagaccctggactttcctctg360ProLeuArgGlySerTrpHisIleGlnThrLeuAspPheProLeu-160-155-150agaccaaaccgggtagcataccaactagtcagagccactgtggtt405ArgProAsnArgValAlaTyrGlnLeuValArgAlaThrValVal-145-140-135taccgccatcagcttcacctaactcattcccacctctcctgccat450TyrArgHisGlnLeuHisLeuThrHisSerHisLeuSerCysHis-130-125-120gtggagccctgggtccagaaaagcccaaccaatcactttccttct495ValGluProTrpValGlnLysSerProThrAsnHisPheProSer-115-110-105tcaggaagaggctcctcaaagccttccctgttgcccaaaacttggaca543SerGlyArgGlySerSerLysProSerLeuLeuProLysThrTrpThr-100-95-90gagatggatatcatggaacatgttgggcaaaagctctggaatcacaag591GluMetAspIleMetGluHisValGlyGlnLysLeuTrpAsnHisLys-85-80-75gggcgcagggttctacgactccgcttcgtgtgtcagcagccaagaggt639GlyArgArgValLeuArgLeuArgPheValCysGlnGlnProArgGly-70-65-60agtgaggttcttgagttctggtggcatggcacttcatcattggacact687SerGluValLeuGluPheTrpTrpHisGlyThrSerSerLeuAspThr-55-50-45-40gtcttcttgttactgtatttcaatgacactcagagtgttcagaagacc735ValPheLeuLeuLeuTyrPheAsnAspThrGlnSerValGlnLysThr-35-30-25aaacctctccctaaaggcctgaaagagtttacagaaaaagacccttct783LysProLeuProLysGlyLeuLysGluPheThrGluLysAspProSer-20-15-10cttctcttgaggagggctcgtcaagcaggcagtattgcatcggaagtt831LeuLeuLeuArgArgAlaArgGlnAlaGlySerIleAlaSerGluVal-5-115cctggcccctccagggagcatgatgggcctgaaagtaactagtgttccc880ProGlyProSerArgGluHisAspGlyProGluSerAsn101520tccacccttttcaagtcagcttccagcagctgggctgggatcactggatcattgctcccc940atctctataccccaaactactgtaagggagtatgtcctcgggtactacactatggtctca1000attctcccaatcatgccatcatccagaaccttgtcagtgagctggtggatcagaatgtcc1060ctcagccttcctgtgtcccttataagtatgttcccattagcatccttctgattgaggcaa1120atgggagtatcttgtacaaggagtatgagggtatgattgcccagtcctgcacatgcaggt1180gacggcaaaggtgca11952106211290212PRT213土耳其盤羊(Ovisaries)220221misc_feature222(325)..(326)223內含子在基因組序列中的位置220221misc_feature222(793)..(804)223弗林蛋白酶切割序列220221misc_feature222(871)..223Hanna突變的位置4006MetValLeuLeuSerIleLeuArgIleLeuLeuTrpGlyLeuVal-265-260-255LeuPheMetGluHisArgValGlnMetThrGlnValGlyGlnPro-250-245-240SerIleAlaHisLeuProGluAlaProThrLeuProLeuIleGln-235-230-225GluLeuLeuGluGluAlaProGlyLysGlnGlnArgLysProArg-220-215-210ValLeuGlyHisProLeuArgTyrMetLeuGluLeuTyrGlnArg-205-200-195SerAlaAspAlaSerGlyHisProArgGluAsnArgThrIleGly-190-185-180AlaThrMetValArgLeuValArgProLeuAlaSerValAlaArg-175-170-165ProLeuArgGlySerTrpHisIleGlnThrLeuAspPheProLeu-160-155-150ArgProAsnArgValAlaTyrGlnLeuValArgAlaThrValVal-145-140-135TyrArgHisGlnLeuHisLeuThrHisSerHisLeuSerCysHis-130-125-120ValGluProTrpValGlnLysSerProThrAsnHisPheProSer-115-110-105SerGlyArgGlySerSerLysProSerLeuLeuProLysThrTrpThr-100-95-90GluMetAspIleMetGluHisValGlyGlnLysLeuTrpAsnHisLys-85-80-75GlyArgArgValLeuArgLeuArgPheValCysGlnGlnProArgGly-70-65-60SerGluValLeuGluPheTrpTrpHisGlyThrSerSerLeuAspThr-55-50-45-40ValPheLeuLeuLeuTyrPheAsnAspThrGlnSerValGlnLysThr-35-30-25LysProLeuProLysGlyLeuLysGluPheThrGluLysAspProSer-20-15-10LeuLeuLeuArgArgAlaArgGlnAlaGlySerIleAlaSerGluVal-5-115ProGlyProSerArgGluHisAspGlyProGluSerAsn101520210721175212DNA213土耳其盤羊(Ovisaries)220221CDS222(1)..(75)220221misc_feature222(28)..(30)223ctt密碼子在某些綿羊中已缺失4007atggtcctcctgagcatccttagaatccttctttggggactggtgctt48MetValLeuLeuSerIleLeuArgIleLeuLeuTrpGlyLeuValLeu151015tttatggaacatagggtccaaatgaca75PheMetGluHisArgValGlnMetThr2025210821125212PRT213土耳其盤羊(Ovisaries)220221misc_feature222(28)..(30)223ctt密碼子在某些綿羊中已缺失4008MetValLeuLeuSerIleLeuArgIleLeuLeuTrpGlyLeuValLeu151015PheMetGluHisArgValGlnMetThr2025210921172212DNA213土耳其盤羊(Ovisaries)220221misc_feature222(28)..(30)223可能的atg起始密碼子220221CDS222(1)..(72)223使用3』atg時的cds220221misc_feature222(1)..(72)223使用3』atg起始密碼子時的cds4009atgttgctgaacaccaagcttttcaagatggtcctcctgagcatcctt48MetLeuLeuAsnThrLysLeuPheLysMetValLeuLeuSerIleLeu151015agaatccttctttggggactggtg72ArgIleLeuLeuTrpGlyLeuVal202101021124212PRT213土耳其盤羊(Ovisaries)220221misc_feature222(28)..(30)223可能的atg起始密碼子220221misc_feature222(1)..(72)223使用3』atg時的cds40010MetLeuLeuAsnThrLysLeuPheLysMetValLeuLeuSerIleLeu151015ArgIleLeuLeuTrpGlyLeuVal2021011211759212DNA213野豬(Susscrofa)220221CDS222(2)..(757)223比終止密碼子少5個核苷酸的序列終止子220221mat_peptide222(389)..40011acttcacctagctcccttccacctctcctgccatgtggagccctgg46LeuHisLeuAlaProPheHisLeuSerCysHisValGluProTrp-125-120-115atccagaaaagcacaaccagtcactttccttcctcaggaagaggc91IleGlnLysSerThrThrSerHisPheProSerSerGlyArgGly-110-105-100tccttaaagccttccctgctgccccaagcttggacggagatggatgtc139SerLeuLysProSerLeuLeuProGlnAlaTrpThrGluMetAspVal-95-90-85acgcaacatgttggacaaaagctctggaatcacaaggggcgcagggtt187ThrGlnHisValGlyGlnLysLeuTrpAsnHisLysGlyArgArgVal-80-75-70ctacgactccgcttcatgtgtcagcagcaaaatggtagtgagattctt235LeuArgLeuArgPheMetCysGlnGlnGlnAsnGlySerGluIleLeu-65-60-55gagttccgggggcgtggcatttcatccctggacactgccttcttgtta283GluPheArgGlyArgGlyIleSerSerLeuAspThrAlaPheLeuLeu-50-45-40ctctatttcaatgacactcggagtgttcagaaggccaaacttcttccc331LeuTyrPheAsnAspThrArgSerValGlnLysAlaLysLeuLeuPro-35-30-25-20agaggcctggaagagtttatggcaagagacccttctcttcttttgcgg379ArgGlyLeuGluGluPheMetAlaArgAspProSerLeuLeuLeuArg-15-10-5aaggcccggcaagcaggcagcatcgcatctgaggttcttggcccctcc427LysAlaArgGlnAlaGlySerIleAlaSerGluValLeuGlyProSer-11510agggagcacgatgggcctgaaagtaaccagtgttccctccatcctttc475ArgGluHisAspGlyProGluSerAsnGlnCysSerLeuHisProPhe152025caagtcagcttccaccaactgggttgggatcattggatcattgctccc523GlnValSerPheHisGlnLeuGlyTrpAspHisTrpIleIleAlaPro30354045catttctataccccaaactactgtaagggggtctgccctcgggtacta571HisPheTyrThrProAsnTyrCysLysGlyValCysProArgValLeu505560cactatggtctcaattcccccaatcatgccatcatccagaaccttgtc619HisTyrGlyLeuAsnSerProAsnHisAlaIleIleGlnAsnLeuVal657075aatgagctggtggaccagagtgtccctcagccctcctgtgtcccttat667AsnGluLeuValAspGlnSerValProGlnProSerCysValProTyr808590aagtatgtgcctattagcatcctcctgattgaggcaaatgggagtatc715LysTyrValProIleSerIleLeuLeuIleGluAlaAsnGlySerIle95100105ttgtacaaggagtatgaggatatgattgcccagtcctgtacgtg759LeuTyrLysGluTyrGluAspMetIleAlaGlnSerCysThr11011512021012211252212PRT213野豬(Susscrofa)40012LeuHisLeuAlaProPheHisLeuSerCysHisValGluProTrp-125-120-115IleGlnLysSerThrThrSerHisPheProSerSerGlyArgGly-110-105-100SerLeuLysProSerLeuLeuProGlnAlaTrpThrGluMetAspVal-95-90-85ThrGlnHisValGlyGlnLysLeuTrpAsnHisLysGlyArgArgVal-80-75-70LeuArgLeuArgPheMetCysGlnGlnGlnAsnGlySerGluIleLeu-65-60-55GluPheArgGlyArgGlyIleSerSerLeuAspThrAlaPheLeuLeu-50-45-40LeuTyrPheAsnAspThrArgSerValGlnLysAlaLysLeuLeuPro-35-30-25-20ArgGlyLeuGluGluPheMetAlaArgAspProSerLeuLeuLeuArg-15-10-5LysAlaArgGlnAlaGlySerIleAlaSerGluValLeuGlyProSer-11510ArgGluHisAspGlyProGluSerAsnGlnCysSerLeuHisProPhe152025GlnValSerPheHisGlnLeuGlyTrpAspHisTrpIleIleAlaPro30354045HisPheTyrThrProAsnTyrCysLysGlyValCysProArgValLeu505560HisTyrGlyLeuAsnSerProAsnHisAlaIleIleGlnAsnLeuVal657075AsnGluLeuValAspGlnSerValProGlnProSerCysValProTyr808590LysTyrValProIleSerIleLeuLeuIleGluAlaAsnGlySerIle95100105LeuTyrLysGluTyrGluAspMetIleAlaGlnSerCysThr11011512021013211857212DNA213馬鹿(Cervuselaphus)220221CDS222(3)..(854)220221mat_peptide222(480)..40013gctcctggcacatacagaccctggactttcctctgagaccaaaccgg47SerTrpHisIleGlnThrLeuAspPheProLeuArgProAsnArg-155-150-145gtagcctaccaactagtcagagccactgtggtttaccgccatcaa92ValAlaTyrGlnLeuValArgAlaThrValValTyrArgHisGln-140-135-130cttcacctaactcattcccacctctcctgccatgtggagccctgg137LeuHisLeuThrHisSerHisLeuSerCysHisValGluProTrp-125-120-115atccagaaaagcccaaccagtcactttccttcttcaggaagaggc182IleGlnLysSerProThrSerHisPheProSerSerGlyArgGly-110-105-100tcctcaaagccttccctgctgcccaaagcttggacagagatggatatc230SerSerLysProSerLeuLeuProLysAlaTrpThrGluMetAspIle-95-90-85atggaacatgttggacaaaagctgtggaatcgcaaggggcgcagggtt278MetGluHisValGlyGlnLysLeuTrpAsnArgLysGlyArgArgVal-80-75-70ctacgactccgcttcatgtgtcagcagccaagaggtagtgaggttctt326LeuArgLeuArgPheMetCysGlnGlnProArgGlySerGluValLeu-65-60-55gagttctggtggcatggcacttcatcattggacactgtcttcttgtta374GluPheTrpTrpHisGlyThrSerSerLeuAspThrValPheLeuLeu-50-45-40ctgtatttcaatgacactcagagtgttcagaagaccaaacctctccct422LeuTyrPheAsnAspThrGlnSerValGlnLysThrLysProLeuPro-35-30-25-20aaaggcctgaaagagtttacagaaaaagacccttctcttctcttgagg470LysGlyLeuLysGluPheThrGluLysAspProSerLeuLeuLeuArg-15-10-5agggctcgtcaagcaggcagtatcgcatctgaagttcctggcccctcc518ArgAlaArgGlnAlaGlySerIleAlaSerGluValProGlyProSer-11510agggagcatgatgggcctgaaagtaaccagtgttccctccaccctttt566ArgGluHisAspGlyProGluSerAsnGlnCysSerLeuHisProPhe152025caagtcagcttccagcagctgggctgggatcactggatcattgctccc614GlnValSerPheGlnGlnLeuGlyTrpAspHisTrpIleIleAlaPro30354045aatctctataccccaaactactgtaagggagtgtgtcctcgggtacta662AsnLeuTyrThrProAsnTyrCysLysGlyValCysProArgValLeu505560cactatggtctcaattctcccaatcatgccatcatccagaaccttgtc710HisTyrGlyLeuAsnSerProAsnHisAlaIleIleGlnAsnLeuVal657075aatgagctggtggatcagagtgtccctcagccttcctgtgtcccttat758AsnGluLeuValAspGlnSerValProGlnProSerCysValProTyr808590aagtatgttcccattagcatcctgctgattgaggcaaatgggagtatc806LysTyrValProIleSerIleLeuLeuIleGluAlaAsnGlySerIle95100105ttgtacaaggagtatgagggtatgattgcccagtcctgcacatgcagg854LeuTyrLysGluTyrGluGlyMetIleAlaGlnSerCysThrCysArg110115120125tga85721014211284212PRT213馬鹿(Cervuselaphus)40014SerTrpHisIleGlnThrLeuAspPheProLeuArgProAsnArg-155-150-145ValAlaTyrGlnLeuValArgAlaThrValValTyrArgHisGln-140-135-130LeuHisLeuThrHisSerHisLeuSerCysHisValGluProTrp-125-120-115IleGlnLysSerProThrSerHisPheProSerSerGlyArgGly-110-105-100SerSerLysProSerLeuLeuProLysAlaTrpThrGluMetAspIle-95-90-85MetGluHisValGlyGlnLysLeuTrpAsnArgLysGlyArgArgVal-80-75-70LeuArgLeuArgPheMetCysGlnGlnProArgGlySerGluValLeu-65-60-55GluPheTrpTrpHisGlyThrSerSerLeuAspThrValPheLeuLeu-50-45-40LeuTyrPheAsnAspThrGlnSerValGlnLysThrLysProLeuPro-35-30-25-20LysGlyLeuLysGluPheThrGluLysAspProSerLeuLeuLeuArg-15-10-5ArgAlaArgGlnAlaGlySerIleAlaSerGluValProGlyProSer-11510ArgGluHisAspGlyProGluSerAsnGlnCysSerLeuHisProPhe152025GlnValSerPheGlnGlnLeuGlyTrpAspHisTrpIleIleAlaPro30354045AsnLeuTyrThrProAsnTyrCysLysGlyValCysProArgValLeu505560HisTyrGlyLeuAsnSerProAsnHisAlaIleIleGlnAsnLeuVal657075AsnGluLeuValAspGlnSerValProGlnProSerCysValProTyr808590LysTyrValProIleSerIleLeuLeuIleGluAlaAsnGlySerIle95100105LeuTyrLysGluTyrGluGlyMetIleAlaGlnSerCysThrCysArg11011512012521015211857212DNA213家山羊(Caprahircus)220221CDS222(3)..(854)220221mat_peptide222(480)..40015gctcctggcacatacagaccctggactttcctctgagaccaaaccgg47SerTrpHisIleGlnThrLeuAspPheProLeuArgProAsnArg-155-150-145gtagcataccaactagtcagagccactgtggtttaccgccatcag92ValAlaTyrGlnLeuValArgAlaThrValValTyrArgHisGln-140-135-130cttcacctaactcattcccacctctcctgccatgtggagccctgg137LeuHisLeuThrHisSerHisLeuSerCysHisValGluProTrp-125-120-115gggcagaaaagcccaaccaatcactttccttcttcaggaagaggc182GlyGlnLysSerProThrAsnHisPheProSerSerGlyArgGly-110-105-100tccccaaagccttccctgttgcccaaaacttggacagagatggatatc230SerProLysProSerLeuLeuProLysThrTrpThrGluMetAspIle-95-90-85atggaacatgttgggcaaaagctctggaatcacaaggggcgcagggtt278MetGluHisValGlyGlnLysLeuTrpAsnHisLysGlyArgArgVal-80-75-70ctacgactccgcttcgtatgtcagcagccaagaggtagtgaggttctt326LeuArgLeuArgPheValCysGlnGlnProArgGlySerGluValLeu-65-60-55gagttctggtggcatggcacttcatcattggacactgtcttcttgtta374GluPheTrpTrpHisGlyThrSerSerLeuAspThrValPheLeuLeu-50-45-40ctgtatttcaatgacactcagagtgttcagaaaaccaaacctctccct422LeuTyrPheAsnAspThrGlnSerValGlnLysThrLysProLeuPro-35-30-25-20aaaggcctgaaagagtttacagaaaaagacccttctcttctcttgagg470LysGlyLeuLysGluPheThrGluLysAspProSerLeuLeuLeuArg-15-10-5agggctcgtcaagcaggcagtattgcatctgaagttcctggcccctcc518ArgAlaArgGlnAlaGlySerIleAlaSerGluValProGlyProSer-11510agggagcatgatgggcctgaaagtaaccagtgttccctccaccctttt566ArgGluHisAspGlyProGluSerAsnGlnCysSerLeuHisProPhe152025caagtcagcttccagcagctgggctgggatcactggatcattgctccc614GlnValSerPheGlnGlnLeuGlyTrpAspHisTrpIleIleAlaPro30354045catctctataccccaaactactgtaagggagtatgtcctcgggtacta662HisLeuTyrThrProAsnTyrCysLysGlyValCysProArgValLeu505560tactatggtctcaattctcccaatcatgccatcatccagaaccttgtc710TyrTyrGlyLeuAsnSerProAsnHisAlaIleIleGlnAsnLeuVal657075aatgagctggtggatcagaatgtccctcagccttcctgtgtcccttat758AsnGluLeuValAspGlnAsnValProGlnProSerCysValProTyr808590aagtatgttcccattagcatccttctgattgaggcaaatgggagtatc806LysTyrValProIleSerIleLeuLeuIleGluAlaAsnGlySerIle95100105ttgtacaaggagtatgagggtatgattgcccagtcctgcacatgcagg854LeuTyrLysGluTyrGluGlyMetIleAlaGlnSerCysThrCysArg110115120125tga85721016211284212PRT213家山羊(Caprahircus)40016SerTrpHisIleGlnThrLeuAspPheProLeuArgProAsnArg-155-150-145ValAlaTyrGlnLeuValArgAlaThrValValTyrArgHisGln-140-135-130LeuHisLeuThrHisSerHisLeuSerCysHisValGluProTrp-125-120-115GlyGlnLysSerProThrAsnHisPheProSerSerGlyArgGly-110-105-100SerProLysProSerLeuLeuProLysThrTrpThrGluMetAspIle-95-90-85MetGluHisValGlyGlnLysLeuTrpAsnHisLysGlyArgArgVal-80-75-70LeuArgLeuArgPheValCysGlnGlnProArgGlySerGluValLeu-65-60-55GluPheTrpTrpHisGlyThrSerSerLeuAspThrValPheLeuLeu-50-45-40LeuTyrPheAsnAspThrGlnSerValGlnLysThrLysProLeuPro-35-30-25-20LysGlyLeuLysGluPheThrGluLysAspProSerLeuLeuLeuArg-15-10-5ArgAlaArgGlnAlaGlySerIleAlaSerGluValProGlyProSer-11510ArgGluHisAspGlyProGluSerAsnGlnCysSerLeuHisProPhe152025GlnValSerPheGlnGlnLeuGlyTrpAspHisTrpIleIleAlaPro30354045HisLeuTyrThrProAsnTyrCysLysGlyValCysProArgValLeu505560TyrTyrGlyLeuAsnSerProAsnHisAlaIleIleGlnAsnLeuVal657075AsnGluLeuValAspGlnAsnValProGlnProSerCysValProTyr808590LysTyrValProIleSerIleLeuLeuIleGluAlaAsnGlySerIle9510010權利要求1.一種分離的野生型GDF-9B核酸分子，包含選自下組的核苷酸序列a)SEQIDNO1；b)能在嚴格條件下與a)所述分子雜交的序列；c)一種序列，其為a)所述分子的功能性變體或片段；d)與a)，b)或c)所定義的分子互補的序列；以及e)對應於a)-d)中任一項所述分子的反義序列。2.一種分離的突變的GDF-9B全長核酸分子，包含選自下組的核苷酸序列a)SEQIDNO3或SEQIDNO5；b)能在嚴格條件下與a)所述分子雜交的序列；c)一種序列，其為a)所述分子的功能性變體或片段；d)與a)，b)或c)所定義的分子互補的序列；以及e)對應於a)-d)中任一項所述分子的反義序列。3.一種分離的全長GDF-9B多肽，包含選自下組的胺基酸序列a)SEQIDNO2，SEQIDNO4，或SEQIDNO6；和b)按照a)所述的序列的功能性變體或片段。4.同二聚體成熟GDF-9B多肽，具有含以下胺基酸序列的亞單位，所述序列選自SEQIDNO2或該序列的功能性片段或變體。5.異二聚體多肽，其具有選自下組的亞單位a)成熟的.GDF-9B多肽，含有衍生自SEQIDNO2或該序列的功能性片段或變體的胺基酸序列；和b)成熟的GDF-9多肽或其功能性變體或片段。6.一種載體，其含有權利要求1或2的核酸分子。7.一種構建體，含有權利要求1或2的核酸分子。8.一種宿主細胞，被權利要求6或7的載體或構建體轉化。9.一種配體，其能與由權利要求3所述全長前原多肽衍生的多肽結合。10.一種配體，其能與權利要求4所述同二聚體多肽結合。11.一種配體，其能與權利要求5所述異二聚體多肽結合。12.權利要求10或11的配體，其中該配體是抗體或含有其抗原結合區的抗體片段。13.權利要求12的配體，其中該配體是單克隆抗體。14.權利要求10或11的配體，其中該配體是噬菌體展示分子。15.權利要求10或11的配體，其中該配體是細胞表面受體的形式。16.一種表達具有生物活性的經過加工的同二聚體GDF-9B多肽的方法，包括以下步驟a)製備含有以下核酸分子的表達構建體，所述分子含有選自SEQIDNO1或該序列的功能性片段或變體的核酸序列；b)用上述構建體轉染適當的細胞；c)選擇穩定的克隆；和d)分離並純化所表達的多肽。17.一種表達具有生物活性的經過加工的異二聚體GDF-9B和GDF-9多肽的方法，包括以下步驟a)製備含有以下核酸分子的表達構建體，所述分子含有(i)選自SEQIDNO1或該序列的功能性片段或變體的核酸序列；(ii)編碼GDF-9或其功能性片段或變體的核酸分子；b)用上述構建體轉染適當的細胞；c)選擇穩定的克隆；和d)分離並純化所表達的多肽。18.一種將GDF-9B表達盒或GDF-9表達盒，通過腺病毒、逆轉錄病毒或α病毒，轉移至宿主細胞或生物，從而體內表達GDF-9B同二聚體或GDF-9B/GDF-9異二聚體的方法，該方法包括將含有表達盒的重組腺病毒轉移至受者細胞、器官培養物或受體動物的步驟，其中所述表達盒含有一種核酸分子，該核酸分子具有選自SEQIDNO1或該序列的功能性片段或變體的核苷酸序列，並且該核酸分子與表達控制序列可操作地相連。19.一種轉基因動物，其被權利要求6或7的載體或構建體轉化。20.一種在體內改變雌性哺乳動物或其它雌性脊椎動物卵泡的生長的方法，該方法包括用GDF-9B和GDF-9表達盒轉化哺乳動物和其它脊椎動物卵巢宿主細胞，使GDF-9B同二聚體和GDF-9B/GDF-9異二聚體過度表達。21.一種在體外改變雌性哺乳動物或其它雌性脊椎動物卵泡的生長的方法，該方法包括用GDF-9B和GDF-9表達盒轉化哺乳動物和其它脊椎動物卵巢宿主細胞，使GDF-9B同二聚體和GDF-9B/GDF-9異二聚體過度表達。22.權利要求19或20的方法，其中所述哺乳動物選自綿羊、牛、山羊、鹿、人、豬、馬、camelids、負鼠、貓和狗以及商業上重要的其它任何物種。23.權利要求19或20的方法，其中所述脊椎動物選自小雞、鴨、鵝、鮭魚和商業上重要的其它任何物種。24.一種組合物，含有有效量的選自下組的製劑，以及可藥用或獸用的載體(包括佐劑)或稀釋劑；並任選包括補加的促性腺激素a)一種同二聚體多肽，其具有含GDF-9B多肽或其功能性變體或片段的亞單位，還有或不具有如下同二聚體多肽，所述多肽具有含GDF-9多肽或其功能性變體或片段的亞單位；b)一種異二聚體多肽，其具有含GDF-9B多肽和GDF-9多肽、或者所述GDF-9B或GDF-9多肽的功能性片段或變體的亞單位。25.選自下組的製劑的用途a)一種同二聚體多肽，其具有含GDF-9B多肽或其功能性變體或片段的亞單位，還有或不具有如下的同二聚體多肽，所述多肽具有含GDF-9多肽或其功能性變體或片段的亞單位；b)一種異二聚體多肽，其具有含GDF-9B多肽和GDF-9多肽、或者所述GDF-9B或GDF-9多肽的功能性片段或變體的亞單位；所述製劑還配有或未配有補加的促性腺激素和/或其它卵巢生長因子，包括IGF-1，kit配體(幹細胞因子)，表皮生長因子或TGFβ激動劑/拮抗劑，所述用途是i)在體內或體外改變哺乳動物或其它脊椎動物卵巢中卵泡的生長；或ii)體外改變分離的卵巢細胞的生長/成熟。26.一種評估GDF-9B同二聚體和/或GDF-9B/GDF-9異二聚體的活性的方法，包括以下步驟a)將有效量的GDF-9B同二聚體多肽和/或GDF-9B/GDF-9異二聚體多肽加入具有或不具有其它卵巢生長因子的卵巢細胞或器官培養物中，所述其它卵巢生長因子包括TGFβ激動劑/拮抗劑；和b)對上述細胞或器官培養物進行生物檢測，以便評估上述同二聚體多肽和異二聚體多肽的生物活性。27.一種改變卵泡的生長的方法，包括導入權利要求9-15中任一項所述的配體的步驟，以便ii)在體內或體外改變哺乳動物或其它脊椎動物卵巢中卵泡的生長；或iii)在體外改變分離的卵巢細胞的生長/成熟。28.分離的功能性變體多肽，包含選自SEQIDNO17的胺基酸序列。29.分離的功能性變體多肽，包含選自SEQIDNO18的胺基酸序列。30.分離的核酸分子，包含選自SEQIDNO11，SEQIDNO13，和SEQIDNO15，或這些序列的功能性片段或變體的核酸序列。31.分離的多肽，包含選自SEQIDNO12，SEQIDNO14，和SEQIDNO16，或這些序列的功能性片段或變體的胺基酸序列。32.分離的核酸分子，基本上如本文所述，參照任何實施例和/或附圖。33.分離的多肽，基本上如本文所述，參照任何實施例和/或附圖。34.一種載體或基因構建體，其摻入了本發明的分離的核酸分子，該分子基本上如本文所述，參照任何實施例和/或附圖。35.一種能與本發明的多肽結合的配體，所述多肽基本上如本文所述，參照任何實施例和/或附圖。36.一種同二聚體多肽，基本上如本文所述，參照任何實施例和/或附圖。37.一種異二聚體多肽，基本上如本文所述，參照任何實施例和/或附圖。38.一種表達具有生物活性的經過加工的同二聚體多肽的方法，所述方法基本上如本文所述，參照任何實施例和/或附圖。39.一種表達具有生物活性的經過加工的異二聚體多肽的方法，所述方法基本上如本文所述，參照任何實施例和/或附圖。40.一種通過腺病毒轉移多肽從而體內表達本發明的同二聚體多肽或異二聚體多肽的方法，所述方法基本上如本文所述，參照任何實施例和/或附圖。41.一種改變雌性哺乳動物或其它脊椎動物卵泡生長的方法，所述方法基本上如本文所述，參照任何實施例和/或附圖。42.一種組合物，基本上如本文所述，參照任何實施例和/或附圖。43.同二聚體多肽或異二聚體多肽改變卵泡生長的用途，基本上如本文所述，參照任何實施例和/或附圖。44.一種評估同二聚體多肽或異二聚體多肽的生物學活性的方法，基本上如本文所述，參照任何實施例和/或附圖。全文摘要本發明涉及能在體內或體外改變卵泡生長的卵母細胞因子的核苷酸序列和胺基酸序列。本發明還涉及新的同二聚體多肽和異二聚體多肽以及它們在體內或體外改變哺乳動物卵泡生長的用途。具體地，本發明廣泛涉及針對這些同或異二聚體多肽或其功能性片段或變體的主動或被動免疫，從而能在體內或體外改變卵泡的生長。文檔編號C12N5/10GK1636012SQ01811272公開日2005年7月6日申請日期2001年6月15日優先權日2000年6月15日發明者米卡·P·E·萊廷南,奧利·V·P·裡特沃斯,喬治·H·戴維斯,蘇珊·M·加洛韋,珍妮·於恩格爾,肯尼思·P·麥克納蒂,凱薩·N·J·沃喬萊南申請人:農業研究有限公司,米卡·P·E·萊廷南,奧利·V·P·裡特沃斯