用於測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇的方法以及用於所述方法的傳感器晶片和測定試劑盒的製作方法

2023-10-24 06:52:22

專利名稱：：用於測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇的方法以及用於所述方法的傳感器晶片和測定試劑盒的製作方法
技術領域：
：本發明涉及用於測定血液中受到葡萄糖和/或其衍生物幹擾的1,5-脫水葡萄糖醇的方法，具體涉及電化學測定血液中的1,5-脫水葡萄糖醇的方法、用於測定的傳感器晶片和包括所述傳感器晶片的用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的試劑盒，所述方法的特徵在於使用全血作為樣本，並且不需要血細胞分離。
背景技術：
：近年來，隨著飲食變得更加豐富，糖尿病患者數目也在增加。為了預防糖尿病患者的併發症，血糖水平需要保持在接近健康人的水平，血糖水平自測裝置被廣泛使用，使得患者可以自己在家裡監測血糖水平。然而，由於血糖水平隨膳食而改變，並且測定需要頻繁進行，因此患者遭受沉重的負擔。對於患者而言，還由於缺乏知識而難以正確解釋測定值，並且嚴格控制血糖水平也並不容易。同時，由於1,5-脫水葡萄糖醇不受膳食影響並且反映糖尿病患者在過去一周內的血糖控制，因此糖尿病患者只要在家裡通過"一周一次"測定就能夠準確了解他們的血糖控制。1,5-脫水葡萄糖醇自測試劑盒將為患者提供極大好處，但使用血清或血槳作為樣本來測定1,5-脫水葡萄糖醇的常規方法需要血細胞分離而且不適合用於自測，因為測定需要大量的樣本。因此，還沒有實現1，5-脫水葡萄糖醇自測試劑盒，包括使用痕量原樣全血作為樣本的自測試劑盒。專利文獻1至9中所述的1,5-脫水葡萄糖醇測定方法使用血清或血漿而不是全血作為樣本，並且不涉及電化學測定。5此外，當將全血樣本用於由和光純藥工業株式會社(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)銷售的動物用1,5AG試劑盒(日本化藥株式會社(NipponKayakuCo.,Ltd.))時，通過添加淨化水或10mM乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液將血液溶解，再離心分離，用柱處理上清液，並通過使用色素的比色法測定1，5-脫水葡萄糖醇。換句話說，這種方法不是在不分離血細胞的情況下使用原樣全血作為樣本以電化學測定1，5-脫水葡萄糖醇的方法。通常使用血清或血漿而不是全血作為樣本的原因在於血細胞中還包含葡萄糖。即使當將用於消除或轉化葡萄糖的試劑添加到全血中時，葡萄糖仍保留在血細胞中而未消除或轉化。由於葡萄糖在測定血液中的1,5-脫水葡萄糖醇的步驟中通過細胞膜釋放，因此不能完全消除葡萄糖的幹擾。在用於檢測血液中的1，5-脫水葡萄糖醇的反應中，預期會受到具有氧化-還原能力的紅細胞中血色素的幹擾。到目前為止，通過預先酶促消除或轉化葡萄糖而不分離血細胞，使用全血測定血液1，5-脫水葡萄糖醇的方法是未知的。此外，電化學測定1，5-脫水葡萄糖醇的方法描述於非專利文獻1及專利文獻10和11中。然而，非專利文獻1描述了使用由過氧化氫電極和酶固定膜組成的酶傳感器測定尿中的1,5-脫水葡萄糖醇的方法。然而，沒有提及在共存有葡萄糖等的全血中的1,5-脫水葡萄糖醇的測定。在專利文獻10中，通過使用脫氫酶和吩嗪硫酸二甲酯作為電子受體的電流分析法測定1,5-脫水葡萄糖醇。然而，只提到了1,5-脫水葡萄糖醇的參比標準的例子，但沒有關於在全血中測定的描述。在專利文獻11中，使具有氧化1,5-脫水葡萄糖醇的能力的酶發揮作用，並使用過氧化氫電極電化學測定所產生的過氧化氫。然而，該測定中也使用血清，這不是使用全血的測定方法。同時，1，5-脫水葡萄糖醇是作為在1位的還原葡萄糖的化合物並具有與葡萄糖極為相似的化學結構。因此，用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的許多酶也與葡萄糖反應。血液包含比1,5-脫水葡萄糖醇高20倍或更多的葡萄糖。因此，要測定1，5-脫水葡萄糖醇，必須通過某種方式消除或轉化葡萄糖，以使葡萄糖不應與用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的酶反應。此外，當通過該轉化產生的葡萄糖衍生物與用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的酶反應時，這些衍生物也必須被消除或轉化。葡萄糖通過如下方式來消除或轉化，在專利文獻1中，用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖或用己糖激酶將葡萄糖磷酸化；在專利文獻2中，用葡萄糖氧化酶和葡糖酸內酯酶或葡萄糖脫氫瞎和葡糖酸內酯酶氧化葡萄糖；在專利文獻3和4中，用己糖激酶、己糖磷酸異構酶和6-磷酸果糖激酶或葡萄糖異構酶、果糖激酶和6-磷酸果糖激酶將葡萄糖轉化成果糖1，6-二磷酸；在專利文獻5中，用葡萄糖激酶或己糖激酶將葡萄糖磷酸化；及在專利文獻6中，用使葡萄糖磷酸化為葡萄糖-6-磷酸的酶將葡萄糖磷酸化，然後測定1,5-脫水葡萄糖醇。在這些文獻中，葡萄糖被轉化為葡糖酸-l,5-內酯、葡萄糖-6-磷酸、葡糖酸、果糖-6-磷酸、果糖1,6-二磷酸等。然而，到目前為止，通過用酶消除或轉化全血中的葡萄糖，然後用酶電化學定量全血中的1,5-脫水葡萄糖醇的測定法是未知的。專利文獻l:日本專利2983015號專利文獻2:JP-A-2001-78797專利文獻3:日本專利3170320號專利文獻4:日本專利3217180號專利文獻5:JP-A-2001-116756專利文獻6:日本專利2872983號專利文獻7:JP-A-63-185397專利文獻8:JP-A-10-191998專利文獻9:JP-A-8-70893專利文獻10:JP-A-7-67697專利文獻11:JP-A-62-79780專利文獻12:JP-A-5-304997專利文獻13:JP-A-63-22185專利文獻14:JP-A-2-268679專利文獻15:JP-A-2000-135079專利文獻16:JP-A-11-18760專利文獻17:JP-A-2000-175698專利文獻18:JP-A-10-179140非專利文獻1Biomed.Chromatogr.,vol.7，p.41(1993)
發明內容本發明要解決的問題近來，對於臨床實驗室測試來說，稱為即時檢驗(PointofCareTesting)的各種床邊或門診測試項目的快速測定和由患者自己在家中進行的血糖水平測定已經日益實施。由於在這樣的情況下使用離心機獲得血清或血漿是複雜的並且需要時間，因此在實際臨床環境(clinicalsetting)中難以使用。尤其是，在由患者自己在家中進行的測定中，將使用穿刺裝置和樣品採集裝置採集的例如不超過幾十pL的痕量血液用作樣品。因此，不能使用應用離心機獲得血清的測定方法。由此，期待使用原樣全血作為樣本測定1，5-脫水葡萄糖醇的方法。解決問題的方法
技術領域：
：本發明人為了解決上述問題進行了各種研究。結果，他們發現了使用原樣全血作為樣本電化學測定血液中1,5-脫水葡萄糖醇的方法，並且完成了本發明。也就是說，本發明涉及下列內容。(1)一種測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇的方法，所述方法包括消除或轉化幹擾測定的葡萄糖和/或其衍生物的步驟和測定1,5-脫水葡萄糖醇的後續步驟，其中不分離血細胞而使用原樣全血消除或轉化葡萄糖和/或其衍生物，然後不分離血細胞而讓用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的酶發揮作用，以電化學測定1，5-脫水葡萄糖醇。(2)上面(l)的測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其中所述用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的酶是氧化還原酶。(3)上面(2)的測定1，5-脫水葡萄糖醇的方法，其中所述氧化還原酶是吡喃糖氧化酶、L-山梨糖氧化酶或1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶。(4)上面(3)的測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其中所述氧化還原酶衍生自假單孢菌(Pseudomonas)屬或土壤桿菌(Agrobacterium)屬。(5)上面(1)至(4)中任一項的測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其中在氧化還原介體的存在下，電化學測定所述1,5-脫水葡萄糖醇。(6)上面(5)的測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其中所述氧化還原介體為鋨絡合物、醌化合物、二茂鐵化合物、吩噻嗪化合物、吩嗎嗪化合物、吩嗪化合物、靛酚化合物、二苯胺化合物或酚化合物。(7)上面(1)至(6)中任一項的測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其中不分離血細胞，用酶從原樣全血中消除或轉化所述葡萄糖和/或其衍生物。(8)上面(1)至(7)中任一項的測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其中在穩定劑的存在下，電化學測定所述1,5-脫水葡萄糖醇。(9)上面(8)的測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其中所述穩定劑是2-磺基苯甲酸或3-磺基苯甲酸。(10)上面(1)至(9)中任一項的測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其中通過電流分析法、電量分析法或循環伏安法來電化學測定所述1,5-脫水葡萄糖醇。(11)上面(1)至(10)中任一項的測定1，5-脫水葡萄糖醇的方法，其中使用具有用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的工作電極和對電極的電極，電化學測定所述1，5-脫水葡萄糖醇，所述用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的工作電極包含用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的氧化還原酶和氧化還原介體。(12)上面(ll)的測定1，5-脫水葡萄糖醇的方法，其中使用差分電極(differentialelectrode),電化學測定1,5-脫水葡萄糖醇。(13)上面(12)的測定1，5-脫水葡萄糖醇的方法，其中所述差分電極是這樣的電極，它具有用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的工作電極、用於測定空白的工作電極和對電極，所述用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的工作電極包含用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的氧化還原酶和氧化還原介體，所述用於測定空白的工作電極包含氧化還原介體但不含用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的氧化還原酶。(14)一種用於測定全血中的1，5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片，其包括具有用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的工作電極和對電極的電極，所述用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的工作電極包含用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的氧化還原酶和氧化還原介體。(15)上面(14)的測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片，其還包括用於消除或轉化葡萄糖和/或其衍生物的試劑。(16)上面(14)或(15)的測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片，其包括差分電極，所述差分電極包括具有用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的工作電極、用於測定空白的工作電極和對電極的電極，所述用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的工作電極包含用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的氧化還原酶和氧化還原介體，所述用於測定空白的工作電極包含氧化還原介體但不含用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的氧化還原酶。(17)—種用於測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇的試劑盒，其包括上面(14)至(16)中任一項所述的傳感器晶片、用於採血的穿刺裝置和1,5-脫水葡萄糖醇的測定裝置。(18)上面(17)的測定全血中的1，5-脫水葡萄糖醇的試劑盒，其還包括用於消除或轉化葡萄糖和/或其衍生物的試劑。本發明的有益效果根據本發明，由於可以使用全血作為樣本電化學測定1，5-脫水葡萄糖醇，並且血細胞不需要分離，因此測定變得簡單而無需使用離心機等，這使得測定可由患者自己在家中進行。實施本發明的最佳方式下面，將詳細解釋本發明。10本發明是電化學測定血液中受到葡萄糖幹擾的1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其特徵在於，在測定血液中的1,5-脫水葡萄糖醇時，使用全血作為樣本而無需分離血細胞。具體地，本發明的測定1，5-脫水葡萄糖醇的方法的特徵在於，不分離血細胞，從原樣全血中消除或轉化葡萄糖和/或其衍生物，然後不分離血細胞而讓用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的酶發揮作用，以電化學測定1,5-脫水葡萄糖醇。如上所述，由於用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的酶也對作為底物的葡萄糖起作用，因此需要消除或轉化葡萄糖和/或其衍生物以防止葡萄糖的幹擾。在本發明的測定方法中，消除或轉化葡萄糖和/或其衍生物的步驟和測定1,5-脫水葡萄糖醇的步驟可以連續進行或與其間的其它步驟依次進行。本發明使用的全血是處於採集狀態的血液，其血細胞未分離，並且可以包含用於採血的採血管中所含的抗凝劑、糖解抑制劑等，例如肝素、氟化鈉和一碘乙酸。當使用保存的血液時，優選通過含有氟化鈉和肝素的採血管採血。另外，本發明的全血還包括不使用採血管等，而通過用於自測血糖水平的穿刺裝置等採集的血液。採血部位沒有特別限制，包括指尖以及前臂外側、腹壁或上臂外側。採血量為例如50或更少，優選為0.1-30)iL。更優選地，3-20pL就足夠了。將葡萄糖和/或其衍生物消除或轉化為不幹擾本發明測定的物質的步驟沒有特別限制，只要它不影響血液中目標1,5-脫水葡萄糖醇的測定即可。其例子包括專利文獻1至9中所述的將葡萄糖和/或其衍生物消除或轉化為不幹擾測定的物質的方法。更優選使用酶的方法，其例子包括將葡萄糖酶促氧化或酶促磷酸化的方法。用酶消除或轉化全血中的葡萄糖已經取得進展，而沒有與上面提及的預期相反的問題，這使得能夠如後面描述的實施例所示，測定全血中的1，5-脫水葡萄糖醇。用於酶促氧化葡萄糖的方法的例子包括.，包括用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖的方法、包括在輔酶煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)的存在下，用葡萄糖脫氫酶氧化葡萄糖的方法。用於酶促磷酸化葡萄糖的方法的例子包括包括用己糖激酶或葡萄糖激酶將葡萄糖磷酸化以轉化成葡萄糖-6-磷酸的方法。根據用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的酶的類型，通過葡萄糖磷酸化產生的葡萄糖-6-磷酸可能需要進一步轉化。在這種情況下，其例子包括包括在輔酶NAD+或NADP+的存在下用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶將葡萄糖氧化成葡糖酸內酯-6-磷酸的方法，包括在腺苷-5'-二磷酸(ADP)和腺苷-5'-三磷酸的存在下使己糖激酶、磷酸己糖異構酶和6-磷酸果糖激酶起使用以將葡萄糖轉化為果糖-l，6-二磷酸的方法，和包括在核苷二磷酸(NDP)或核苷三磷酸(NTP)的存在下使葡萄糖異構酶、果糖激酶和6-磷酸果糖激酶起作用，以將葡萄糖轉化為果糖-l，6-二磷酸的方法。最重要的是，更優選用己糖激酶或葡萄糖激酶將葡萄糖磷酸化的方法。例如，特別優選在鎂離子、ATB、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和丙酮酸激酶(PK)的存在下，通過使用己糖激酶或葡萄糖激酶的酶促環化方法，將葡萄糖磷酸化的方法。用於上述轉化的酶沒有特別限制，只要它們不需要1,5-脫水葡萄糖醇作為底物即可，其例子包括根據IUPAC-IUB命名法，歸類為葡萄糖氧化酶(EC1丄3.4)、、葡萄糖脫氫酶(EC1丄1.47、EC1丄1.118、EC1.1.1.119禾卩EC1.1.99.10)、己糖激酶(EC2.7丄1)、葡萄糖激酶(EC2.7丄2)、作為磷酸己糖異構酶的葡萄糖-6-磷酸酮醇異構酶(EC5.3丄9)、葡萄糖異構酶(EC5.3丄18)、果糖激酶(EC2.7丄4)和作為6-磷酸果糖激酶的磷酸己糖激酶(EC2.7丄ll)的酶。也可以使用市售品。使用NDP依賴性己糖激酶，特別是例如ADP依賴性己糖激酶作為己糖激酶沒有問題。另外，在包括用葡萄糖氧化酶和葡萄糖脫氫酶氧化葡萄糖的方法中，也可以使用葡糖酸內酯酶(EC3丄1.17)，將產生的葡糖酸-l,5-內酯完全轉化為葡糖酸，如果必要，可以組合使用變旋酶(EC5丄3.3)。在本發明的測定方法中，將葡萄糖和1,5-脫水葡萄糖醇兩者磷酸化的己糖激酶或葡萄糖激酶也可以用於包括將1,5-脫水葡萄糖醇轉化成1，5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸並使用對1，5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸起作用的酶測定的方法中。通過例如使轉化試劑和全血彼此接觸，進行將葡萄糖和/或其衍生物轉化成不幹擾本發明測定的物質。具體地，這些物質可以預先在容器中混合，或者可以將轉化試劑裝載到後面所述的傳感器晶片上。轉化試劑的例子包括由己糖激酶(HK)和/或葡萄糖激酶(GK)、丙酮酸激酶(PK)、腺苷-5'-三磷酸(ATP)、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、氯化鎂或硫酸鎂和氯化鉀組成的溶液和溶液的乾燥試劑。己糖激酶優選衍生自酵母，葡萄糖激酶優選衍生自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)。所述轉化試劑可以包含己糖激酶和葡萄糖激酶兩者或其中任何一種。己糖激酶和/或葡萄糖激酶在轉化試劑溶液中的濃度為1-500U/mL，優選為20-300U/mL。丙酮酸激酶在轉化試劑溶液中的濃度為1-500U/mL，優選為20-300U/mL。ATP的濃度為1-200mM，優選為10-80mM。磷酸烯醇丙酮酸的濃度為10-1500mM，優選為100-500mM。氯化鎂或硫酸鎂的濃度為1-200mM，優選為5-50mM。氯化鉀的濃度為1-200mM，優選為5-50mM。另外，向轉化試劑中添加對各幹擾物質起作用的酶如抗壞血酸氧化酶、尿酸氧化酶或膽紅素氧化酶有效防止除葡萄糖以外的其它幹擾13物質幹擾測定。例如，抗壞血酸氧化酶在轉化試劑溶液中的濃度為l隱1000U/mL，優選為5-500U/mL。下面將解釋使用酶電化學測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇的步驟。測定方法的例子包括包括用酶直接測定由氧化還原反應產生的過氧化氫的方法和使用作為參與氧化還原反應的電子傳遞媒介的氧化還原介體的方法。酶的例子包括氧化1，5-脫水葡萄糖醇的酶，更優選氧化還原酶。其例子包括根據IUPAC-IUB命名法，歸類為吡喃糖氧化酶(EC1丄3.10)、L-山梨糖氧化酶(EC1丄3.11)、L-山梨糖脫氫酶(EC1丄99.12)、1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶(ECl丄99.13)的酶。氧化還原酶的例子包括專利文獻12所述由擔子菌類真菌(Basidiomycetousfungi)No.52(國際專利生物保藏機構，日本產業技術綜合研究所保藏編號FERMP-10106)產生的吡喃糖氧化酶，專利文獻7所述的鈍頭多孔菌(Polyporusobtusus)ATCC26733等，專利文獻13所述由血紅色陀螺孔菌(Trametessanguinea)IF04923產生的L-山梨糖氧化酶、由氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)UV-10(國際專利生物保藏機構，日本產業技術綜合研究所保藏編號FERMP-8422)產生的L-山梨糖脫氫酶等，專利文獻11所述由假單孢菌sp.NK-85001(國際專利生物保藏機構，日本產業技術綜合研究所保藏編號BP-1037)產生的1，5-脫水葡萄糖醇脫氫酶等，專利文獻14所述由真菌如皮殼正青黴(Eupenicilliumcrustaceum)IFO-8938產生的1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶等，專利文獻15所述由長枝木黴菌(Trichode腿longibrachiatum)KDK3003(國際專利生物保藏機構，日本產業技術綜合研究所保藏編號FERMBP-6458)產生的1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶等，專利文獻16所述由水生拉恩桿菌(Rahnellaaquatilis)474(國際專利生物保藏機構，日本產業技術綜合研究所保藏編號FERMP-16158)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)340(國際專利生物保藏機構，日本產業技術綜合研究所保藏編號FERMP-16157)和粘質沙雷菌(Serratiamarcescens)825(國際專利生物保藏機構，日本產業技術綜合研究所保藏編號FERMP-16159)產生的1，5-脫水葡萄糖醇脫氫酶等，可以無需要電子受體而使1,5-脫水葡萄糖醇脫氫的專利文獻6所述由土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)NT1130菌株(國際專利生物保藏機構，日本產業技術綜合研究所保藏編號FERMBP-5997)產生的1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶，專利文獻10所述由海黃嗜纖維菌(Cytophagamarinoflava)ATCC19326產生的D-葡糖苷-3-脫氫酶等，以及專利文獻17、18和12所述的酶。另外，也可以使用氧化1,5-脫水葡萄糖醇的其它市售氧化還原酶。其中，更優選吡喃糖氧化酶、L-山梨糖氧化酶和1，5-脫水葡萄糖醇脫氫酶。另外，在通過普通基因操縱技術識別並改進或修飾這些酶的基因後，則使用重組大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)等產生的酶也可以用於本發明的測定方法，只要它們是需要1，5-脫水葡萄糖醇作為底物的氧化還原酶即可。電化學測定方法的例子包括電流分析法(包括測定電流的方法)、電量分析法(包括測定電量的方法)、電位掃描法和循環伏安法。其中，更優選電流分析法和電量分析法。可以使用金、鉑、碳、鈀、銀或銀-氯化銀，在絕緣板上形成用於電化學測定方法的電極。絕緣板材料的例子包括塑料如聚對苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯和聚碳酸乙烯酯以及玻璃，更優選聚對苯二甲酸乙二酯。可以通過絲網印刷、真空沉積、濺射等在該板上形成電極。在這些方法中，更優選絲網印刷。具體地，優選的是，通過將導電碳墨或銀-氯化銀絲網印刷到由聚對苯二甲酸乙二酯製成的板上，並在100-15(TC淬火所述板，從而形成電極。作為用於本發明的電化學測定1,5-脫水葡萄糖醇的電極，可以使用形成工作電極、對電極和參比電極的三電極或者形成工作電極和對電極的雙電極。通常，在使用三電極測定時，將電位施加到工作電極上，使用參比電極作為參照，並測定在工作電極和對電極之間流動的電流。在使用雙電極測定時，使用對電極作為參比電極，將預定的電位施加到工作電極上，使用對電極作為參照，並測定在工作電極和對電極之間流動的電流。各種方法均可用於電化學測定，本發明的例子包括包括使用過氧化氫電極直接測定所產生的過氧化氫的測定方法和使用作為參與氧化還原反應的電子傳遞媒介的氧化還原介體的測定方法。氧化還原介體的例子包括氧化介體和還原介體，更優選氧化介體。其中，更優選鋨絡合物、醌化合物、二茂鐵化合物、吩噻嗪化合物、吩嗯嗪化合物、吩嗪化合物、靛酚化合物、二苯胺化合物、酚化合物等。鋨絡合物的例子包括[Os(III)(聯吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2及其聚合物。醌化合物的例子包括苯醌、2-甲基苯醌、2,6-二甲基苯醌、2,6-二氯苯醌、2,5-二羥基苯醌、2-羥基-l,4-萘醌、2-甲基-l，4-萘醌、2,3-二甲氧基-5-甲基-l,4-苯醌、吡咯並喹啉醌(PQQ)和泛醌。二茂鐵化合物的例子包括二茂鐵基PEG、二茂鐵基TMA、N,N-二甲氨基甲基二茂鐵和二茂鐵甲醇。吩噻嗪化合物的例子包括硫堇、亞甲藍、亞甲基綠、lO-(羧甲基氨基羰基)-3，7'-雙(二甲氨基)-吩噻嗪鈉鹽、甲苯胺藍O、天青I、天青Z、天青A、新亞甲藍和苯甲醯基無色亞甲藍。吩嗯嗪化合物的例子包括麥爾多拉藍。吩嗪化合物的例子包括吩嗪硫酸二甲酯、1-甲氧基吩嗪硫酸二甲酯、番紅和酚番紅。靛酚化合物的例子包括2-二氯苯酚-靛酚(DCIP)。二苯胺化合物的例子包括4,4'-雙(二甲氨基)二苯胺、N-(羧甲基氨基羰基)-4,4'-雙(二甲氨基)-二苯胺鈉鹽、N-甲基-N-苯基-l，4-苯二胺鹽酸鹽和N-甲基-N-(3-甲氧基苯基)-l,4-苯二胺鹽酸鹽。酚化合物的例子包括對氨基苯酚。16此外，可以用於本發明的介體的例子包括鐵菁化合物(鐵氰化鉀等)、釕絡合物或其聚合物、聯吡啶化合物(甲基紫精等)、三苯基甲烷化合物(孔雀綠、TPM-PS等)、苯並噻唑啉化合物(2-亞肼基-2,3-二氫-3-甲基-6-苯並噻唑、其磺酸鹽等)、菁化合物(掊花青、酞菁、藻青素等)、偶氮化合物(品紅J-3GL、黃C-Y9、黑C-BK4等)、聯吡啶基偶氮化合物(5-Br-PSAA、5-Br-PAPS、TAMSMB等)、苯胺及其衍生物(DAPS、HALPS、ADPS、ALPS、TOOS、ALOS等)、聚苯胺及其衍生物、酚化合物(對氨基苯酚等)、苯二胺化合物(Baliamine藍B、2,3，5,6-四甲基-對苯二胺等)、羅丹明化合物(羅丹明B等)、咕噸化合物(派洛寧Y、派洛寧B、螢光素鈉等)、異咯嗪化合物(核黃素、FAD等)、靛化合物(靛藍三磺酸、靛藍胭脂紅等)、菲咯啉化合物(浴銅靈磺酸鈉、紅菲繞啉磺酸鈉等)、磺酞化合物(甲基百裡酚藍等)、聯苯胺化合物(TMBZ、TMBZ.PS、DAB、茴香胺藍等)、四唑鑥化合物(WST-1、MTT、Nitro-TB、XTT等)、細胞色素C、光色素、鐵氧化還原蛋白、EDTA、NAD和NADP。在本發明的1,5-脫水葡萄糖醇的電化學測定中，將由電極負載的化合物如上面提到的酶和氧化還原介體溶於淨化水或合適的緩衝溶液中作為電極試劑並塗布到電極上作為電極試劑溶液。電極試劑中所含的上述氧化還原介體的濃度為例如大約0.01]aM至lM，優選為O.lfiM至200mM，作為在通過溶於淨化水或合適的緩衝溶液中獲得的要塗布到電極上的電極試劑溶液中的濃度。上述酶的濃度為例如大約0.1-5000U/mL，優選為1-2000U/mL,作為在通過溶於淨化水或合適的緩衝溶液中獲得的要塗布到電極上的電極試劑溶液中的濃度。作為緩衝溶液，可以使用普通生化反應所用的緩衝液，其例子包括2-嗎啉基乙磺酸(MES)緩衝液、2-[4-(2-羥乙基)-l-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)緩衝液、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)緩衝液、三g甲基氨基甲烷緩衝液(trisbuffer)和磷酸鹽緩衝液。pH為3至10，優選為5至9。緩衝溶液的濃度為1mM至1M，優選為5-500mM。所述電極試劑溶液優選包含低分子量化合物如磺基苯甲酸、糖和糖醇，蛋白質如白蛋白，或親水大分子化合物如羧甲基纖維素、聚乙二醇、聚乙烯醇和聚乙烯基吡咯烷酮作為穩定劑，所述穩定劑提高酶和氧化還原介體的穩定性，導致在長時期內穩定測定1,5-脫水葡萄糖醇和以有利的精確度測定血液中的1，5-脫水葡萄糖醇。磺基苯甲酸的優選例子包括2-磺基苯甲酸和3-磺基苯甲酸。當低分子量化合物如磺基苯甲酸被用作穩定劑時，其濃度為大約0.1-500mM，優選為大約1-100mM，作為在要塗布到電極上的電極試劑溶液中的濃度。當親水大分子化合物如白蛋白被用作穩定劑時，其濃度為例如大約0.01-20%，優選為大約0.02-10%，作為在要塗布到電極上的電極試劑溶液中的濃度。優選使上面提到的電極負載上面提到的電極試劑。這可以通過已知方法實現。例如，將預定量的上述電極試劑通過點塗、浸漬或旋塗塗布到電極上，並乾燥。另外，除了這樣的物理吸附之外，可以將上面提到的電極試劑化學結合到電極上。為了負載到電極上，將上面提到的穩定劑添加到上面提到的電極試劑溶液中，然後塗布並乾燥，或者層壓到負載著酶等的層上。下面將解釋差分電極。差分電極是例如這樣的電極，它具有負載氧化還原酶和氧化還原介體試劑的工作電極(例如用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的工作電極)、負載氧化還原介體試劑但不含氧化還原酶的工作電極(例如用於測定空白的電極)和對電極，使用負載氧化還原酶和氧化還原介體試劑的工作電極及負載氧化還原介體試劑但不含氧化還原酶的工作電極，同時測定包含涉及氧化還原介體等的幹擾物質的樣本，並通過減去幹擾所產生的信號部分，除去幹擾物質的影響，所述差分電極的結構不受限制，只要起到這種作用即可。其例子包括在後面描述的實施例中的差分電18極，它具有用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的工作電極、用於測定空白的工作電極和對電極，所述用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的工作電極包含用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的氧化還原酶和氧化還原介體，所述用於測定空白的工作電極包含氧化還原介體。這種使用差分電極的電化學測定方法被稱為差分法，以葡萄糖為目標的測定是已知的。在這種情況下，幹擾物質是尿酸和抗壞血酸。基於5500-33000(imol/L葡萄糖，尿酸的血液濃度為120-770pmol/L,抗壞血酸的血液濃度為1-210pmol/L。這些濃度遠遠低於葡萄糖的血液濃度。同時，血液中1，5-脫水葡萄糖醇的濃度為6-300(imol/L，這遠遠低於葡萄糖的濃度。在電化學測定血液中的1，5-脫水葡萄糖醇時，尿酸和抗壞血酸同樣是幹擾物質。然而，這些物質的濃度幾乎等於或超過1,5-脫水葡萄糖醇的濃度。也就是說，當幹擾物質的濃度明顯低於待測物質的濃度時所用的差分法是已知的，但到目前為止，沒有報導當幹擾物質的濃度等於或超過待測物質的濃度時所用的差分法。因此，差分法是否有效和即使當存在濃度等於或超過l,5-脫水葡萄糖醇(待測物質)的濃度的幹擾物質(尿酸、抗壞血酸)時是否能夠獲得正確的測定結果是未知的。本發明用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片由在絕緣板上形成的上述電極、要與測定裝置相連的接合部件、連接電極和接合部件的導線部件、另外用於使電極面積保持恆定以使導線部件絕緣的保護體(resist)(絕緣部件)等構成，還包括用於採集血液作為樣本的開孔、血液進入其中的空間、流體通道等。這種結構由膜材料如聚乙烯膜或聚醯亞胺膜、粘合劑如熔性粘合劑、纏繞劑(tapingagent)如雙側膠帶等形成。19也可以使用傳感器晶片測定1,5-脫水葡萄糖醇，在傳感器晶片中，電極不負載電極試劑，並將樣本和試劑預先混合併添加。然而，優選包括這樣的電極的傳感器晶片，所述電極具有用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的工作電極和對電極，所述用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的工作電極包含用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的氧化還原酶和氧化還原介體，更優選包括差分電極的傳感器晶片，所述差分電極具有用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的工作電極、用於測定空白的工作電極和對電極，所述用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的工作電極包含用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的氧化還原酶和氧化還原介體，所述用於測定空白的工作電極包含氧化還原介體但不含氧化還原酶。如果必要，所述對電極可以負載上面提到的電極試劑。另外，可以使用具有預處理部件的傳感器晶片，所述預處理部件包含實施將葡萄糖和/或其衍生物轉化成不幹擾測定的物質的步驟的試劑。本發明所用的傳感器晶片的一個例子的簡化圖示於圖1至3。本發明還包括用於測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇的試劑盒，所述試劑盒至少由上面提到的傳感器晶片、用於採血的穿刺裝置和1，5-脫水葡萄糖醇的測定裝置組成。所述穿刺裝置可以類似於血糖水平自測裝置上所附的穿刺裝置。該試劑盒還可以包括將葡萄糖和/或其衍生物轉化成不幹擾測定的物質的步驟中所用的試劑。另外，這種用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的試劑盒可以具有用於採集樣品的裝置、用於預處理的試劑、校正器等。用於採集樣品的裝置沒有特別限制，只要可以採集約幾十^L或更少的全血即可，並且可以類似於用於測定血細胞比容的毛細管。下面，將參考下列實施例和參考例更具體地解釋本發明。然而，這些實施例僅顯示本發明的一方面，並非限制本發明的範圍。實施例中使用通過已知方法獲得的酶或市售的酶。所有實施例及參考例9、10和11中所用的電化學檢測器是由東方技研株式會社(TohoGiken)製造的配有GPIBRS232C的8-CH多功能恆電位儀(Multipotentiostat)型號PS-08，參考例7和8中所用的電化學檢測器是由東方技研株式會社製造的配有函數生成器FG-02的8-CH多功能恆電位儀型號PS-08。附圖中的1,5AG指1，5-脫水葡萄糖醇。實施例11)葡萄糖轉化試劑在lO.OmMMES緩衝液中，溶解各組分，在使用1N氫氧化鈉水溶液將pH調整至lj7.0後的組成為:17.6mMMgCl2、17.6mMKC1、175.7mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、17.6mMATP、123U/mL丙酮酸激酶(PK)、75U/mL葡萄糖激酶、200U/mL抗壞血酸氧化酶、100mM氯化鈉、0.1。/。NaN3、0.1mMEDTA和0.06。/o牛血清白蛋白(BSA)，以製得葡萄糖轉化試劑。2)電極試劑溶液將23.6mM日本專利3713049號所述的鋨(III)絡合物([Os(m)(聯吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2)、930U/mL吡喃糖氧化酶(衍生自擔子菌類真菌No.52)和50mM3-磺基苯甲酸按該組成溶於淨化水中，製備電極試劑溶液。3)傳感器晶片將碳墨(產品名，CarbonPasteTU15ST:朝日化學研究所(AsahiChemicalResearchLaboratoryCo.,Ltd.))以10(im的厚度絲網印刷到由聚對苯二甲酸乙二酯製成的基盤上，並在150"C淬火40分鐘，以形成工作電極和導線部件以及對電極和導線部件。然後，將保護體油墨(產品名，CR18G-KF:朝日化學研究所)以20jim的厚度絲網印刷到除了電極部件和與測定裝置的結合處以外的部分上，並在13(TC淬火15分鐘。由此製備了圖1所示的電極11。電極11在樣本添加位置1上塗布4^L上面2)獲得的電極試劑溶液，並在5(TC乾燥13分鐘，製備傳感器晶片。4)建立校正曲線為了建立1,5-脫水葡萄糖醇的校正曲線，將通過將各20pL已知濃度的1,5-脫水葡萄糖醇製劑(在通過除了血細胞分離步驟之外的後述參考例l的步驟獲得的樣本中1，5-脫水葡萄糖醇的濃度為3.8、7.8、15.8、31.4和63.9(ig/mL)添加到血漿中獲得的5份樣本與10pL葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10pL反應混合物逐滴地塗布到電極11的樣本添加位置1上。80秒後，在IO秒內相對於對電極將0.15V施加到工作電極上，並用電化學檢測器(配有GPIBRS232C的8-CH多功能恆電位儀型號PS-08:東方技研株式會社)測定接下來5秒後的電流值。由用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片獲得的庫侖量與用於測定空白的傳感器晶片獲得的庫侖量之間的差值和1，5-脫水葡萄糖醇的濃度建立校正曲線。5)1,5-脫水葡萄糖醇測定步驟將各20尿酸水平幾乎等於上面4)獲得的樣本的尿酸水平或者測定樣本具有低尿酸水平的來自3名正常健康受試者的全血與10pL葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10反應混合物逐滴地塗布到電極11的樣本添加位置1上。80秒後，在10秒內相對於對電極將0.15V施加到工作電極上，並用電化學檢測器測定接下來5秒後的電流值。使用上面4)建立的校正曲線，獲得1,5-脫水葡萄糖醇在3份全血樣本中的量。結果示於表1。將4次測定的平均值用於建立校正曲線的樣本，並將1次測定的值用於所述樣本。22參考例1將來自實施例15)中的測定所用的3名正常健康受試者的相同全血樣本在3000rpm離心分離IO分鐘，並且按照下列參數，使用1,5-脫水葡萄糖醇測定試劑(Lana1,5AGAutoLiquid:日本化藥株式會社)和自動分析儀7150(日立製作所株式會社(Hitachi,Ltd.))測定上清液(血漿)中的1,5-脫水葡萄糖醇。結果示於表l。分析方法2點法讀取點24-50樣本體積8(iLLana1,5AGAutoLiquid預處理試劑(R1)240|aLLana1，5AGAutoLiquid發色試劑(R2)120jiE溫度37°C測定波長(副/主)700/546nm_[^i]_1，5-脫水葡萄糖醇濃度0ig/mL)參考例1實施例1全血樣本19.810.4全血樣本215.616.8全血樣本317.217.2當不分離血細胞而使葡萄糖轉化試劑對全血起作用以將葡萄糖轉化成不幹擾測定的物質並與電極試劑反應時，1，5-脫水葡萄糖醇在全血樣本中的測得值(實施例l)與通過參考例1的已知測定方法獲得的值非常一致(相關係數，0.9881)，表明可以通過本發明測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇。實施例2231)葡萄糖轉化試劑在lO.OmMMES緩衝液中，溶解各組分，在使用1N氫氧化鈉水溶液將pH調整到7.0後的組成為:17.6mMMgCl2、17.6mMKC1、175.7mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、17.6mMATP、123U/mL丙酮酸激酶(PK)、97U/mL己糖激酶和20U/mL抗壞血酸氧化酶溶解，以製得葡萄糖轉化試劑。2)電極試劑溶液(i)用於測定1,5-脫水葡萄糖醇將23.6mM鋨(III)絡合物([Os(III)(聯吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2)和465.2U/mL吡喃糖氧化酶(衍生自擔子菌類真菌No.52)按該組成溶於淨化水中，製備電極試劑溶液。(ii)用於測定空白將23.6mM鋨(III)絡合物([Os(III)(聯吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2)按該組成溶於淨化水中，製備電極試劑溶液。3)傳感器晶片製備按照與實施例1的3)相同的方式製得的兩個電極11，將各4pL上面2)中用於測定1,5-脫水葡萄糖醇或空白的電極試劑溶液塗布到各電極的樣本添加位置1上，並在50'C乾燥13分鐘，製備用於測定1,5-脫水葡萄糖醇和空白的傳感器晶片。4)建立校正曲線為了建立1,5-脫水葡萄糖醇的校正曲線，將各20pL通過將已知濃度的1，5-脫水葡萄糖醇製劑(在通過除了血細胞分離步驟之外的參考例1的步驟獲得的樣本中1,5-脫水葡萄糖醇的濃度為9.4、18.8、37.5、75.0和150.0^g/mL)添加到血漿中獲得的5份樣本與lOiuL葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10|liL反應混合物逐滴地塗布到用於測定1,5-脫水葡萄糖醇和空白的各電極11的樣本添加位置1上。80秒後，在10秒內相對於對電極將0.15V施加到工24作電極上，並用電化學檢測器測定接下來5秒後的電流值。由用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片獲得的電流值與用於測定空白的傳感器晶片獲得的電流值之間的差值和1,5-脫水葡萄糖醇的濃度建立校正曲線。5)1,5-脫水葡萄糖醇的測定將各20^tL用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的來自6名正常健康受試者的全血與10nL葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10i^L反應混合物逐滴地塗布到用於測定1，5-脫水葡萄糖醇和空白的各電極11的樣本添加位置1上。80秒後，在10秒內相對於對電極將0.15V施加到工作電極上，並用電化學檢測器測定接下來5秒後的電流值。將用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片獲得的電流值與用於測定空白的傳感器晶片獲得的電流值之間的差值與校正曲線相比，獲得1,5-脫水葡萄糖醇在6份全血樣本中的量。結果示於表2。將4次測定的平均值用於建立校正曲線的樣本，並將1次測定的值用於所述樣本。參考例2通過與參考例1相同的方式，測定與實施例2的5)中所測相同的全血樣本中的1,5-脫水葡萄糖醇。結果示於表2。1,5-脫水葡萄糖醇濃度Oig/mL)參考例2實施例2全血樣本416.416.7全血樣本517.514.2全血樣本626.223.5全血樣本731.526.9全血樣本827.224.4全血樣本931.436.7當使葡萄糖轉化試劑對全血起作用以將葡萄糖轉化成不幹擾測定的物質，並不分離血細胞而使全血與電極試劑反應時，通過差分法獲得的1,5-脫水葡萄糖醇在全血中的測得值與通過參考例2的測定獲得的值非常相關(相關係數，0.8943)，表明可以通過本發明測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇。實施例31)葡萄糖轉化試劑使用實施例1的l)獲得的葡萄糖轉化試劑。2)電極試劑溶液(i)用於測定1，5-脫水葡萄糖醇將23.6mM鋨(III)絡合物([Os(III)(聯吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2)、930U/mL吡喃糖氧化酶(衍生自擔子菌類真菌No.52)和50mM3-磺基苯甲酸按該組成溶於淨化水中，製備電極試劑溶液。(ii)用於測定空白將23.6mM鋨(III)絡合物([Os(III)(聯吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2)和50mM3-磺基苯甲酸按該組成溶於淨化水中，製備電極試劑溶液。3)傳感器晶片通過與上面實施例2的3)相同的方式，製備用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片和用於測定空白的傳感器晶片。4)建立校正曲線為了建立1,5-脫水葡萄糖醇的校正曲線，將各20nL通過將已知濃度的1,5-脫水葡萄糖醇製劑(在通過除了血細胞分離步驟之外的參考例1的步驟獲得的樣本的1,5-脫水葡萄糖醇的濃度為9.5、19.6、39.6、78.5禾t]159.8嗎/mL)添加到血漿中獲得的5份樣本與10^L葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10pL反應混合26物逐滴地塗布到用於測定1,5-脫水葡萄糖醇和用於測定空白的各電極ll的樣本添加位置l上。80秒後，在IO秒內相對於對電極將0.15V施加到工作電極上，並用電化學檢測器測定接下來5秒後的電流值。由用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片獲得的電流值與用於測定空白的傳感器晶片獲得的電流值之間的差值和1,5-脫水葡萄糖醇的濃度建立校正曲線。5)1，5-脫水葡萄糖醇的測定將各20)iL用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的來自6名正常健康受試者的全血與10葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合，並使混合物靜置5分鐘。然後，將各10pL反應混合物逐滴地塗布到用於測定1,5-脫水葡萄糖醇和用於測定空白的電極11的樣本添加位置1上。80秒後，在10秒內相對於對電極將0.15V施加到工作電極上，並用電化學檢測器測定接下來5秒後的電流值。將用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片獲得的電流值與用於測定空白的傳感器晶片獲得的電流值之間的差值與校正曲線相比，獲得1,5-脫水葡萄糖醇在6份全血樣本中的量。結果示於表3。將4次測定的平均值用於建立校正曲線的樣本，並將l次測定的值用於所述樣本。參考例3通過與參考例1相同的方式，測定與實施例3的5)所測相同的全血樣本中的1,5-脫水葡萄糖醇。結果示於表3。[表3]_1,5-脫水葡萄糖醇濃度Oig/mL)參考例3實施例3全血樣本109.89.7全血樣本1115.615.5全血樣本1217.217.3全血樣本1324.625.1全血樣本1430.132.8全血樣本1529.030.8當使葡萄糖轉化試劑對全血起作用以將葡萄糖轉化成不幹擾測定的物質，並不分離血細胞而使全血與電極試劑反應時，通過差分法(實施例3)測得的1，5-脫水葡萄糖醇在全血中的值與通過參考例3的已知測定方法測得的值非常相關(相關係數，0.9982)，表明可以通過本發明測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇。另外，結果清楚地顯示比上面實施例2(相關係數，0.8943)更好的相關性。也就是說，已經證實通過組合使用穩定劑和差分法，以較好的精確度測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇。實施例41)葡萄糖轉化試劑使用實施例1的l)的葡萄糖轉化試劑。2)電極試劑溶液(i)用於測定1,5-脫水葡萄糖醇將11.8mM鋨(III)絡合物([Os(m)(聯吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2)和111.0U/mL1，5-脫水葡萄糖醇脫氫酶(衍生自假單孢菌sp.NK-85001)按該組成溶於淨化水中，製備電極試劑溶液。(ii)用於測定空白為了製備電極試劑溶液，將組分溶於淨化水中，使得組成應該為11.8mM鋨(III)絡合物([Os(m)(聯吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2)。3)傳感器晶片製備按照與實施例1的3)相同的方式製得的兩個電極11，將各4^tL上面2)獲得的用於測定1,5-脫水葡萄糖醇和用於測定空白的電極試劑溶液塗布到各電極的樣本添加位置1上，並在5(TC乾燥8分鐘，製備用於測定1,5-脫水葡萄糖醇和用於測定空白的傳感器晶片。4)建立校正曲線為了建立1,5-脫水葡萄糖醇的校正曲線，將各20pL通過將已知濃度的1，5-脫水葡萄糖醇製劑(在通過除了血細胞分離步驟之外的參考例1的步驟獲得的樣本中1，5-脫水葡萄糖醇的濃度為24.2、49.3和98.8嗎/mL)添加到血漿中獲得的3份樣本與10pL葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10)liL反應混合物逐滴地塗布到用於測定1,5-脫水葡萄糖醇和用於測定空白的各電極11的樣本添加位置l上。80秒後，在IO秒內相對於對電極將0.15V施加到工作電極上，並用電化學檢測器測定接下來5秒後的電流值。由用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片獲得的電流值與用於測定空白的傳感器晶片獲得的電流值之間的差值和1,5-脫水葡萄糖醇的濃度建立校正曲線。5)1，5-脫水葡萄糖醇的測定步驟將各20(LiL用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的來自4名正常健康受試者的全血與10pL葡萄糖轉化試劑在E卯endorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10)LiL反應混合物逐滴地塗布到用於測定1,5-脫水葡萄糖醇和用於測定空白的各電極11的樣本添加位置1上。80秒後，在10秒內相對於對電極將0.15V施加到工作電極上，並用電化學檢測器測定接下來5秒後的電流值。將用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片獲得的電流值和用於測定空白的傳感器晶片獲得的電流值之間的差值與校正曲線相比，獲得1,5-脫水葡萄糖醇在4份全血樣本中的量。結果示於表4。將4次測定的平均值用於建立校正曲線的樣本，並將l次測定的值用於所述樣本。參考例4通過參考例1的步驟，測定與實施例4所測相同的全血樣本中的1，5-脫水葡萄糖醇。結果示於表4。_1，5-脫水葡萄糖醇濃度Lig/mL)參考例4實施例4全血樣本169.410.0全血樣本1714.013.8全血樣本1827.826.2全血樣本1932.732.6當不分離血細胞而使葡萄糖轉化試劑對全血起作用以將葡萄糖轉化成不幹擾測定的物質並與包含1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶的電極試劑反應時，通過差分法(實施例4)測得的1，5-脫水葡萄糖醇在全血中的值與參考例4測定的值非常相關(相關係數，0.9974)，表明可以通過本發明測定全血中的1，5-脫水葡萄糖醇。參考例51)葡萄糖轉化試劑將各組分添加到lO.OmMMES緩衝液中，在使用1N氫氧化鈉水溶液將pH調整到7.0後的組成為17.6mMMgCl2、17.6mMKC1、175.7mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、17.6mMATP、123U/mL丙酮酸激酶(PK)和97U/mL己糖激酶，以製得葡萄糖轉化試劑。2)電極試劑溶液為了製備具有兩種組成的電極試劑溶液，將11.8mM鋨(III)絡合30物([Os(III)(聯吡啶基)2(咪唑基)Cl]Cl2)、930U/mL吡喃糖氧化酶(衍生自擔子菌類真菌No.52)和50mM2-磺基苯甲酸(參考例5-l)或50mM3-磺基苯甲酸(參考例5-2)按該組成溶於淨化水中。指定未添加磺基苯甲酸的電極試劑溶液製備為參考例5-3。3)傳感器晶片通過與上面實施例1的3)相同的方式製備用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片。4)測定步驟在第0天(就在製備後)和在室溫和大約20%的溼度下貯存5天後使用上面3)製備的傳感器晶片，將各20fiL包含0(^g/mL和50fig/mL1,5-脫水葡萄糖醇的樣品與10pL葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10iaL反應混合物逐滴地塗布到各電極11的樣本添加位置1上。80秒後，在10秒內相對於對電極將0.15V施加到工作電極上，用電化學檢測器測定接下來5秒後的電流值。4次測定的平均值和標準偏差及變化率示於表5-1和5-2。1，5-脫水葡萄糖醇0嗎/mL第1天第5天變化率平均標準偏差平均標準偏差第5天/第1天(HA)(pA)參考例5-10.770.060.960.031.24參考例5-20.740.021.040.041.41參考例5-31.350.063.580.182.6631tableseeoriginaldocumentpage32在參考例5-1和5-2中，變化率(第5天的平均電流值/第1天的平均電流值)低於參考例5-3，顯示電流值隨時間的上升受到了抑制。另外，標準偏差小，表明測定的可靠性，也就是說測定的精確度得到了改善。這些結果證實了將穩定劑添加到電極試劑中的效果，所述穩定劑可以用於電化學測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇。實施例51)葡萄糖轉化試劑使用實施例1的l)製備的葡萄糖轉化試劑。2)預處理步驟(用於1,5-脫水葡萄糖醇和空白的普通測定)為了建立1，5-脫水葡萄糖醇的校正曲線，將各10^L通過將已知濃度的1,5-脫水葡萄糖醇製劑(在通過除了血細胞分離步驟之外的參考例1的步驟獲得的樣本中1,5-脫水葡萄糖醇的濃度為3.8、7.8、15.8和31.4pg/mL)添加到血漿中獲得的4份樣本或4份人全血樣本與10]aL葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。3)電極測定前的步驟(i)1,5-脫水葡萄糖醇測定步驟向經過上述預處理步驟後的溶液中連續添加5)iL其中溶解了22.0mM2,6-二甲基苯醌的100mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)和5)aL其中溶解了200U/mL吡喃糖氧化酶(衍生自擔子菌類真菌No.52)的100mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)，混合，並靜置5分鐘。(ii)空白測定步驟向經過上述預處理步驟後的溶液中連續添加5^L其中溶解了22.0mM2，6-二甲基苯醌的100mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)和5100mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)，混合，並靜置5分鐘。4)使用傳感器晶片的測定步驟將碳墨(產品名，CarbonPasteTU15ST:朝日化學研究所)以10fim的厚度絲網印刷到由聚對苯二甲酸乙二酯製成的基盤上，作為工作電極和導線部件、對電極和導線部件以及參比電極和導線部件，並在150t:淬火40分鐘。然後，將保護體油墨(產品名，CR18G-KF:朝日化學研究所)以20pm的厚度絲網印刷到除了電極部件與測定裝置之間的接合部件以外的部分，並在13(TC淬火15分鐘，製備圖2所示的電極12。將各15^L上面3)獲得的反應混合物逐滴地塗布到電極12的樣本添加位置1上，使用參比電極作為參照，在IO秒內施加0.5V，在5秒後，用電化學檢測器測定用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片和用於測定空白的傳感器晶片的電流值。5)1,5-脫水葡萄糖醇的量的計算從使用用於建立1,5-脫水葡萄糖醇校正曲線的樣本，通過上述步驟測定1，5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片獲得的電流值中減去用於測定空白的傳感器晶片獲得的電流值，由所得的電流值和1,5-脫水葡萄糖醇的濃度建立校正曲線。對於4份人全血樣本，從用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片獲得的電流值中減去用於測定空白的傳感器晶片獲得的電流值，同樣將所得的電流值與校正曲線相比，獲得全血中的1，5-脫水葡萄糖醇的33量。結果示於表6。將4次測定的平均值用於建立校正曲線的樣本和所述樣本兩者。參考例6通過與參考例1相同的方式，測定與實施例5所測相同的全血樣本中的1,5-脫水葡萄糖醇。結果示於表6。__1,5-脫水葡萄糖醇濃度0ag/mL)參考例6實施例5全血樣本2016.717.0全血樣本2129.828.0全血樣本2228.928.6全血樣本2331.731.2當不分離血細胞而使葡萄糖轉化試劑對全血起作用以將葡萄糖轉化成不幹擾測定的物質並與未負載到電極上的電極試劑反應時，1，5-脫水葡萄糖醇在全血中的測得值(實施例5)與通過參考例6的已知測定方法測得的值非常一致(相關係數，0.9941)，表明可以通過本發明測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇。參考例7根據DenkiKagakuVol.63,No.10,p.906-913(1995)所述用於評價酶和介體的反應速度的方法，檢查上述衍生自擔子菌類真菌No.52的吡喃糖氧化酶和表7所列的氧化還原介體與1，5-脫水葡萄糖醇的反應。將碳墨(產品名，CarbonPasteTU15ST:朝日化學研究所)以10|im的厚度絲網印刷到由聚對苯二甲酸乙二酯製成的基盤上，作為工作電極和導線部件以及對電極和導線部件，將銀-氯化銀油墨(產品名，ElectrodagPE-409:埃奇森公司(Acheson))以10[im的厚度絲網印刷作為參比電極和導線部件，並將它們在15(TC淬火40分鐘。然後，將保護體油墨(產品名，CR18G-KF:朝日化學研究所)以20(am的厚度絲網印刷到除了電極部件與測定裝置之間的接合部件以外的部分，並在130X:淬火15分鐘，製備圖3所示的電極13。使用電化學檢測器(配有函數生成器FG-02的8-CH多功能恆電位儀型號PS-08:東方技研株式會社)進行電化學測定。將10nL包含20U/mL吡喃糖氧化酶和60pM表7所列的氧化還原介體的水溶液放到電極13上，電極13在樣本添加位置1處與電化學檢測器相連，使用電極13的參比電極作為參照，以1mV/秒從-0.5V至+lV掃描電位，並通過循環伏安法測定氧化電流值Id。然後，將IO包含20U/mL吡喃糖氧化酶、底物(500嗎/mL1,5-脫水葡萄糖醇)禾口60pM表7所列的氧化還原介體的水溶液放到電極13的樣本添加位置1上，使用電極13的參比電極作為參照，以1mV/秒從-0.5V至+lV掃描電位，並通過循環伏安法測定催化電流值Ik。通過將催化電流值Ik除以只存在氧化還原介體時的氧化電流值Id獲得的值Ik/Id，比較氧化還原介體與酶的反應速度。各氧化還原介體的Ik/Id結果示於表7。氨基-2,6-二甲基苯基)甲垸1.5雙(4-[N-3'-磺基-正丙基-N-乙基]氨基-2,6-二甲基苯基〉甲烷1.0對氨基苯酚3.5N-。-磺丙基)-3,3',5,5'-四甲基聯苯胺鈉鹽1.5*Nitro-TB:3,3'-[3,3'-二甲氧基-(1-1'-聯苯)-4,4'-基]-雙[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鐿氯化物]表7顯示吡喃糖氧化酶與各種氧化還原介體如鋨絡合物、二茂鐵化合物、醌化合物、吩噻嗪化合物、吩嗎嗪化合物、吩嗪化合物、二苯胺化合物、靛酚化合物和酚化合物快速反應。這些結果表明，通過使用這些氧化還原介體和吡喃糖氧化酶的方法，例如實施例1至3的方法，可以電化學測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇。參考例8通過與參考例7相同的方式，檢査上述1,5-脫水葡萄糖醇與表8所列的氧化還原介體的反應。36通過與參考例7相同的方式製備電極13。將10pL包含20U/mL1，5-脫水葡萄糖醇脫氫酶(衍生自假單孢菌sp.NK-85001)和60pM表8所列的氧化還原介體的水溶液放到電極13上，電極13在樣本添加位置1處與電化學檢測器相連，使用電極13的參比電極作為參照，以lmV/秒從-0.5V至+lV掃描電位，並通過循環伏安法測定氧化電流值Id。然後，將10pL包含20U/mL1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶、底物(500(ig/mL1,5-脫水葡萄糖醇)和60pM表8所列的氧化還原介體的水溶液放到電極13的樣本添加位置1上，使用電極13的參比電極作為參照，以1mV/秒從-0.5V至+lV掃描電位，並通過循環伏安法測定催化電流值Ik。通過將催化電流值Ik除以只含氧化還原介體而不含底物時的氧化電流值Id獲得的值Ik/Id，比較氧化還原介體與酶的反應速度。各氧化還原介體獲得的Ik/Id結果示於表8。tableseeoriginaldocumentpage37天青c25.4新亞甲藍4.3l-甲氧基-5-甲基吩嗪甲基硫酸鹽1.62-二氯苯酚-靛酚鈉鹽二水合物10.34,4'-雙(二甲氨基)二苯胺3.6N-甲基-N-(3-甲氧基苯基)-l，4-苯二胺鹽酸鹽1.4N-甲基-N-苯基-l,4-苯二胺鹽酸鹽2.2雙(4-[N-3'-磺基-正丙基-N-正丁基]氨基-2,6-二甲基苯基》甲垸1.3對氨基苯酚3.2N-(3-磺丙基)-3,3',5,5'-四甲基聯苯胺鈉鹽2.2孔雀綠2.1表8顯示1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶與各種氧化還原介體如鋨絡合物、二茂鐵化合物、醌化合物、吩噻嗪化合物、吩嗯嗪化合物、吩嗪化合物、二苯胺化合物、靛酚化合物和酚化合物快速反應。這些結果表明，通過使用這些氧化還原介體和1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶的方法，例如實施例4的方法，可以電化學測定全血中的1，5-脫水葡萄糖醇。參考例91)葡萄糖轉化試劑將各組分添加到50mMMES緩衝液中，在使用1N氫氧化鈉水溶液將pH調整到7.0後的組成為14.8mMMgCl2、99.2mMKC1、48mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、2mMATP、20U/mL丙酮酸激酶(PK)、16U/mL葡萄糖激酶、10U/mL抗壞血酸氧化酶、200mM氯化鈉、0.2mMEDTA.2Na和1.2g/LBSA，以製得葡萄糖轉化試劑。2)電極試劑溶液為了製備電極試劑溶液(a)、(b)和(c)，將下列物質按該組成溶於100mMMES緩衝液(pH7.0)中(a)0.54mM二茂鐵基PEG(同仁化學研究所株式會社(Dojindo38Laboratories));(b)6.25U/mL辣根過氧化酶(東洋紡織株式會社(ToyoboCo.,Ltd.));或者(c)50U/mL吡喃糖氧化物酶(衍生自擔子菌類真菌No.52)。3)傳感器晶片首先，將10|aL0.5%水性羧甲基纖維素塗布到參考例7製備的電極13的工作電極位置並在5(TC乾燥10分鐘，使電極表面親水。然後，將3pL上面2)獲得的電極試劑溶液(a)逐滴地塗布到親水部件中並乾燥，將3pL電極試劑溶液(b)逐滴地塗布到其上並乾燥，然後再逐滴地塗布3nL電極試劑溶液(c)並乾燥，製備傳感器晶片。4)建立校正曲線為了建立1,5-脫水葡萄糖醇的校正曲線，將各20^L通過將已知濃度的1,5-脫水葡萄糖醇製劑(在通過除了血細胞分離步驟之外的參考例1的步驟獲得的樣本中1，5-脫水葡萄糖醇的濃度為0、10和50pg/mL)添加到生理鹽水中獲得的3份樣本與10葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各15pL反應混合物逐滴地塗布到3)的傳感器晶片的電極13的樣本添加位置1上並反應5分鐘，然後使用參比電極(銀-氯化銀)作為參照，施加0V，並用電化學檢測器測定5秒後的電流值。由電流值和1,5-脫水葡萄糖醇的濃度建立校正曲線，如圖4所示。在圖中，1,5AG指1,5-脫水葡萄糖醇。獲得的校正曲線顯示具有有利的濃度依賴性的校正曲線。這些結果表明，通過使用二茂鐵基PEG和吡喃糖氧化酶的方法，例如實施例1至3的方法，可以電化學測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇。參考例101)葡萄糖轉化試劑使用實施例1的l)的葡萄糖轉化試劑。392)電極試劑溶液將具有表9中的濃度的氧化還原介體和具有表9中的濃度的1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶(衍生自假單孢菌sp.NK-85001)按各自的組成溶於淨化水中，製備電極試劑溶液。3)傳感器晶片將2上面2)獲得的電極試劑溶液塗布到參考例7製備的電極13的工作電極上並在5(TC乾燥5分鐘，製備傳感器晶片。4)建立校正曲線為了建立1,5-脫水葡萄糖醇的校正曲線，將各10(iL通過將已知濃度的1，5-脫水葡萄糖醇製劑(在通過除了血細胞分離步驟之外的參考例1的步驟獲得的樣本中1,5-脫水葡萄糖醇的濃度為0、2.5、11.9、24.2和49.3嗎/mL)添加到0.38%檸檬酸鈉溶液中獲得的5份樣本與5葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10)aL反應混合物逐滴地塗布到電極13的樣本添加位置1上，使用參比電極(銀-氯化銀)作為參照，施加表9所列的各電位，用電化學檢測器測定5秒後的電流值，並由電流值和1,5-脫水葡萄糖醇的濃度建立校正曲線。這些校正曲線示於圖5至13。tableseeoriginaldocumentpage407號4,4'-雙(二甲氨基)二苯胺755008號2-二氯苯酚-靛酚鈉鹽二水合物75500.19號l-甲氧基-5-甲基吩嗪甲基硫酸鹽150500*AGDH:1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶獲得的校正曲線均為濃度依賴性的平滑校正曲線。這些結果表明，通過使用這些介體和1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶的電流分析法，可以電化學測定全血中的1，5-脫水葡萄糖醇。參考例111)葡萄糖轉化試劑使用實施例1的l)中獲得的葡萄糖轉化試劑。2)電極試劑溶液將具有表10所列濃度的氧化還原介體和具有表10所列濃度的1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶(衍生自假單孢菌sp.NK-85001)按各自的組成溶於淨化水中，製備電極試劑溶液。3)傳感器晶片將2)iL上面2)獲得的電極試劑溶液塗布到參考例7製備的電極13的工作電極上並在5(TC乾燥5分鐘，製備傳感器晶片。4)建立校正曲線為了建立1,5-脫水葡萄糖醇的校正曲線，將各10iaL通過將已知濃度的1,5-脫水葡萄糖醇製劑(在通過除了血細胞分離步驟之外的參考例1的步驟獲得的樣本中1,5-脫水葡萄糖醇的濃度為0、2.5、5.0、11.9、24.2和49.3pg/mL)添加到0.38%檸檬酸鈉溶液中獲得的6份樣本與541pL葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10pL反應混合物逐滴地塗布到電極13的樣本添加位置1上，使用參比電極(銀-氯化銀)作為參照，在IO秒內施加表10中的各第一電位，然後使用參比電極(銀-氯化銀)作為參照，在no秒內施加第二電位。使用用於電量分析的電化學檢測器，測定從開始施加第二電位起100秒的庫侖量，並由庫侖量和1,5-脫水葡萄糖醇的濃度建立校正曲線。校正曲線示於圖14至27。tableseeoriginaldocumentpage43獲得的校正曲線均為濃度依賴性的平滑校正曲線。這些結果表明，通過使用這些介體和1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶的電量分析法，可以電化學測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇。實施例61)葡萄糖轉化試劑使用實施例1的l)中獲得的葡萄糖轉化試劑。2)電極試劑溶液將120硫堇乙酸鹽(西格瑪-奧德裡奇日本公司(Sigma-AldrichJapanK.K.))和40U/mL1，5-脫水葡萄糖醇脫氫酶(衍生自假單孢菌sp.NK-85001)按該組成溶於淨化水中，製備電極試劑溶液。3)傳感器晶片將2|iL上面2)獲得的電極試劑溶液塗布到參考例7製備的電極13的工作電極上並在50。C乾燥5分鐘，製備傳感器晶片。4)建立校正曲線為了建立1,5-脫水葡萄糖醇的校正曲線，將各10pL通過將已知濃度的1，5-脫水葡萄糖醇製劑(在通過除了血細胞分離步驟之外的參考例1的步驟獲得的樣本中1,5-脫水葡萄糖醇的濃度為0、2.5、5.0、11.9、24.2、49.3和98.8嗎/mL)添加到0.38%檸檬酸鈉溶液中獲得的7份樣本與5葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10kiL反應混合物逐滴地塗布到電極13的樣本添加位置1上，使用參比電極(銀-氯化銀)作為參照，在IO秒內施加-O.IV，然後在110秒內施加0V。使用電化學檢測器測定從開始施加0V起IOO秒的庫侖量，並由庫侖量和1，5-脫水葡萄糖醇的濃度建立校正曲線。顯示有利線性的校正曲線示於圖28。5)1，5-脫水葡萄糖醇測定步驟44將各10pL來自用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的7名受試者的人全血樣本和5nL葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10^L反應混合物逐滴地塗布到電極13的樣本添加位置1上，使用參比電極(銀-氯化銀)作為參照，在10秒內施加-0.1V，然後在110秒內施加0V。使用電化學檢測器測定從開始施加0V起100秒的庫侖量並與校正曲線相比，獲得1，5-脫水葡萄糖醇在7份全血樣本中的量。結果示於表ll。結果是4次測定的平均值。參考例12為了比較，通過參考例l的步驟，測定與實施例6的5)所測相同的全血樣本中的1,5-脫水葡萄糖醇。結果示於表ll。_[表11]_1,5-脫水葡萄糖醇濃度(jig/mL)tableseeoriginaldocumentpage45當不分離血細胞而使葡萄糖轉化試劑對全血起作用以將葡萄糖轉化成不幹擾測定的物質並與包含硫堇乙酸鹽的電極試劑反應時，1，5-脫水葡萄糖醇在全血中的測得值(實施例6)與在參考例12中通過已知測定方法測定的值非常一致(相關係數，0.9771)，表明可以通過本發明電化學測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇。實施例71)葡萄糖轉化試劑使用實施例1的l)中獲得的葡萄糖轉化試劑。2)電極試劑溶液(i)用於測定1，5-脫水葡萄糖醇將50pM亞甲藍(米山藥品工業株式會社(YoneyamaYakuhinKogyoCo.,Ltd.))和100U/mL1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶(衍生自假單孢菌sp.NK-85001)按該組成溶於淨化水中，製備電極試劑溶液。(ii)用於測定空白將50nM亞甲藍(米山藥品工業株式會社)按該組成溶於淨化水中，製備電極試劑溶液。3)傳感器晶片將2iaL上面2)獲得的用於測定1,5-脫水葡萄糖醇或用於測定空白的電極試劑溶液塗布到參考例7製備的圖3所示的兩個電極13的工作電極上並在5(TC乾燥5分鐘，製備用於測定1,5-脫水葡萄糖醇或用於測定空白的傳感器晶片。4)建立校正曲線為了建立1，5-脫水葡萄糖醇的校正曲線，將各20pL通過將已知濃度的1,5-脫水葡萄糖醇製劑(在通過除了血細胞分離步驟之外的參考例1的步驟獲得的樣本中1，5-脫水葡萄糖醇的濃度為0.6、2.8、5.0、10.0、24.7和50.2ng/mL)添加到已知實際上不含1,5-脫水葡萄糖醇的綿羊血清(日本生物檢驗實驗室株式會社(NipponBioTestLab.))中獲得的6份樣本與10|aL葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10(iL反應混合物逐滴地塗布到用於測定1,5-脫水葡萄糖醇或用於測定空白的傳感器晶片的電極13的樣本添加位置1上，使用各傳感器晶片的參比電極(銀-氯化銀)作為參照，在10秒內施加-0.2V，然後在llO秒內施加-O.lV。使用電化學檢測器測定從開始施加-0.1V起100秒的庫侖量。由從用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片的庫侖量中減去用於測定空白的傳感器晶片的庫侖量所獲得的庫侖量和1,5-脫水葡萄糖醇的濃度建立校正曲線。顯示有利線性的校正曲線示於圖29。5)1，5-脫水葡萄糖醇測定步驟將各20)iL來自實施例6的7名受試者的全血和10nL葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10pL反應混合物逐滴地塗布到用於測定1,5-脫水葡萄糖醇或用於測定空白的傳感器晶片的電極13的樣本添加位置1上，並使用各傳感器晶片的參比電極(銀-氯化銀)作為參照，在10秒內施加-0.2V，然後在110秒內施加-0.1V。使用電化學檢測器(配有GPIBRS232C的8-CH多功能恆電位儀型號PS-08:東方技研株式會社)測定從開始施加-O.lV起100秒的庫侖量，並將從用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片的庫侖量中減去用於測定空白的傳感器晶片的庫侖量所獲得的庫侖量與校正曲線相比，獲得1,5-脫水葡萄糖醇在7份全血樣本中的量。結果示於表12。結果是4次測定的平均值。參考例12由於實施例7所用的樣本是與實施例6相同的全血樣本，因此將實施例6的結果作為參考例12示於表12中。47[表12]_1,5-脫水葡萄糖醇濃度(pg/mL)參考例12實施例7全血樣本248.59.6全血樣本2515.714.5全血樣本2612.912.9全血樣本2722.723.7全血樣本2825.620.9全血樣本2926.823.9全血樣本3028.524.1當不分離血細胞而使葡萄糖轉化試劑對全血起作用以將葡萄糖轉化成不幹擾測定的物質並與包含亞甲藍的電極試劑反應時，1,5-脫水葡萄糖醇在全血中的測得值(實施例7)與在參考例12中通過已知測定方法測定的值非常一致(相關係數，0.9658)，表明可以通過本發明電化學測定全血中的1，5-脫水葡萄糖醇。實施例81)葡萄糖轉化試劑使用實施例1的l)中獲得的葡萄糖轉化試劑。2)電極試劑溶液將120^M硫堇乙酸鹽(西格瑪-奧德裡奇日本公司)和40U/mL1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶(衍生自假單孢菌sp.NK-85001)按該組成溶於淨化水中，製備電極試劑溶液。3)傳感器晶片將2pL上面2)獲得的電極試劑溶液塗布到參考例7製備的電極13的工作電極上並在5(TC乾燥5分鐘，製備傳感器晶片。4)建立校正曲線為了建立1，5-脫水葡萄糖醇的校正曲線，將各10(iL通過將已知濃度的1，5-脫水葡萄糖醇製劑(在通過除了血細胞分離步驟之外的參考例1的步驟獲得的樣本中1,5-脫水葡萄糖醇的濃度為0.6、2.8、5.0、10.0、24.7、50.2和103.9pg/mL)添加到綿羊血清(日本生物檢驗實驗室株式會社)中獲得的7份樣本與5pL葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10pL反應混合物逐滴地塗布到電極13的樣本添加位置l上，使用參比電極(銀-氯化銀)作為參照，施加-0.1V，使用電化學檢測器測定5秒後的電流值，並由電流值和1,5-脫水葡萄糖醇的濃度建立校正曲線。顯示有利線性的校正曲線示於圖30。5)1,5-脫水葡萄糖醇測定步驟將各10)LiL來自實施例6的7名受試者的全血和5pL葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10)iL反應混合物逐滴地塗布到電極13的樣本添加位置1上，使用參比電極(銀-氯化銀)作為參照，施加-0.1V，使用電化學檢測器測定5秒後的電流值，並將所得電流值與校正曲線相比，獲得1,5-脫水葡萄糖醇在7份全血樣本中的量。結果示於表13。結果是4次測定的平均值。參考例12由於實施例8所用的樣本是與實施例6相同的全血樣本，因此將實施例6的結果作為參考例12示於表13中。tableseeoriginaldocumentpage50當不分離血細胞而使葡萄糖轉化試劑對全血起作用以將葡萄糖轉化成不幹擾測定的物質並與包含硫堇乙酸鹽的電極試劑反應時，1,5-脫水葡萄糖醇在全血中的測得值(實施例8)與在參考例12中通過已知測定方法測定的值非常一致(相關係數，0.9700)，表明可以通過本發明電化學測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇。實施例91)葡萄糖轉化試劑使用實施例1的l)中獲得的葡萄糖轉化試劑。2)電極試劑溶液將120iiM硫堇乙酸鹽(西格瑪-奧德裡奇日本公司)和40U/mL1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶(衍生自假單孢菌sp.NK-85001)按該組成溶於淨化水中，製備電極試劑溶液。3)傳感器晶片將2pL上面2)獲得的電極試劑溶液塗布到參考例7製備的電極13的工作電極上，通過與參考例9相同的方式處理，並在5(TC乾燥5分鐘，製備傳感器晶片。4)建立校正曲線為了建立1，5-脫水葡萄糖醇的校正曲線，將各10pL通過將已知濃度的1,5-脫水葡萄糖醇製劑(在通過除了血細胞分離步驟之外的參考例1的步驟獲得的樣本中1,5-脫水葡萄糖醇的濃度為0、5.0、11.9和24.2嗎/mL)添加0.38%檸檬酸鈉溶液中獲得的4份樣本與5葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10反應混合物逐滴地塗布到電極13的樣本添加位置1上，使用參比電極(銀-氯化銀)作為參照，在110秒內施加0V，使用電化學檢測器測定從開始施加起100秒的庫侖量，並由傳感器晶片的庫侖量和1,5-脫水葡萄糖醇的濃度建立校正曲線。顯示有利線性的校正曲線示於圖31。5)1,5-脫水葡萄糖醇測定步驟將各10^L來自用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的6名受試者的人全血和5|iL葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10反應混合物逐滴地塗布到電極13的樣本添加位置1上，使用參比電極(銀-氯化銀)作為參照，在110秒內施加0V，使用電化學檢測器測定從開始施加起100秒的庫侖量，並將所得庫侖量與校正曲線相比，獲得1,5-脫水葡萄糖醇在6份全血樣本中的量。結果示於表14。結果是4次測定的平均值。參考例13為了比較，通過參考例1的步驟，測定與實施例9的5)所測相同的全血樣本中的1,5-脫水葡萄糖醇。結果示於表14。[表14]_1，5-脫水葡萄糖醇濃度^g/mL)參考例13實施例9全血樣本318.910.6全血樣本3216.215.2全血樣本3314.114.0全血樣本3423.321.3全血樣本3525.923.1全血樣本3632.124.7當不分離血細胞而使葡萄糖轉化試劑對全血起作用以將葡萄糖轉化成不幹擾測定的物質並與包含硫堇乙酸鹽的電極試劑反應時，1,5-脫水葡萄糖醇在全血中的測得值(實施例9)與在參考例13中通過已知測定方法測定的值非常一致(相關係數，0.9855)，表明可以通過本發明電化學測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇。實施例101)葡萄糖轉化試劑使用實施例1的l)中獲得的葡萄糖轉化試劑。2)電極試劑溶液(i)用於測定1,5-脫水葡萄糖醇將100pM亞甲藍(東京化成工業株式會社(TokyoKaseiKogyo))和50U/mL1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶(衍生自假單孢菌sp.NK-85001)按該組成溶於淨化水中，製備電極試劑溶液。(ii)用於測定空白將100|aM亞甲藍(東京化成工業株式會社)按該組成溶於淨化水中，製備電極試劑溶液。3)傳感器晶片製備參考例7製備和圖3所示的兩個電極13，將2pL上面2)獲得的用於測定1,5-脫水葡萄糖醇或用於測定空白的電極試劑溶液塗布到所述電極的工作電極上並在5(TC乾燥5分鐘，製備用於測定1，5-脫水葡萄糖醇或用於測定空白的傳感器晶片。4)建立校正曲線為了建立1,5-脫水葡萄糖醇的校正曲線，將各20^L通過將已知濃度的1,5-脫水葡萄糖醇製劑(在通過除了血細胞分離步驟之外的參考例1的步驟獲得的樣本中1,5-脫水葡萄糖醇的濃度為0.6、10.0、50.2和103.9pg/mL)添加到綿羊血清(NipponBioTestLab.)中獲得的4份樣本與10)iL葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10^L反應混合物逐滴地塗布到用於測定1，5-脫水葡萄糖醇或用於測定空白的傳感器晶片的電極13的樣本添加位置1上，使用傳感器晶片的參比電極(銀-氯化銀)作為參照，在llO秒施加-O.lV，並使用電化學檢測器測定從開始施加-0.1V起100秒的庫侖量。由用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片獲得的庫侖量與用於測定空白的傳感器晶片獲得的庫侖量之間的差值和1,5-脫水葡萄糖醇的濃度建立校正曲線。具有有利線性的校正曲線示於圖32。5)1，5-脫水葡萄糖醇測定步驟將各20^L來自實施例9的6名受試者的全血和10(iL葡萄糖轉化試劑在Eppendorf管中混合併靜置5分鐘。然後，將各10(iL反應混合物逐滴地塗布到用於測定1,5-脫水葡萄糖醇或用於測定空白的傳感器晶片的電極13的樣本添加位置1上，使用傳感器晶片的參比電極(銀-氯化銀)作為參照，在110秒內施加-0.1V，使用電化學檢測器測定從開始施加-0.1V起100秒的庫侖量，並將由從用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片的庫侖量中減去用於測定空白的傳感器晶片的庫侖量所獲得的庫侖量與校正曲線相比，獲得1，5-脫水葡萄糖醇在6份全血樣本中的量。結果示於表15。結果是4次測定的平均值。53參考例13由於實施例IO所用的樣本是與實施例9所用的相同的全血樣本，因此將實施例9的結果作為參考例13示於表15中。tableseeoriginaldocumentpage54當不分離血細胞而使葡萄糖轉化試劑對全血起作用以將葡萄糖轉化成不幹擾測定的物質並與包含亞甲藍的電極試劑反應時，通過差分法測定的1，5-脫水葡萄糖醇在全血中的測得值(實施例IO)與參考例13中通過已知測定方法測定的值非常一致(相關係數，0.9964)，表明可以通過本發明電化學測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇。工業實用性通過本發明用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，可以測定痕量全血中的1,5-脫水葡萄糖醇，所述方法電化學測定1，5-脫水葡萄糖醇而不使用離心機等。因此，本發明的測定方法可以用於在床邊或門診中快速測定1,5-脫水葡萄糖醇和由患者自己在家中進行測定。圖1是顯示本發明所用電極11的簡化圖；圖2是顯示本發明所用電極12的簡化圖；圖3是顯示本發明所用電極13的簡化圖；圖4是參考例9建立的校正曲線；圖5是參考例10的表9中l號試驗的校正曲線；圖6是參考例10的表9中2號試驗的校正曲線；圖7是參考例10的表9中3號試驗的校正曲線；圖8是參考例10的表9中4號試驗的校正曲線；圖9是參考例10的表9中5號試驗的校正曲線；圖IO是參考例10的表9中6號試驗的校正曲線；圖11是參考例10的表9中7號試驗的校正曲線；圖12是參考例10的表9中8號試驗的校正曲線；圖13是參考例10的表9中9號試驗的校正曲線；圖14是參考例10的表10中1號試驗的校正曲線；圖15是參考例10的表10中2號試驗的校正曲線；圖16是參考例10的表10中3號試驗的校正曲線；圖17是參考例10的表10中4號試驗的校正曲線；圖18是參考例10的表10中5號試驗的校正曲線；圖19是參考例10的表10中6號試驗的校正曲線；圖20是參考例10的表10中7號試驗的校正曲線；圖21是參考例10的表10中8號試驗的校正曲線；圖22是參考例10的表10中9號試驗的校正曲線；圖23是參考例10的表10中IO號試驗的校正曲線;圖24是參考例10的表10中11號試驗的校正曲線;圖25是參考例10的表10中12號試驗的校正曲線;圖26是參考例10的表10中13號試驗的校正曲線;圖27是參考例10的表10中14號試驗的校正曲線;圖28是實施例6建立的校正曲線；圖29是實施例7建立的校正曲線；圖30是實施例8建立的校正曲線；圖31是實施例9建立的校正曲線；和圖32是實施例IO建立的校正曲線。附圖標記描述1.樣本添加位置2.支撐體3.工作電極4.對電極5.保護體6.參比電極(碳墨)6a.參比電極(銀-氯化銀油墨)11.電極12.電極13.電極權利要求1.一種測定全血中的1，5-脫水葡萄糖醇的方法，所述方法包括消除或轉化幹擾測定的葡萄糖和/或其衍生物的步驟，以及其後的測定1，5-脫水葡萄糖醇的步驟，其中不分離血細胞，使用原樣全血消除或轉化葡萄糖和/或其衍生物，然後不分離血細胞而讓用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的酶發揮作用，以電化學測定1，5-脫水葡萄糖醇。2.權利要求1的測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其中所述用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的酶是氧化還原酶。3.權利要求2的測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其中所述氧化還原酶是吡喃糖氧化酶、L-山梨糖氧化酶或1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶。4.權利要求3的測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其中所述氧化還原酶衍生自假單孢菌屬或土壤桿菌屬。5.權利要求1至4中任一項的測定1，5-脫水葡萄糖醇的方法，其中在氧化還原介體的存在下，電化學測定1，5-脫水葡萄糖醇。6.權利要求5的測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其中所述氧化還原介體為鋨絡合物、醌化合物、二茂鐵化合物、吩噻嗪化合物、吩噁嗪化合物、吩嗪化合物、靛酚化合物、二苯胺化合物或酚化合物。7.權利要求1至6中任一項的測定1，5-脫水葡萄糖醇的方法，其中不分離血細胞，用酶從原樣全血中消除或轉化所述葡萄糖和/或其衍生物。8.權利要求1至7中任一項的測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其中在穩定劑的存在下，電化學測定1,5-脫水葡萄糖醇。9.權利要求8的測定1，5-脫水葡萄糖醇的方法，其中所述穩定劑是2-磺基苯甲酸或3-磺基苯甲酸。10.權利要求1至9中任一項的測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其中通過電流分析法、電量分析法或循環伏安法來電化學測定1，5-脫水葡萄糖醇。11.權利要求1至10中任一項的測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其中使用如下電極來電化學測定1,5-脫水葡萄糖醇，該電極具有用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的工作電極以及對電極，所述用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的工作電極包含用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的氧化還原酶，以及氧化還原介體。12.權利要求11的測定1，5-脫水葡萄糖醇的方法，其中使用差分電極來電化學測定1,5-脫水葡萄糖醇。13.權利要求12的測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，其中所述差分電極是這樣的電極，它具有用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的工作電極、用於測定空白的工作電極和對電極，所述用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的工作電極包含用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的氧化還原酶，以及氧化還原介體，所述用於測定空白的工作電極包含氧化還原介體，但不含用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的氧化還原酶。14.一種測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片，其包括如下電極，該電極具有用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的工作電極以及對電極，所述用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的工作電極包含用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的氧化還原酶，以及氧化還原介體。15.權利要求14的測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片，其還包括用於消除或轉化葡萄糖和/或其衍生物的試劑。16.權利要求14或15的測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇的傳感器晶片，其包括差分電極，所述差分電極包括如下電極，該電極具有用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的工作電極、用於測定空白的工作電極以及對電極，所述用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的工作電極包含用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的氧化還原酶，以及氧化還原介體，所述用於測定空白的工作電極包含氧化還原介體，但不含用於測定1,5-脫水葡萄糖醇的氧化還原酶。17.—種測定全血中的1，5-脫水葡萄糖醇的試劑盒，其包括權利要求14至16中任一項的傳感器晶片、用於採血的穿刺裝置和1,5-脫水葡萄糖醇的測定裝置。18.權利要求17的測定全血中的1,5-脫水葡萄糖醇的試劑盒，其還包括用於消除或轉化葡萄糖和/或其衍生物的試劑。全文摘要本發明通過一種測定1，5-脫水葡萄糖醇的方法，可以使用少量全血測定1，5-脫水葡萄糖醇而無需藉助於離心機等，所述方法包括下列步驟預先消除或轉化幹擾1，5-脫水葡萄糖醇測定的葡萄糖和/或其衍生物；然後進行測定1，5-脫水葡萄糖醇，其中不進行血細胞分離而在原樣全血中消除或轉化這種葡萄糖和/或其衍生物，不進行血細胞分離而讓用於測定1，5-脫水葡萄糖醇的酶發揮作用，以及電化學測定1，5-脫水葡萄糖醇。因此，這種測定方法能夠用於在床邊或醫學檢查室中1，5-脫水葡萄糖醇的快速測定或用於由患者在家中對其進行自測。文檔編號C12Q1/26GK101558296SQ200780046209公開日2009年10月14日申請日期2007年12月13日優先權日2006年12月14日發明者入江彌生,梅香家佳彥,橫山貴男,田邊敏雄,町田禮子,高木久子申請人:日本化藥株式會社