電泳用凝膠及其用途和製備方法

2023-10-05 06:42:29 3

專利名稱：電泳用凝膠及其用途和製備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體的，本發明涉及電泳用凝膠及其用途和製備方法，更具體的，本發明涉及一種分離膠、一種用於製備分離膠的方法、一種用於製備分離膠的組合物、一種用於電泳的凝膠、一種製備用於電泳的凝膠的方法和一種生物樣品分析方法。
背景技術：
聚丙烯醯胺凝膠是由丙烯醯胺(Acrylamide)單體和少量交聯劑甲叉雙丙烯醯胺(Bis-acrylamide)通過化學催化劑過硫酸銨(Ammonium persulfate),四甲基乙二胺(TEMED)作為催化劑通過聚合作用形成三維空間的高聚物。聚合後的聚丙烯醯胺凝膠形成網狀結構。具有濃縮效應、電荷效應、分子篩效應，因此而被廣泛的應用於遺傳學，分子生物學，細胞生物學，微生物學，植物學，動物學，以及醫學等各個學科領域中蛋白質分子量測定及分尚。 然而，目前的聚丙烯醯胺凝膠仍有待改進。

發明內容
本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一或至少提供一種有用的商業選擇。本發明是基於發明人的下列發現而完成的在生物技術領域，通常根據所期望分離的蛋白質的情況，需要通過改變丙烯醯胺單體溶液濃度或增減交聯劑甲叉雙丙烯醯胺雙體比例的辦法製成孔度大小不同的凝膠(參見圖I)。通常針對不同分子量大小蛋白質，尤其是分子量差異比較大的蛋白質，需要選擇適當濃度的膠百分比濃度。正如圖I所示，8%凝膠僅能獲得5個分離範圍(200KD、116KD、97KD、66KD和45KD)，10%凝膠能獲得6個分離(200KD、116KD、97KD、66KD、45KD 和 31KD) 12% 凝膠能獲得 8 個分離(200KD、116KD、97KD、66KD、45KD、31KD、21. 5KD和14. 4KD)，雖然15%凝膠可獲得9個分離範圍，即可以看到所有蛋白質分子標記(marker )條帶，但是該濃度的凝膠對於大分子量的蛋白得不到很好的分離效果，尤其是對小分子量的蛋白質，條帶往往表現Smeared的缺點，因此不適合用於分離分子量大的蛋白質以及小分子量的蛋白。因此在實驗中，如果需要同時分離小分子量和大分子量的蛋白質樣品，則需要使用4 一 15%和4 一 20%線性梯度凝膠來分離。雖然這種梯度凝膠可以獲得 9 個分離(2001 、1161(0、971(0、661(0、451(0、311(0、21· 5KDU4. 4KD 和 6. 4KD),但它們的配置過程非常繁瑣複雜，需要通過特殊的梯度混合器來配置，耗時且不易在普通實驗室推廣應用。發明人通過對凝膠配方尤其是分離膠的配方進行了深入的研究，得到了新型的凝膠配方，則可以使用單一濃度的電泳凝膠就能夠實現同時對多種分子量的蛋白質樣品的良好分離效果，並且可以獲得和4 一 15%和4 一 20%線性梯度凝膠相媲美的分離效果O在本發明的第一方面，本發明提出了一種分離膠。根據本發明的實施例，該分離膠是通過下列步驟製備的將水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發劑和10重量％APS混合；以及使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述分離膠，其中，所述第一緩衝液的PH為8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％，所述水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發劑和10重量％APS的體積比為4. 3ml 2. 5ml :3. 5ml :20 μ I :75 μ I。發明人驚奇地發現，通過利用該分離膠，在對生物樣品進行分離時，能夠有效地對大範圍分子量的生物樣品例如蛋白質，進行有效地分離，例如根據本發明的實施例，利用根據本發明實施例的分離膠，可以有效地分離從6KD至200KD的蛋白質。根據本發明的實施例，可以使用的水的類型並不受特別限制，根據本發明的實施例，可以採用的水為去離子水。根據本發明的實施例，可以採用的第一緩衝液的類型也不受特別限制，只要其PH可以為8. 8即可。另外，根據本發明的實施示例，可以採用的第一緩衝液可以是含有三(羥甲基)氨基甲烷和鹽酸的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸和兩性電解質的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸、甘氨酸和甘氨酸以外的兩性電解 質的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和硼酸的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和乙酸的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和甘氨酸的緩衝液、或者含有雙Tris和鹽酸的緩衝液。根據本發明的實施例，優選所述第一緩衝液為I. 5Μ Tris ρΗ8. 8。根據本發明的實施例，可以採用的第一自由基聚合性單體的類型並不受特別限制。根據本發明的實施例，可以採用的第一自由基聚合性單體可以為(甲基)丙烯醯胺、N-甲基(甲基)丙烯醯胺、N-羥甲基(甲基)丙烯醯胺、N-乙基(甲基)丙烯醯胺、N-異丙基(甲基)丙烯醯胺、N, N- 二甲基(甲基)丙烯醯胺、N，N-二乙基(甲基)丙烯醯胺、羥甲基(甲基)丙烯醯胺、羥乙基(甲基)丙烯醯胺、(甲基)丙烯酸羥乙酯、羥丙基(甲基)丙烯醯胺、二甘醇單(甲基)丙烯酸酯、N-乙烯基咔唑、N-乙烯基琥珀醯亞胺、N-乙烯基甲醯胺、N-乙烯基乙醯胺、N-乙烯基-2-吡咯烷酮、雙丙酮丙烯醯胺等。根據本發明的實施例，可以採用的第一自由基聚合性單體溶液，優選為40重量％的丙烯醯胺。另外，根據本發明的實施例，可以採用的第一氧化還原催化劑的類型並不受特別限制。根據本發明的實施例，可以採用的第一氧化還原催化劑優選為TEMED (N, N，N』，N』 -四甲基乙二胺)。由此，可以進一步提高利用分離膠對生物樣品進行分離的效率，尤其是對蛋白質進行分離的效率。另外，關於使所得到的混合物固化成型，可以通過任何已知的方式實施。例如，可以將所得到的混合物置於適當的容器中，靜置一段時間即可固化成型。例如，可以通過在玻璃板或者塑料板與上部具有凹狀切口的同尺寸玻璃板或者塑料板之間夾著厚度O. 7mm或者1_的間隔物和防止單體液洩漏的矽密封墊來形成用於固化成型的容器。需要說明的是，在本文中所使用的術語「第一」、「第二」僅用於描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特徵的數量。由此，限定有「第一」、「第二」的特徵可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特徵。在本發明的第二方面，本發明提出了一種用於製備分離膠的方法，其特徵在於，包括以下步驟將水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發劑和10重量％APS混合；以及使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述分離膠，其中，所述第一緩衝液的PH為8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％，所述水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發劑和10重量％APS的體積比為4. 3ml 2. 5ml :3. 5ml :20 μ I :75 μ I。利用該方法，能夠有效地，用於製備前面所述的分離膠，從而可以效地對大範圍分子量的生物樣品例如蛋白質，進行有效地分離，例如根據本發明的實施例，利用根據本發明實施例的分離膠，可以有效地分離從6KD至200KD的蛋白質，可以有效提高對蛋白質進行分離的效率，減少成本，避免誤差。根據本發明的實施例，可以使用的水的類型並不受特別限制，根據本發明的實施例，可以採用的水為去離子水。根據本發明的實施例，可以採用的第一緩衝液的類型也不受特別限制，只要其PH可以為8. 8即可。另外，根據本發明的實施示例，可以採用的第一緩衝液可以是含有三(羥甲基)氨基甲烷和鹽酸的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸和兩性電解質的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸、甘氨酸和甘氨酸以外的兩性電解質的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和硼酸的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和乙酸的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和甘氨酸的緩衝液、或者含有雙Tris和鹽酸的緩衝液。根據本發明的實施例，優選所述第一緩衝液為I. 5M Tris pH8. 8。根據本發明的實施例，可以採用的第一自由基聚合性單體的類型並不受特別限制。根據本發明的實施例，可以採用的第一自由基聚合性單體可以為(甲基)丙烯醯胺、N-甲基(甲基)丙烯醯胺、N-羥甲基(甲基)丙烯醯胺、N-乙基(甲基)丙烯醯胺、N-異丙基(甲基)丙烯醯胺、N, N- 二甲基(甲基)丙烯醯胺、N，N-二乙基(甲基)丙烯醯胺、羥甲基(甲基)丙烯醯胺、羥乙基 (甲基)丙烯醯胺、(甲基)丙烯酸羥乙酯、羥丙基(甲基)丙烯醯胺、二甘醇單(甲基)丙烯酸酯、N-乙烯基咔唑、N-乙烯基琥珀醯亞胺、N-乙烯基甲醯胺、N-乙烯基乙醯胺、N-乙烯基-2-吡咯烷酮、雙丙酮丙烯醯胺等。根據本發明的實施例，可以採用的第一自由基聚合性單體溶液，優選為40重量％的丙烯醯胺。另外，根據本發明的實施例，可以採用的第一氧化還原催化劑的類型並不受特別限制。根據本發明的實施例，可以採用的第一氧化還原催化劑優選為TEMED (N, N，N』，N』 -四甲基乙二胺)。由此，可以進一步提高利用分離膠對生物樣品進行分離的效率，尤其是對蛋白質進行分離的效率，可以有效提高對蛋白質進行分離的效率，減少成本，避免誤差。另外，關於使所得到的混合物固化成型，可以通過任何已知的方式實施。例如，可以將所得到的混合物置於適當的容器中，靜置一段時間即可固化成型。例如，以通過在玻璃板或者塑料板與上部具有凹狀切口的同尺寸玻璃板或者塑料板之間夾著厚度為O. 7mm或者1_的間隔物和防止單體液洩漏的矽密封墊來形成用於固化成型的容器，可以有效提高對蛋白質進行分離的效率，減少成本，避免誤差。在本發明的第三方面，本發明提出了一種用於製備分離膠的組合物，其特徵在於，所述組合物由下列構成水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發劑和10重量％APS，其中，所述第一緩衝液的pH為8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％，所述水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第一氧化還原聚合引發劑和10重量％APS的體積比為4. 3ml :2. 5ml :3. 5ml :20 μ I :75 μ I。由此，利用該組合物能夠有效地用於製備前面所述的分離膠。從而可以效地對大範圍分子量的生物樣品例如蛋白質，進行有效地分離，例如根據本發明的實施例，利用根據本發明實施例的分離膠，可以有效地分離從6KD至200KD的蛋白質，可以有效提高對蛋白質進行分離的效率，減少成本，避免誤差。根據本發明的實施例，可以使用的水的類型並不受特別限制，根據本發明的實施例，可以採用的水為去離子水。根據本發明的實施例，可以採用的第一緩衝液的類型也不受特別限制，只要其pH可以為8. 8即可。另外，根據本發明的實施示例，可以採用的第一緩衝液可以是含有三(羥甲基)氨基甲烷和鹽酸的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸和兩性電解質的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸、甘氨酸和甘氨酸以外的兩性電解質的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和硼酸的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和乙酸的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和甘氨酸的緩衝液、或者含有雙Tris和鹽酸的緩衝液。根據本發明的實施例，優選所述第一緩衝液為I. 5M Tris pH8. 8。根據本發明的實施例，可以採用的第一自由基聚合性單體的類型並不受特別限制。根據本發明的實施例，可以採用的第一自由基聚合性單體可以為(甲基)丙烯醯胺、N-甲基(甲基)丙烯醯胺、N-羥甲基(甲基)丙烯醯胺、N-乙基(甲基)丙烯醯胺、N-異丙基(甲基)丙烯醯胺、N, N- 二甲基(甲基)丙烯醯胺、N，N-二乙基(甲基)丙烯醯胺、羥甲基(甲基)丙烯醯胺、羥乙基(甲基)丙烯醯胺、(甲基)丙烯酸羥乙酯、羥丙基(甲基)丙烯醯胺、二甘醇單(甲基)丙烯酸酯、N-乙烯基咔唑、N-乙烯基琥珀醯亞胺、N-乙烯基甲醯胺、N-乙烯基乙醯胺、N-乙烯基-2-吡咯烷酮、雙丙酮丙烯醯胺等。根據本發明的實施例，可以採用的第一自由基聚合性單體溶液，優選為40重量％的丙烯醯胺。另外，根據本發明的實施例，可以採用的第一氧化還原催化劑的類型並不受特別限制。根據本發明的實施例，可以採用的第一氧化還原催 化劑優選為TEMED (N, N，N』，N』 -四甲基乙二胺)。由此，可以進一步提高利用分離膠對生物樣品進行分離的效率，尤其是對蛋白質進行分離的效率，可以有效提高對蛋白質進行分離的效率，減少成本，避免誤差。在本發明的第四方面，本發明提出了一種用於電泳的凝膠。根據本發明的實施例，該凝膠包括分離膠和濃縮膠，其中分離膠為前面所述，在此不再贅述。根據本發明的實施例，濃縮膠是通過下列步驟製備的將水、第二緩衝液、第二自由基聚合性單體溶液、10重量9(505、第二氧化還原聚合引發劑、10重量％APS混合；以及使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述濃縮膠，其中，所述第二緩衝液的PH為6. 8，所述第二自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％，所述水、第二緩衝液、第二自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第二氧化還原聚合引發劑和10重量％APS的體積比為3. 12ml :1. 26ml :0. 5ml :50 μ I :5 μ I :50 μ I。利用該凝膠，可以效地對大範圍分子量的生物樣品例如蛋白質，進行有效地分離，例如根據本發明的實施例，利用根據本發明實施例的分離膠，可以有效地分離從6KD至200KD的蛋白質，可以有效提高對蛋白質進行分離的效率，減少成本，避免誤差。根據本發明的實施例，可以使用的水的類型並不受特別限制，根據本發明的實施例，可以採用的水為去離子水。根據本發明的實施例，可以採用的第二緩衝液的類型也不受特別限制，只要其PH可以為6. 8即可。另外，根據本發明的實施示例，可以採用的第二緩衝液可以是含有三(羥甲基)氨基甲烷和鹽酸的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸和兩性電解質的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸、甘氨酸和甘氨酸以外的兩性電解質的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和硼酸的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和乙酸的緩衝液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和甘氨酸的緩衝液、或者含有雙Tris和鹽酸的緩衝液。根據本發明的實施例，優選所述第二緩衝液為O. 5Μ Tris ρΗ6.8。根據本發明的實施例，可以採用的第二自由基聚合性單體的類型並不受特別限制。根據本發明的實施例，可以採用的第二自由基聚合性單體可以為(甲基)丙烯醯胺、N-甲基(甲基)丙烯醯胺、N-羥甲基(甲基)丙烯醯胺、N-乙基(甲基)丙烯醯胺、N-異丙基(甲基)丙烯醯胺、N, N- 二甲基(甲基)丙烯醯胺、N，N-二乙基(甲基)丙烯醯胺、羥甲基(甲基)丙烯醯胺、羥乙基(甲基)丙烯醯胺、(甲基)丙烯酸羥乙酯、羥丙基(甲基)丙烯醯胺、二甘醇單(甲基)丙烯酸酯、N-乙烯基咔唑、N-乙烯基琥珀醯亞胺、N-乙烯基甲醯胺、N-乙烯基乙醯胺、N-乙烯基-2-吡咯烷酮、雙丙酮丙烯醯胺等。根據本發明的實施例，可以採用的第二自由基聚合性單體溶液，優選為40重量％的丙烯醯胺。另外，根據本發明的實施例，可以採用的第二氧化還原催化劑的類型並不受特別限制。根據本發明的實施例，可以採用的第二氧化還原催化劑優選為TEMED (N, N，N』，N』 -四甲基乙二胺)。由此，可以進一步提高利用分離膠對生物樣品進行分離的效率，尤其是對蛋白質進行分離的效率，可以有效提高對蛋白質進行分離的效率，減少成本，避免誤差。在本發明的第五方面，本發明提出了一種製備用於電泳的凝膠的方法。根據本發明的實施例，該方法可包括以下步驟將水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發劑和10重量％APS混合；以及使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述分離膠；將水、第二緩衝液、第二自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第二氧化還原聚合引發劑、10重量％APS混合；以及使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述濃縮膠，其中，所述分離膠和所述濃縮膠相連，所述第一緩衝液的PH為8. 8，所述第一自由基聚合性單體 溶液的濃度為40重量％，所述水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發劑和10重量％APS的體積比為:4. 3ml :2. 5ml :3. 5ml :20 μ I :75 μ 1，所述第二緩衝液的pH為6. 8，所述第二自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％，所述水、第二緩衝液、第二自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第二氧化還原聚合引發劑和10重量％APS的體積比為3. 12ml 1. 26ml :0. 5ml :50 μ I :5 μ I :50 μ I,任選地,所述水為去離子水，所述第一和第二緩衝液分別為I. 5Μ Tris ρΗ8. 8和O. 5Μ Tris ρΗ6. 8，所述第一和第二自由基聚合性單體溶液為40重量％的丙烯醯胺，所述第一和第二氧化還原聚合引發劑為TEMED。由此，利用該方法，能夠有效地製備前面所述的用於電泳的凝膠，從而利用該凝膠，可以效地對大範圍分子量的生物樣品例如蛋白質，進行有效地分離，例如根據本發明的實施例，利用根據本發明實施例的分離膠，可以有效地分離從6KD至200KD的蛋白質，可以有效提高對蛋白質進行分離的效率，減少成本，避免誤差。在本發明的第六方面，本發明提出了一種生物樣品分析方法。根據本發明實施例的方法，其包括使用前面所述的分離膠或者電泳用凝膠，對所述生物樣品進行電泳，所述生物樣品含有蛋白質和核酸的至少之一。根據本發明的實施例，所述生物樣品含有蛋白質，所述蛋白質的分子量為6-200KD。由此，利用根據本發明的實施例的方法，可以有效提高對蛋白質進行分離的效率，減少成本，避免誤差。前面所描述的特徵和優點也均適用該方法，不再贅述。由此，利用根據本發明實施例的技術方法，在分離蛋白質時，就不用根據所要分離的蛋白質分子量的大小來選擇不同濃度的凝膠，而是可以用這種單一濃度的凝膠電泳，來分離各種大小的蛋白質(最適線性分離範圍6_200KD)，(如圖2所示)。此外，這種凝膠對於分析限制性蛋白酶解(如圖2所示)，以及2-D SDS-PAGE和Western Blot而言，更是非常理想的選擇。本發明通過採用一種改進的SDS-PAGE凝膠電泳的獨特配方來分離蛋白質，操作簡便，解析度高。試驗結果表明，採用改進後的SDS-PAGE EZ-凝膠不僅可以使小分子量的6. 4kDa蛋白肽得到較好的分離，而且通過調節凝膠濃度，也使大分子量蛋白得到了很好的分離，分離範圍比較寬，並為在6-200kD分子量範圍內的蛋白質提供最佳的分離度。因此，該方法所用體系對於檢測難分離的分子量大小不一的蛋白混合物有顯著優勢，可以說根據本發明實施例的電泳用凝膠可用於各種大小分子量的蛋白質的分離，而不再象傳統的單一濃度的凝膠那樣，只能看到有限的幾個分離範圍，並且比梯度膠操作簡便，並能達到相同的分離效果，因此可廣泛用於蛋白分析。口此外,傳統的SDS-PAGE凝膠電泳系統的缺點在於凝膠基質的穩定性隨著時間推移而降低。這是由於SDS水解聚丙烯醯胺所造成，且4度冰箱放置SDS容易結晶析出，從而影響蛋白質分離膠的分離效果，並大大縮短凝膠的保存時間。而根據本發明實施例的電泳用凝膠中，分離膠內沒有加入SDS，只是在濃縮膠中加入SDS，因此在並不影響分離效果的同時，大大延長了蛋白質分離膠的保存時間，可長達半年到I年之久且結果的重現性極好。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。


本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖I是根據本發明實施例的不同濃度的丙烯醯胺所能夠分離的蛋白質的範圍；圖2是根據本發明實施例的不同濃度的丙烯醯胺與本發明技術方案(EZ-Gel)所能夠分離的蛋白質的範圍的示意圖；圖3是根據本發明實施例的，蛋白質標記在不同濃度的凝膠以及EZ-Gel上分辨效果;圖4是根據本發明實施例，EZ-凝膠用於分析限制性蛋白酶解的結果示意圖；圖5是根據本發明實施例，EZ-凝膠(在本文中有時，稱為「EZ-Gel」或者簡單標註為「EZ」，其含義均相同)用於分析工程菌的誘導表達產物的結果示意圖。
具體實施例方式下面通過具體的實施例，對本發明進行說明，需要說明的是，這些實施例，僅僅是為了說明目的，而不以任何方式限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所採用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，可以參照《分子克隆實驗指南》第三版或者相關產品進行，所採用的試劑和產品也均為可商業獲得的。未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法，所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其後所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。實施例II.材料聚丙烯醯胺凝膠電泳試劑及蛋白質分子量標準品(6. 4 200KD)均為Bio-RAD產品，蛋白質分子量標準品(M)含有200、116、97、66、45、31、21· 5,14. 4,6. 4KD共9種蛋白質成分。2.儀器口
蛋白質微量電泳儀(Bio-RadLab, USA) > Mini-PROTEAN II 垂直電泳槽(Bio-radLab, USA)。□3.電泳溶液配製口 3. I 5X 電泳緩衝液Tris-base 12. 2g, glycine 72. Og,補足 ddH20 到 1000ml,力口SDS 5g溶解，此時pH應為8· 3。□3. 2 陽極緩衝液(I. 5Μ Tris pH8. 8) :90. 8g Tris-base, ddH20 400ml，用 HCl 調 pH值 8. 8，補足 ddH20 到 500ml。口3. 3 陰極緩衝液(O. 5M Tris ρΗ6· 8) :12. 2g Tris-base，加 ddH20 溶解後，用 HCl調節pH至6. 8,然後定容至200毫升.。□
4.樣品處理液及樣品製備2 X 樣品處理液由 4%SDS、20% 甘油(v/v)、IOOmM Tris ρΗ6· 8、2% β -巰基乙醇(ν/ν)、0· 01%溴酹藍(w/v)組成,調pH = 6. 8,室溫存放。取5-10ul樣品，加入等體積的樣品處理液，沸水浴5min，高速離心後於-20攝氏度凍保存備用。口5.凝膠的製備口51 O. 75mm 分離膠
權利要求
1.一種分離膠，其特徵在於，所述分離膠是通過下列步驟製備的 將水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發劑和10重量9^3混合；以及 使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述分離膠， 其中，所述第一緩衝液的PH為8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％， 所述水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發劑和10重量 %APS 的體積比為4. 3ml :2. 5ml :3. 5ml :20 μ I :75 μ I。
2.根據權利要求I所述的分離膠，其特徵在於，所述水為去離子水，所述第一緩衝液為I. 5Μ Tris ρΗ8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液為40重量％的丙烯醯胺，所述第一氧化還原聚合引發劑為TEMED。
3.一種用於製備分離膠的方法，其特徵在於，包括以下步驟 將水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發劑和10重量％APS混合；以及 使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述分離膠， 其中，所述第一緩衝液的PH為8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％， 所述水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發劑和10重量 %APS 的體積比為4. 3ml :2. 5ml :3. 5ml :20 μ I :75 μ I。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述水為去離子水，所述第一緩衝液為1.5Μ Tris ρΗ8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液為40重量％的丙烯醯胺，所述第一氧化還原聚合引發劑為TEMED。
5.一種用於製備分離膠的組合物，其特徵在於，所述組合物由下列構成 水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發劑和10重量 ％APS， 其中，所述第一緩衝液的PH為8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％， 所述水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第一氧化還原聚合引發劑和 10 重量 %APS 的體積比為4. 3ml :2. 5ml :3. 5ml :20 μ I :75 μ I。
6.根據權利要求5所述的組合物，其特徵在於，所述水為去離子水，所述第一緩衝液為I.5Μ Tris ρΗ8，所述第一自由基聚合性單體溶液為40重量％的丙烯醯胺，所述第一氧化還原聚合引發劑為TEMED。
7.一種用於電泳的凝膠，其特徵在於，包括分離膠和濃縮膠， 其中，所述分離膠為權利要求I或2任一項所述的分離膠， 所述濃縮膠是通過下列步驟製備的 將水、第二緩衝液、第二自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第二氧化還原聚合引發齊[1、10重量9^5混合；以及 使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述濃縮膠， 其中，所述第二緩衝液的PH為6. 8，所述第二自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％， 所述水、第二緩衝液、第二自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第二氧化還原聚合引發劑和 10 重量 %APS 的體積比為3. 12ml :1. 26ml :0. 5ml :50 μ I :5 μ I :50 μ 1， 任選地，所述水為去離子水，所述第二緩衝液為O. 5Μ Tris ρΗ6. 8，所述第二自由基聚合性單體溶液為40重量％的丙烯醯胺，所述第二氧化還原聚合引發劑為TEMED。
8.一種製備用於電泳的凝膠的方法，其特徵在於，包括以下步驟 將水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發劑和10重量％APS混合；以及 使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述分離膠； 將水、第二緩衝液、第二自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第二氧化還原聚合引發齊[1、10重量9^5混合；以及 使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述濃縮膠， 其中， 所述分離膠和所述濃縮膠相連， 所述第一緩衝液的PH為8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％，所述水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發劑和10重量 %APS 的體積比為4. 3ml :2. 5ml :3. 5ml :20 μ I :75 μ 1， 所述第二緩衝液的pH為6. 8，所述第二自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％，所述水、第二緩衝液、第二自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第二氧化還原聚合引發劑和 10 重量 ％APS 的體積比為3. 12ml :1. 26ml :0. 5ml :50 μ I :5 μ I :50 μ 1， 任選地，所述水為去離子水，所述第一和第二緩衝液分別為I. 5Μ TrispH8. 8和O. 5MTris pH6. 8，所述第一和第二自由基聚合性單體溶液為40重量％的丙烯醯胺，所述第一和第二氧化還原聚合引發劑為TEMED。
9.一種生物樣品分析方法，其特徵在於，使用權利要求8所述的凝膠，對所述生物樣品進行電泳，所述生物樣品含有蛋白質和核酸的至少之一。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述生物樣品含有蛋白質，所述蛋白質的分子量為6-200KD。
全文摘要
本發明提出了電泳用凝膠及其用途。其中分離膠是通過下列步驟製備的:將水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發劑和10重量%APS混合；以及使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述分離膠，其中，所述第一緩衝液的pH為8.8，所述第一自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量%，所述水、第一緩衝液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發劑和10重量%APS的體積比為4.3ml2.5ml3.5ml20μl75μl。利用該電泳凝膠能夠有效分離6-200KD的蛋白質。
文檔編號C08F20/56GK102875712SQ201210353119
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月20日 優先權日2012年9月20日
發明者姜夫國 申請人:姜夫國