製備羧酸官能化聚合物的方法

2023-10-07 21:22:24 1

專利名稱：製備羧酸官能化聚合物的方法
技術領域：
本發明涉及製備攜帶羧基官能團的水溶性非肽類聚合物的方法，特別是製備羧酸官能化聚(乙二醇)(PEG)聚合物的方法。
背景技術：
用親電基團活化的聚(乙二醇)(PEG)衍生物可用於結合於生物活性分子的親核基團如氨基。具體地，PEG的活性酯和其它羧酸衍生物已經被用於將PEG連接於帶有氨基的蛋白質。
具有末端羧甲基基團的PEG分子已經由例如Martinez等人，美國專利5,681,567；Veronese等人，Journal of Controlled Release 10145-154(1989)；和Bückmann等人，Makromol.Chem.，182(5)1379-1384(1981)描述。美國專利5,672,662(Harris等人)公開了具有末端丙酸或丁酸部分的PEG衍生物。這種以羧基封端的PEG用於製備適於與蛋白質或攜帶氨基的其它分子結合的活性酯。
然而，與製備羧基官能化聚合物有關的一貫問題在於很難以足夠高的純度得到所需的聚合物產品。例如，上述的Veronese等人和Bückmann等人，採用了合成mPEG羧酸類的方法，該方法包括通過mPEG-OH與α-滷代乙酯的鹼催化反應將mPEG-OH轉化為mPEG羧酸的乙酯，隨後進行鹼促進的酯水解。然而，這種方法提供只有約85％純度的mPEG酸，主要雜質為不能使用典型的純化方法如沉澱、結晶或提取與mPEG羧酸類分離的mPEG-OH。mPEGOH的除去需要使用製備性離子交換柱色譜法，其既費時又成本高。商業上得到的PEG羧酸類經常包含殘餘量的PEG-OH，其使基於這些材料的衍生物或生物結合物的製備複雜化。
美國專利5,278,303、5,605,976和5,681,567報導了含有很少或不含起始原料(PEG醇)的PEG羧酸類的製備，其採用滷代乙酸叔烷基酯製備叔烷基酯-官能化的PEG，然後用酸優選三氟乙酸(TFA)水解。
關於保護基的應用的多種論述提及了叔烷基酯如叔丁酯，它們對於通常用於水解伯烷基酯如乙酯的弱鹼水解是穩定的。強鹼水解可以引起羧酸基團裂解。參見例如，T.W.Greene，Protective Groups inOrganic Synthesis，第三版，1999，p.406；或P.J.Kocienski，ProtectingGroups，1994，p.125。因此，這些叔烷基酯通常用酸裂解，通常使用TFA。
然而，三氟乙酸的使用可以引起純化和產品穩定性的問題。三氟乙酸很難從最終的羧基官能化聚合物中被完全除去，特別是上述專利中建議量的三氟乙酸。由於由酸促進的自氧化引起的聚合物降解，殘留的三氟乙酸的存在導致產品穩定性差。參見例如，M.Donbrow，″Stability of the Polyoxyethylene Chain″，Nonionic SurfactantsPhysicalChemistry，M.J.Schick編著，Marcel Dekker，1987，pp.1011 ff。這篇文章報導說酸催化氫過氧化物的形成和氫過氧化物破壞，導致聚氧乙烯鏈的斷裂。
雖然美國專利5,605,976提出蒸餾作為從聚合物產品分離有機材料的方法，但是即使使用蒸餾工藝也很難將具有極低沸點的化合物從高分子聚合物中除去，並且難度隨聚合物分子量的增加而增加。
本領域中仍需要替代方法，用於以高收率製備羧酸官能化聚合物並且不含顯著量的聚合物雜質，特別是顯著量的聚合物起始原料。本領域中還需要不使用難以從最終聚合物產品中除去或引起產品穩定性問題的試劑的替代的合成方法。

發明內容
在一個方面，本發明提供製備用羧基官能化的水溶性非肽類聚合物的方法，該方法包括(i)使酯試劑R(C＝O)OR′(其中R′為叔基，R包括官能團X)與水溶性非肽類聚合物POLY-Y(其中Y為與X反應形成共價鍵的官能團)反應，形成聚合物的叔酯；和(ii)再水溶液中用強鹼如鹼金屬氫氧化物處理聚合物的叔酯形成聚合物的羧酸鹽。該方法可以另外包括步驟(iii)在水溶液中用無機酸處理聚合物的羧酸鹽，將羧酸鹽轉化為羧酸，從而形成羧酸官能化聚合物。然後可使用適當的溶劑優選氯化溶劑將羧酸官能化聚合物從水溶液提取出來。
在一個實施方案中，X離去基團，如滷化物或磺酸酯，Y為羥基。當Y為羥基時，優選反應(i)在鹼(如R′O-M+形式的鹼，其中M+為陽離子)的存在下進行。
在反應(ii)中用強鹼處理優選有效產生pH為約11到13的反應物。在步驟(iii)中的無機酸如礦物酸優選為在水溶液中產生非親核性陰離子的酸。優選的酸包括硫酸、硝酸、磷酸、和鹽酸。(iii)的酸處理優選有效產生pH約1到3的反應物。
優選用於反應(i)的叔酯試劑為結構(I) 在結構(I)中，X為離去基團；R1和R2各自獨立地選自氫、烷基、環烷基、烷氧基、芳基、芳烷基、和雜環。優選地，基團(CR1R2)n不包括連接於同一碳原子的兩個雜原子；例如優選相同碳原子上的R1和R2不同時為烷氧基。R3-R5各自獨立地選自低級烷基、芳基、芳烷基、和環烷基，其中任何的R3-R5可連接形成環或環系統，例如金剛烷基。R1到R5中的任一個，除了氫以外，可被選自低級烷基、低級烷氧基、C3-C6環烷基、滷代、氰基、氧代(酮)、硝基、和苯基的基團取代。變量n為1到約24，優選1到6，更優選1到4，最優選1或2。在一個在選擇的結構(I)的實施方案中，R1和R2各自獨立地為氫或未取代的低級烷基，優選氫或甲基，並且R3到R5各自獨立地為未取代的低級烷基或苯基，優選甲基、乙基、或苯基。在一個實施方案中，R1和R2各自為H，n為1。
優選結構(I)中的離去基團X為滷化物或磺酸酯。在一個實施方案中，叔酯試劑為滷代乙酸叔烷基酯，如滷代乙酸叔丁酯。
優選水溶性非肽類聚合物選自聚(亞烷基二醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡硌烷酮)、聚(羥基烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥基烷基甲基丙烯酸酯)、聚(糖)、聚(α-羥基乙酸)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚唑啉、聚(N-丙烯醯基嗎啉)、及其二元共聚物或三元共聚物。在優選實施方案中，聚合物為聚(乙二醇)。聚(乙二醇)可為線型的並且在一端以官能團Y封端，在另一端以另一官能團Y′或封端基團如甲氧基封端。或者，聚(乙二醇)可為支化的、叉狀的、或多臂式的。
該方法可另外包括將羧酸官能化聚合物的羧酸轉化為活化的羧酸衍生物如活化酯，例如例如N-琥珀醯亞胺基酯；鄰-、間-、或對-硝基苯酯；1-苯並三唑基酯、咪唑基酯、或N-磺基琥珀醯亞胺基酯。然後可通過將羧酸衍生物與生物活性分子上的官能團(優選親核基團如羥基、巰基、或氨基)反應使聚合物與生物活性分子結合。優選地，親核基團為氨基。
如上所述，在該方法的優選實施方案中，聚合物為PEG聚合物。在這一方面，本發明提供製備用羧基官能化的聚(乙二醇)(PEG)的方法，該方法包括(i)使叔酯試劑R(C＝O)OR′(其中R′為叔烷基，R包括官能團X)與聚合物PEG-Y(其中Y為與X反應形成共價鍵的官能團)反應形成PEG叔酯；和(ii)在水溶液中用強鹼例如鹼金屬氫氧化物處理PEG叔酯以形成PEG羧酸鹽。該方法可另外包括(iii)在水溶液中用無機酸處理PEG羧酸鹽，將羧酸鹽轉化為羧酸，從而形成PEG羧酸。該方法的優選實施方案與上述的那些相對應。如上所述，該方法可另外包括將PEG-羧酸轉化為活化的羧酸衍生物如活化酯，和通過使羧酸衍生物與生物活性分子上的官能團反應將聚合物與生物活性分子結合。
在一個實施方案中，聚(乙二醇)可為線型的並且在一端以官能團Y封端，和在另一端以另一個官能團Y′或封端基團如甲氧基封端。優選PEG的分子量為約100Da到約100kDa，更優選為約300Da到約40、50或60kDa。在其它實施方案中，PEG為支化的、叉狀的、或多臂式的，如以下進一步描述的。
在相關的方面，本發明提供分離的聚合物產品，其包括通過本文公開的方法生產的羧酸官能化聚合物，其中該產品包含低於5重量％的起始原料即POLY-Y或PEG-Y聚合物，餘量基本上由羧酸官能化聚合物組成。優選地，分離的聚合物產品包含低於2重量％、更優選低於1重量％、和最優選低於0.5重量％的POLY-Y或PEG-Y聚合物。在另外優選的實施方案中，分離的聚合物產品包含低於0.4重量％、更優選低於0.3重量％、和最優選低於0.2重量％的POLY-Y或PEG-Y聚合物。
在另外優選的方面，分離的聚合物產品基本上不含低分子量的有機酸。在一個實施方案中，分離的聚合物產品基本上不含單體有機羧酸如三氟乙酸。
在本發明的聚合物產品的一個實施方案中，羧酸官能化聚合物為PEG羧酸。例如，羧酸官能化聚合物可為mPEG-CH2-COOH，並且包含低於5重量％，優選低於2重量％，更優選低於0.5重量％，和最優選低於0.2重量％的mPEG-OH。優選地，該產品基本上不含三氟乙酸。
在該產品的另一個實施方案中，羧酸官能化聚合物為HOOC-CH2-PEG-CH2-COOH，並且包含低於5重量％，優選低於2重量％，更優選低於0.5重量％，和最優選低於0.2重量％的HO-PEG-OH。優選地，該產品基本上不含三氟乙酸。
在該產品另外的實施方案中，羧酸官能化聚合物為由PEG-(CH2-COOH)x表示的多官能支化或多臂式羧酸官能化PEG，其中x為3到8，並且包含低於5重量％，優選低於2重量％，更優選低於0.5重量％，和最優選低於0.2重量％的PEG-(OH)X。優選地，該產品基本上不含三氟乙酸。
本發明另外提供對製備用羧基官能化的聚(乙二醇)(PEG)聚合物的方法的改進措施，所述方法使叔酯試劑R(C＝O)OR′(其中R′為叔烷基，R包括官能團X)與聚合物PEG-Y(其中Y為與X反應形成共價鍵的官能團)反應形成PEG叔酯。該改進措施包括在水溶液中用強鹼優選鹼金屬氫氧化物處理PEG叔酯以形成PEG羧酸鹽。優選強鹼為在水溶液中有效產生約11到13的反應pH的強鹼。
改進措施可另外包括在水溶液中用無機酸處理PEG羧酸鹽，將羧酸鹽轉化為羧酸，從而形成PEG羧酸。優選無機酸為選自硫酸、硝酸、磷酸、和鹽酸的礦物酸。
在結合附圖
閱讀以下發明的詳細說明之後，本發明的這些和其它目的和特點會變得更加明顯。
發明的詳細說明現在更全面地描述本發明。然而，本發明可以體現為許多不同的形式並且不應認為本發明限於本文提出的實施方案；相反地，提供這些實施方案使得本公開更加全面和充分，和使本發明的範圍足以被本領域技術人員理解。本發明不限於本說明書中提出的具體的聚合物、合成技術、活化劑等，因而可在權利要求中包括的本發明的範圍內變化。用於本文的術語只是用於描述具體的實施方案，其不是限制性的。
1.定義在描述和要求保護本發明時，以下術語根據如下所述定義使用。
如本說明書中使用的，單數形式「一」、「一個」和「所述」還包括複數形式，除非上下文關係明顯限定不是這樣。
如本文中使用的，「非肽類」是指基本上不含肽鍵的聚合物。然而，聚合物可以包括沿著主鏈長度間隔開的少量的肽鍵，諸如例如，每約50個單體單元包括不超過約1個肽鍵。
如本文中使用的，「PEG」或「聚乙二醇」包括任何水溶性的聚(環氧乙烷)。通常，用於本發明的PEG包括以下兩個結構之一-O(CH2CH2O)m或-CH2CH2O(CH2CH2O)m-CH2CH2-，其中m通常為3到約3000。在廣義上，「PEG」可以指包含大部分即超過50％的-CH2CH2O-亞單元的聚合物。
大體上的PEG的末端基團和結構可以不同。PEG可以在末端氧上包含封端基團，其通常為含碳基團，其通常由1-20個碳組成並且優選選自烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、環烷基、雜環基、和前述任一種的被取代形式。封端基團還可以是矽烷。最優選烷基(烷氧基)或芳烷基(芳烷氧基)封端基團，如甲基、乙基或苄基。
封端基團還可以有利地包括可檢測標記物。這種標記物包括但不限於螢光劑、化學發光劑、用於酶標記的部分、比色劑(如，染料)、金屬離子、放射性部分、等等。
其它(「未封端的」)末端通常為羥基、胺或可以進行進一步化學改性的活化基團。
用於本發明的具體PEG形式包括具有不同分子量、結構或幾何形狀的(如，支化的、線型的、叉狀的、多臂式的)PEG。
「多官能」聚合物具有至少3個可相同或不同的官能團。多官能聚合物通常包含約3-100個官能團，或3-50個官能團，或3-25個官能團，或3-15個官能團，或3-10個官能團，或包含3、4、5、6、7、8、9或10個官能團。
「雙官能」聚合物在其中具有兩個官能團，其可為相同的(即，同雙官能)或不同的(即，異雙官能)。
「分子質量」或「分子量」是指聚合物的平均分子質量，通常通過空間排阻色譜法、光散射技術、或在1，2，4-三氯苯中的本徵速度測定進行測定。除非另作說明，在本文中，分子量表示為數均分子量(Mn)，其定義為∑NiMi/∑Ni，其中Ni為分子量Mi的聚合物分子的數目(或那些分子的摩爾數)。
本發明的聚合物，或用於本發明的聚合物，通常為多分散性的，即，聚合物的數均分子量和重均分子量不相等。表示為重均分子量(Mw)與數均分子量(Mn)的比值的多分散性值(Mw/Mn)通常很低，即小於約1.2，優選小於約1.15，更優選小於約1.10，更優選小於約1.05，最優選小於約1.03，最優選小於約1.025。
「活化的羧酸」是指比母體羧酸更具活性的羧酸的官能衍生物，特別是相對於親核攻擊。活化的羧酸包括但不限於醯基滷(諸如醯基氯)、酸酐、和酯。
一般地說，術語「活化的」或「活性的」與具體官能團結合使用時是指容易地與另一分子上的親電體或親核體反應的官能團，與需要強催化劑或不實際的反應條件用於進行反應的基團(即「無活性的」或「惰性的」基團)形成對比。
術語「保護基」是指在某些反應條件下防止或阻斷分子中特定的化學活性官能團反應的部分。保護基隨被保護的化學反應基團的類型、以及採用的反應條件、和分子中另外的反應基團或保護基的存在(如果有的話)而不同。本領域中已知的保護基可以在Greene，T.W.等人，Protective Groups in Organic Synthesis，第三版，John Wiley Sons，NewYork，NY(1999)中找到。如本文中使用的，術語「官能團」或其任何同義詞包括其被保護的形式。
本文中使用的術語「間隔基」或「間隔基部分」是指用於連接相互連接部分的原子或多個原子的集合，諸如用於連接水溶性聚合物部分的末端和親電體。典型的間隔基包括選自亞烷基(碳-碳)、醚、氨基、醯胺、酯、氨基甲酸酯、脲、和酮、及其組合的鍵。間隔基可以包括短的亞烷基部分，其與一種或多種上述含雜原子的連接形成交替方式，或由一種或多種上述含雜原子的連接形成側鏈形。不同的例子包括-CH2OCH2CH2CH2-、-CH2C(O)NHCH2-、-C(O)OCH2-、-OC(O)NHCH2CH2-、-CH2CH2NHCH2、-CH2CH2C(O)CH2CH2-、-CH2CH2CH2C(O)NHCH2CH2NH-、和-CH2CH2CH2C(O)NHCH2CH2NHC(O)CH2CH2-。本發明的間隔基部分可為水解穩定的或可以包括生理學可水解的或可酶促降解的連接(如酯連接)。
「烷基」是指烴鏈，通常為約1到20個原子的長度。這種烴鏈優選是但不一定是飽和的，並且可為支化的，或優選為線型的(非支化的)。示例性的烷基包括乙基、丙基、丁基、戊基、2-甲基丁基、2-甲基丙基(異丁基)、3-甲基戊基等。如本文中使用的，當涉及三個或更多個碳原子時，「烷基」包括環烷基。
「低級烷基」是指包含1到6個碳原子的烷基，如甲基、乙基、正丁基、異丁基、叔丁基。
「環烷基」是指飽和或不飽和的環烴鏈，並且包括橋接的、稠合的或螺環的化合物，優選由3到約12個碳原子、更優選3到約8個碳原子構成。
如本文中使用的，「烯基」是指具有2到15個碳原子並且包含至少一個雙鍵的支化或非支化的烴基，如乙烯基、正丙烯基、異丙烯基、正丁烯基、異丁烯基、辛烯基、癸烯基、十四烯基等。
如本文中使用的，術語「炔基」是指具有2到15個原子並且包含至少一個三鍵的支鏈或非支鏈烴基，如乙炔基、正丙炔基、異戊炔基、正丁炔基、辛炔基、癸炔基等。
「烷氧基」是指-OR基團，其中R為烷基或取代的烷基，優選C1-C20烷基(如甲氧基、乙氧基、丙氧基等)，更優選低級烷基(即，C1-C6)。
「芳基」是指具有單個環(如苯基)或兩個縮合環或稠合環(如萘基)的取代的或未取代的單價芳基。多個芳基環也可為未稠合的(如聯苯基)。該術語包括雜芳基，其為在環中具有一個或多個氮、氧、或硫原子的芳香環基團，如呋喃基、吡咯、吡啶基、和吲哚。
「芳烷基」是指進一步被芳基取代的烷基，優選低級烷基(C1-C4烷基，更優選C1-C2烷基)取代基，其例子為苄基和苯乙基。「芳烷氧基」是指式-OR的基團，其中R為芳烷基，其一個例子為苄氧基。
「雜環」是指環，優選5到7元環，其環原子選自碳、氮、氧和硫。優選地，環原子包括3到6個碳原子。芳香族雜環(雜芳基)的例子如以上給出的；非芳香族雜環包括例如吡咯烷、哌啶、哌嗪、和嗎啉。
「取代的」基團或部分為氫原子已經被替換為非氫原子或基團(優選為互不幹擾的取代基)的基團或部分。
「互不幹擾的取代基」為當存在於分子中時通常與分子內包含的其它官能團為非反應性的那些基團。這些包括但不限於低級烷基、烯基、或炔基；低級烷氧基；C3-C6環烷基；滷代，如氟代、氯代、溴代、或碘代；氰基；氧代(酮)；硝基；和苯基。
「叔基」為式-CR3的基團，其中每個R為經由碳原子連接於C的有機部分。每個R可為例如烷基、環烷基、芳基、或芳烷基，它們是取代的或未取代的。叔基的例子包括叔丁基，其中每個R為甲基；三苯基甲基(三苯甲基)，其中每個R為苯基；和二甲氧三苯甲基(DMT)，其中兩個R為對甲氧基苯基和一個R為苯基。還包括其中一個或多個R形成環或環系統的基團，如金剛烷基。
「叔酯」為具有叔基作為酯的醇部分的酯；即，R′-(C＝O)-OCR3，其中CR3為上述定義的「叔基」，R′為酯的酸部分。
如本文中使用的，「羧基」是指基團-C(＝O)OH(羧酸)或-C(＝O)O-M+，其中M+為帶正電荷的離子如鹼金屬離子(羧酸鹽基團)。
「低分子量」有機酸是指分子量小於約400，優選小於約300，更優選小於約200的酸性有機化合物。該術語通常是指非聚合物型和非低聚物型的酸，並且泛指用作試劑的酸。其例子包括甲酸、乙酸、三氟乙酸(TFA)、和對甲苯磺酸。
「親電體」為具有親電中心(即，尋求電子或能夠與親核體反應的中心)的原子或多個原子的集合。
「親核體」是指具有親核中心(即，尋求親電中心或能夠與親電體反應的中心)的原子或多個原子的集合。
「生理學可裂解的」或「可水解的」或「可降解的」鍵為在生理條件下與水反應(即，被水解)的相對較弱的鍵。鍵在水中水解的趨勢不僅取決於連接兩個中心原子的鍵的一般類型，而且取決於連接於這些中心原子的取代基。適當的水解不穩定的連接或弱連接包括但不限於羧酸酯、磷酸酯、酸酐、縮醛、縮酮、醯氧基烷基醚、亞胺、和原酸酯。
「可酶促降解的連接」為容易被一種或多種酶降解的連接。
「具有水解穩定性的」連接或鍵是指在水中基本上穩定的化學鍵，通常為共價鍵；即，其在生理條件下在延長的時間段內不經歷任何明顯程度的水解。通常，具有水解穩定性的連接為在生理條件下表現出水解速率小於每天約1-2％的連接。具有水解穩定性的連接的例子包括碳-碳鍵、醚、胺、和醯胺。代表性的化學鍵的水解速率可以在最標準的化學教科書中找到。
包含「基本上無」特定組分的產品是指不包含特定組分，或者是指特定組分的含量通過常規的產品分析法不可檢測和/或對於產品的性質或穩定性沒有可檢測的影響。例如，從未有意地或故意地暴露於或接觸特定物質的產品被認為是基本上不含該物質。
術語「藥物」、「生物活性分子」、「生物活性部分」和「生物活性劑」中的每一個，在用於本文中時，是指可以影響生物有機體的任何物理或生化特性的任何物質，其中有機體選自病毒、細菌、真菌、植物、動物、和人類。具體地，如本文中使用的，生物活性分子包括設計用於診斷、治療緩解、治療、或預防人類或其它動物疾病的任何物質；或用於增強人類或動物的物理或精神健康的任何物質。生物活性分子的例子包括但不限於肽、蛋白質、酶、小分子藥物、染料、脂質、核苷、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、細胞、病毒、脂質體、微粒、和膠束。適用於本發明的生物活性劑的類別包括但不限於抗生素、殺真菌劑、抗病毒劑、抗炎藥、抗腫瘤藥、心血管藥物、抗焦慮藥、激素、生長因子、甾族藥物、等等。還包括食物、食品增補劑、營養素、營養治療劑(nutriceutical)、藥物、疫苗、抗體、維生素、和其它有益物質。
術語「結合物」是指通過分子如生物活性分子與活性聚合物分子優選聚(乙二醇)共價連接而形成的實體。
「可藥用賦形劑」或「可藥用載體」是指可以被包括在本發明的組合物中並且不對患者引起顯著不利的毒理學作用的賦形劑。
在本文中使用的「藥理學有效量」、「生理學有效量」、和「治療有效量」是指存在於藥物製劑中的在血流或目標組織中提供期望水平的活性劑和/或結合物所需的聚合物-活性劑結合物的量。精確量根據許多因素而定，如，具體的活性劑、藥物製劑的各組分和物理特性、預定的患者群、對患者的考慮等，並且可由本領域技術人員根據本文中提供的和得自相關文獻的信息容易地確定。
術語「患者」是指患有或傾向於患有可通過給藥生物活性劑或其結合物預防或治療的狀況的生物機體，其包括人類和動物。
II.製備羧酸官能化聚合物的方法A.綜述在一個方面，本發明提供製備用羧基(即，羧酸鹽或羧酸)官能化的水溶性非肽類聚合物的方法。該方法涉及使叔酯試劑R(C＝O)OR′(其中R′為如上定義的叔基，R包括官能團X)與水溶性非肽類聚合物POLY-Y(其中Y為與X反應形成共價鍵的官能團)反應形成聚合物的叔酯，其可由POLY-R-(C＝O)OR′表示。POLY和R之間的連接的性質根據官能團Y和X而定。
由POLY-Y、或當聚合物為聚乙二醇時由PEG-Y表示的反應起始原料在不同的結構中可以包括超過一個官能團Y。其例子包括含多個羥基的線型的、支化的、和多臂式PEG，以下進一步討論。反應產物，即，羧基官能化聚合物，包含多個羥基，多個羥基的數目等於起始原料中官能團Y的數目(或如果起始原料存在有羧基，則大於Y的數目)。
優選地，聚合物的官能團Y為羥基、或其它親核基團，叔酯試劑的官能團X為能夠被Y置換的離去基團。其它可能的官能團組合描述如下。
一旦叔酯基團連接於聚合物，其通過在水溶液中被鹼水解而轉化為羧酸鹽，優選隨後將羧酸鹽酸化以產生羧酸。令人驚訝地是，已經發現叔酯雖然在最初親核取代反應所用的鹼的存在下是穩定的，但是可以通過鹼促進的水解除去。如上所述，叔烷基酯如叔丁酯通常被認為是耐鹼水解的。
以下的一般反應圖解描述本發明方法的優選實施方案，其中Y為羥基，X為離去基團，並且酯試劑具有如(I)所示的結構。
反應圖解IB.反應組分在優選的酯試劑(I)中，R1和R2各自獨立地選自H、低級烷基、環烷基、烷氧基、芳基、芳烷基、和雜環；R3-R5各自獨立地選自低級烷基、芳基、和芳烷基，各自的定義如上所述。優選地，基團(CR1R2)n不包括連接於同一碳原子的兩個雜原子，例如，同一碳原子上的R1和R2優選不同時為烷氧基。R1到R5中的任一個，除了氫，可被互不幹擾的取代基取代，互不幹擾的取代基的定義如上所述。
優選地，R1和R2各自獨立地為氫或未取代的低級烷基，R3到R5各自獨立地為未取代的低級烷基或苯基。在選擇的實施方案中，R1和R2各自獨立地為氫或甲基，更優選為氫，且R3到R5各自獨立地為甲基、乙基、或苯基。
變量n為1到約24，優選為1到約12。在選擇的實施方案中，n為1或2、1到3、1到4、1到5、1到6、1到7、1到8、1到9、1到11、1到12、1到13、1到14、1到15、1到16、1到17、1到18、1到19、1到20、1到21、1到22、1到23、或1到24。在另外的選擇的實施方案中，n為1到6；優選地，n為1到4；更優選地，n為1或2。在n大於1時，-(CR1R2)n-部分優選包括最多兩個，更優選最多一個R1或R2的非氫實施方案。
在另外的實施方案中，n為1，R1和R2獨立地為氫或甲基。在一個這種實施方案中，當R1和R2都是氫時，產物(IV)包含羧甲基。
優選地，酯試劑(II)上的官能團X為離去基團，例如滷代如氯代或溴代，或為磺酸酯如對甲苯磺醯基(甲苯磺醯基)、甲烷磺醯基(甲磺醯基)、三氟磺醯基、或三氟乙基磺醯基(三氟乙磺醯基)。然而，也可使用能夠與聚合物上的官能團反應以形成共價連接的其它官能團。優選地，聚合物上的官能團為親核基團，例如胺、醯肼(-C(＝O)NHNH2)、或巰基，而酯試劑上的官能團X為親電基團。除了上述那些離去基團之外，親電基團包括羧酸酯包括亞胺酯、原酸酯、碳酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、醛、酮、硫酮、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯醯胺、碸、馬來醯亞胺、二硫化物、碘代、環氧化物、硫代磺酸酯、矽烷、烷氧基矽烷、滷代矽烷、和氨基磷酸酯。這些基團的更具體例子包括琥珀醯亞胺基酯或碳酸酯、咪唑基酯或碳酸酯、苯並三唑酯或碳酸酯、對硝基苯基碳酸酯、乙烯碸、氯乙基碸、乙烯基吡啶、吡啶基二硫化物、碘乙醯胺、乙二醛、和二酮。還包括其它活化的羧酸衍生物，以及任何上述部分的水合物或被保護的衍生物(如水合醛、半縮醛、縮醛、水合酮、半縮酮、縮酮、硫縮酮、硫縮醛)。優選的親電基團包括琥珀醯亞胺基碳酸酯、琥珀醯亞胺基酯、馬來醯亞胺、苯並三唑碳酸酯、縮水甘油醚、咪唑基酯、對硝基苯基碳酸酯、丙烯酸酯、醛、和鄰吡啶基二硫化物。
通常，選擇試劑上的官能團X使得其與聚合物上的官能團Y的反應比官能團Y與試劑的叔丁酯部分的反應更容易進行。當聚合物的官能團Y為親核體如羥基時，X最適合地為良好的離去基團如滷代或磺酸酯。
特別優選的酯試劑包括滷代乙酸叔丁酯，如溴乙酸叔丁酯、氯乙酸叔丁酯、和碘乙酸叔丁酯。這種滷代乙酸叔丁酯可得自例如SigmaChemical Co.，St.Louis，Mo。
在圖解I中，POLY-OH為水溶性非肽類聚合物，諸如例如mPEG-OH。通常，該聚合物可為具有任何可獲得的幾何構型(如線型、支化、叉狀等)的任何水溶性非肽類聚合物，以下進一步討論。為了簡化起見，以上給出的反應圖解使用具有單個羥基的聚合物。然而，如本領域技術人員理解的，聚合物可以包括超過一個的羥基，如1到約25個羥基(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多個羥基)。此外，羥基可以被與叔酯試劑上的官能團X反應的任何親核官能團代替。這種親核官能團包括巰基、胺、和穩定化的負碳離子。
C.反應過程對於上述示例性圖解I第一行所示過程的第一階段，優選將各組分溶於適當的有機溶劑中，如叔丁醇、苯、甲苯、二甲苯、四氫呋喃(THF)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基亞碸(DMSO)等。
如圖解I表示的本發明實施方案所示的，聚合物的羥基與叔酯試劑的反應通常在鹼的存在下進行。示例性的鹼包括叔丁醇鉀、丁基鋰、氨基鈉、和氫化鈉。也可使用其它強鹼。
反應通常在約0-120℃的溫度下進行，優選約20-80℃，更優選約25-50℃，雖然反應條件隨聚合物和官能團反應而不同。如以下提供的實施例中所示，含羥基的PEG與溴乙酸叔丁酯的反應有效地在室溫到約45℃的溫度進行。
反應時間通常為約0.5小時到約24小時，如約1到20、3到18、4到12、或6到8小時。如以下實施例中所示，用於羥基化聚合物與溴乙酸叔丁酯反應的典型反應時間為12到20小時。反應可以根據標準方法監控完成。優選地，反應在惰性氣氛如氮氣或氬氣下進行。
優選反應採用摩爾過量的酯試劑(如兩倍、三倍、6倍、10倍、或20倍、最多約30倍摩爾過量)，以確保實現聚合物起始原料的完全轉化。在反應的該階段之後，通常通過蒸發或蒸餾除去有機溶劑。
對於該方法的第二階段，將含酯產物(III)溶於水中，優選溶於蒸餾水或去離子水中，其中通過在水溶液中用強鹼如氫氧化物處理使含酯聚合物經歷鹼促進的水解。鹼水解通常在約9以上的pH進行，優選pH約10以上，更優選pH約11以上(如約11到約13)。因此，鹼為足夠強以在水溶液中產生處在該範圍內的pH的那些鹼。在一個實施方案中，調節pH為約12到約12.5。優選地，在反應過程中自始至終根據需要加入鹼以保持pH處在該範圍內。鹼還有效地水解任何殘留的酯試劑。
當在水解之後的步驟中用酸中和時，鹼應該產生高水溶性的鹽。優選鹼金屬氫氧化物如氫氧化鈉(NaOH)或氫氧化鉀(KOH)。
還優選使用蒸餾水、或去離子水、或不含可檢測水平的二價陽離子如鈣和鎂離子的水。鹼水解步驟通常在約0-50℃的溫度下進行，優選約10-30℃。反應時間通常為約12到36小時，如約18到24小時。
通過鹼水解產生的聚合物羧酸鹽可以作為鹽分離和儲存，或者優選地，將其通過用酸處理直接轉化為羧酸，如下所述。通常，羧酸比羧酸鹽更適於進一步的衍生化。
將包含羧酸鹽的聚合物用含水酸處理以將鹽轉化為游離酸形式。優選酸為在水溶液中產生非親核陰離子的那些。優選礦物酸(即，無機酸)，如硫酸、硝酸、磷酸、鹽酸等。通常，加入足夠的酸以調節的pH到約1-3，更優選約2-3，其有效將聚合物羧酸鹽轉化為游離酸形式，以及中和(並且轉化為具有無限水溶性的鹽)任何保留在溶液中的鹼。酸化步驟通常在約0℃到約50℃的溫度下進行，優選約10℃到約30℃。
然後使用常規的有機提取步驟分離包含羧酸的聚合物，優選採用滷化溶劑如二氯甲烷或氯仿。將聚合物產物提取到有機相中，而任何水解的試劑和過量的無機酸或其鹽保留在水相中。因此，從聚合物產物分離無機酸是相對簡單的。
將有機提取液乾燥並濃縮，然後使用標準方法將聚合物產物純化。例如，可將聚合物通過沉澱隨後過濾和乾燥而分離。沉澱用溶劑的選擇根據聚合物的性質而定，對於如以下實施例所述的PEG聚合物，乙醚為適當的沉澱用溶劑。還可以使用從溶劑如乙酸乙酯或乙醇重結晶進行純化。
D.反應產物使用本發明的方法，以高純度生產羧基官能化聚合物，其通常具有至少約95重量％、優選至少約96重量％、97重量％、或98重量％，更優選至少約99重量％，和最優選至少約99.5重量％的純度。在選擇的實施方案中，聚合物產物包含至少約99.6重量％、99.7重量％、99.8重量％、或99.9重量％的所需的羧基官能化聚合物。相應地，本文公開的合成方法的產物包含小於5重量％、優選小於4重量％、3重量％、或2重量％、更優選小於1重量％，和最優選小於0.5重量％的起始聚合物(如，mPEG-OH、PEG二醇、或多官能PEG多元醇)或其它聚合物雜質。在選擇的實施方案中，產物包含低於0.4重量％、0.3重量％、0.2重量％、或0.1重量％的聚合物起始原料(如，mPEG-OH)或其它聚合物雜質。
「產物」或「聚合物產物」是指通過進行以上公開的合成過程(包括常規後處理(workup)操作如提取、沉澱和除去溶劑)而得到的物質。如以下實施例中所示，包含本文公開的方法的產物的反應混合物通過用氯化溶劑提取隨後將產物從乙醚沉澱而進行後處理。這些產物的離子交換色譜分析表現出基本上100％的所需的PEG-羧酸產物，沒有可檢測量的起始原料或其它聚合物雜質存在。因此，得到具有上述公開的純度的聚合物產物，而無需除去聚合物雜質如起始原料。這些產物經常可以直接用於進一步衍生化和/或結合，如下所述。該方法的另一個優點在於從廉價的起始原料如mPEG-OH開始提供高純度的聚合物羧酸如mPEG羧酸，與使用市售的聚合物羧酸相比，市售的聚合物羧酸傾向於昂貴且還經常包含殘餘量的聚合物型羥基化合物。
如上所述，本文公開的合成過程中使用的試劑容易地從聚合物產物中被除去。具體地，在該過程中不使用低分子量有機酸如TFA。因此，本發明的包含羧基的聚合物產物不會如使用利用低分子量有機酸試劑的水解法生產的聚合物羧酸中通常發生的那樣含痕量的低分子量有機酸如TFA。因此本發明的產物沒有與如上所述的殘留酸的存在有關的穩定性降低的缺點。例如，以下實施例4中所述的聚合物在-20℃儲存8個月之後沒有表現出降解跡象(通過GPC分析)。
III.適當的水溶性非肽類聚合物在本發明中可使用多種非肽類的水溶性聚合物中的任一種。聚合物應該是無毒的和生物相容的，這是指其能夠與生命組織或有機體共存而不引起危害。適當的聚合物的例子包括但不限於聚(亞烷基二醇)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡硌烷酮)、聚(羥基烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥基烷基甲基丙烯酸酯)、聚(糖)、聚(α-羥基乙酸)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚唑啉、聚(N-丙烯醯基嗎啉)，如在美國專利5,629,384(其被全文併入本文作為參考)中描述的，及其二元共聚物、三元共聚物、和混合物。
聚合物的分子量隨所需的應用、聚合物結構的構型、支化度等的不同而變化。通常，分子量為約100Da到約100,000Da的聚合物可用於本發明中，優選約200Da到約60,000Da，更優選約300Da到約40,000Da。示例性的聚合物實施方案具有約200Da、350Da、550Da、750Da、1,000Da、2,000Da、3,000Da、4,000Da、5,000Da、7,500Da、10,000Da、15,000Da、20,000Da、25,000Da、30,000Da、35,000Da、40,000Da、50,000Da、55,000Da、和60,000Da的分子量。
優選聚合物包括至少一個如本文中所述的能夠在親核取代反應中與攜帶離去基團的叔酯試劑反應的羥基。然而，也可使用能夠與叔酯試劑的官能團反應的其它官能團。這些包括其它親核基團如胺、醯肼(-C(＝O)NHNH2)、和巰基；和親電基團如羧酸酯，包括亞胺酯、原酸酯、碳酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、醛、酮、硫酮、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯醯胺、碸、馬來醯亞胺、二硫化物、碘代、環氧化物、磺酸酯、硫代磺酸酯、矽烷、烷氧基矽烷、滷代矽烷、和氨基磷酸酯。這些基團的更具體例子包括琥珀醯亞胺基酯或碳酸酯、咪唑基酯或碳酸酯、苯並三唑酯或碳酸酯、對硝基苯基碳酸酯、乙烯碸、氯乙基碸、乙烯基吡啶、吡啶基二硫化物、碘乙醯胺、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、和tresylate。還包括其它活化的羧酸衍生物，以及任何上述部分的水合物或被保護的衍生物(如水合醛、半縮醛、縮醛、水合酮、半縮酮、縮酮、硫縮酮、硫縮醛)。優選的親電基團包括琥珀醯亞胺基碳酸酯、琥珀醯亞胺基酯、馬來醯亞胺、苯並三唑碳酸酯、縮水甘油醚、咪唑基酯、對硝基苯基碳酸酯、丙烯酸酯、tresylate、醛、和鄰吡啶基二硫化物。
選擇官能團使得聚合物上的親核基團與叔酯試劑上的親電基團反應，或反之亦然。優選兩個官能團之間的反應為離去基團被親核體置換的反應，但是又可以是例如縮合或加成反應。
優選聚合物包括至少一個親核基團，如羥基。為了便於說明，以下討論羥基，雖然可使用其它官能團。聚合物也可在同一分子內包括不同的官能團。優選地，這些具有類似的官能度，如都是親核的，如羥基和氨基。
優選地，聚合物為聚(乙二醇)(即，PEG)聚合物。如上所述，術語PEG包括處於多種幾何形狀或形式中的任一種下的聚(乙二醇)，包括線型形式、支化或多臂形式(如叉狀PEG或連接於多元醇核心的PEG)、側鏈形PEG或其中具有可降解連接的PEG。
聚合物攜帶的羥基(和/或其它官能團)的數目和位置可以不同。通常，聚合物包括1到約25個羥基，優選1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個羥基。線型聚合物如線型PEG聚合物通常包括一個或兩個羥基，各自位於聚合物鏈的末端。如果PEG聚合物為單官能的(即，mPEG)，則聚合物包括單個羥基。如果PEG聚合物為雙官能的，則聚合物包含兩個羥基，在聚合物鏈的每個末端各有一個，或者其在相對的末端包含單個的羥基和不同的官能團。多臂式或支化聚合物可以包括更多個羥基。
多臂式或支化PEG分子在例如美國專利5,932,462中描述，其被全文併入本文作為參考。一般而言，多臂式或支化聚合物具有從中心分支點伸出的兩個或多個聚合物「臂」，優選其包括具有水解穩定性的連接結構。示例性的支化PEG聚合物為甲氧基聚(乙二醇)二取代的賴氨酸。
在另一個多臂式聚合物的實施方案中，聚合物包括衍生自多元醇或多胺的中心核心分子，中心核心分子提供多個適於將聚合物臂與核心分子共價連接的連接點，從而形成多臂式聚合物結構。根據所需的聚合物臂的數目，多元醇或多胺通常包括3到約25個羥基或氨基，優選3到約10個，最優選3到約8個(如，3、4、5、6、7、或8個)。
多臂式聚合物另外在例如共有的美國專利申請2002/0156047和2002/0156047中描述，其被併入本文作為參考。
或者，PEG聚合物可以包括叉狀PEG。一般而言，具有叉狀結構的聚合物表徵為具有經由從聚合物中的具有水解穩定形的支化點伸出的共價連接而連接於兩個或多個官能團的聚合物鏈。美國專利6,362,254(其內容被併入本文作為參考)公開了能夠用於本發明中的多種分岔形PEG結構。
PEG聚合物也可為具有沿著PEG主鏈長度共價連接的而不是在PEG鏈末端的反應基團(如羥基)的側鏈形PEG分子。側鏈反應基團可以直接連接於PEG主鏈或通過連接部分如亞烷基連接。
可以將不同的聚合物結合在同一聚合物骨架中。例如，處於上述支化結構中的一個或多個PEG分子可以被不同的聚合物類型代替。
聚合物也可被製備為在聚合物骨架中具有一個或多個具有水解穩定性或可降解性的連接。例如，PEG可以被製備為在聚合物骨架中具有容易水解的酯鍵。可以結合的其它可水解降解的連接包括碳酸酯、亞胺、磷酸酯、腙、縮醛、原酸酯、和氨基磷酸酯連接。
術語聚(乙二醇)或PEG包括上述變體中的任一種或全部。通常優選的PEG結構包括線型的單官能的、支化單官能的，和線型、支化或分岔形的雙官能或三官能PEG。
因為末端封端的聚乙二醇起始原料如mPEG(甲氧基-PEG)或bPEG(苄氧基-PEG)可以包含可檢測量的PEG二醇雜質，產生通常難以進行分析或分離的副產物，在一個優選實施方案中，PEG起始原料為共有的美國專利6,448,369中所述的不含二醇的苄氧基-PEG。
IV.羧酸官能化聚合物的進一步衍生化和結合A.綜述如果期望，可以將通過本發明的方法製備的羧酸官能化聚合物進一步修飾，使用本領域中已知的方法形成有用的羧酸的活性衍生物。與包含例如殘留的起始原料聚合物和/或殘留試劑如TFA的現有技術的產物相比較，這種衍生物的製備由於本發明的羧酸官能化聚合物的高純度而變得更為容易。這是顯著的優點，特別是對於藥物產品，因為這種雜質的存在和含量可高度不同，從而引起產品的不可重現性。
因此，其中製備羧酸官能化聚合物的本發明的方法可以另外包括以下步驟(i)對羧酸進行改性以形成活性衍生物和(ii)將活性衍生物與具有相應活性官能團的藥理學相關分子結合。步驟(i)和(ii)可以原地進行，其中使用本領域中已知的多種活化試劑將羧酸轉化為活化衍生物，然後立即使其與被結合的分子反應。
羧酸可被衍生化以形成例如醯滷；醯基假滷化物如醯腈、醯基異氰酸酯、和醯疊氮；中性鹽如鹼金屬或鹼土金屬鹽(如鈣、鈉、或鋇鹽)；酯；酸酐；醯胺；醯亞胺；醯肼；等等。在優選實施方案中，將酸酯化以形成活性酯，如N-琥珀醯亞胺基酯；鄰-、間-、或對-硝基苯基酯；1-苯並三唑基酯、咪唑基酯、或N-磺基琥珀醯亞胺基酯。
在一個實施方案中，另外的衍生化聚合物是具有以下結構的PEG聚合物mPEG-O-(CR1R2)n-C(＝O)-Z(V)其中R1、R2和n如上所述。優選Z部分選自滷代、氨基、取代氨基、-NCO、-NCS、-N3、-CN、和-OR′，其中R′選自N-琥珀醯亞胺基、硝基苯基、苯並三唑基、咪唑基、N-磺基琥珀醯亞胺基、N-鄰苯二甲醯亞胺基、N-穀氨醯亞胺基、N-四氫鄰苯二甲醯亞胺基、N-降冰片烯-2，3-二碳醯亞胺基、和羥基-7-氮雜苯並三唑基。
通過本發明的方法生產的含羧基的聚合物、或其活性衍生物可用於與生物活性分子形成結合物，生物活性分子特別是攜帶親核官能團如氨基、羥基、或硫羥(硫醇)基團的生物活性分子。
經常地，要結合的分子為蛋白質。蛋白質通過活性胺基酸結合，如賴氨酸、組氨酸、精氨酸、門冬氨酸、穀氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、N-末端的氨基、和C-末端的羧酸。糖基化蛋白質上的糖部分也可作為結合部位。對於與活化羧酸的反應，最適當的基團為N-末端氨基；賴氨酸、組氨酸、和精氨酸上的包含胺的側鏈；絲氨酸、蘇氨酸、和酪氨酸上的包含羥基的側鏈；和半胱氨酸上的硫醇側鏈。
雖然本發明的包含羧基的聚合物的結合的優選方法採用與要結合的分子上的親核基團反應的活化羧酸衍生物，還有可能將末端羧基衍生化，以包含任何種類的官能團。例如，在一個實施方案中，上述結構(V)中的Z部分具有結構-NHR6，其中R6為包含活性官能團(如醛、馬來醯亞胺、巰基、羥基、氨基等)的有機基團，該官能團通過亞烷基鏈(如，C1-C6)和任選的另外的連接體如短的PEG鏈和另一個亞烷基鏈(如，亞烷基-PEG-亞烷基)與氮原子分離。
B.示例性的結合方法這種聚合物結合物可以使用用於將活化聚合物如活化的PEG與生物活性劑共價連接的已知技術形成。參見例如，Poly(ethylene glycol)Chemisty and Biological Applications，J.M.Harris和S.Zalipsky編著，American Chemical Society，Washington，DC(1997)或BioconjugateTechniques，G.T.Hermanson，Academic Press(1996)。通常，結合反應通常在緩衝液如磷酸鹽或乙酸鹽緩衝液中在室溫或接近室溫的溫度進行，雖然條件隨要進行的具體反應的不同而變化。通常將過量的聚合物試劑與活性劑合併。然而，在某些情況中，優選在聚合物試劑和在活性劑上具有化學計量的量的反應基團。
結合反應的進展可以通過SDS-PAGE、MALDI-TOF、質譜法、或任何其它適當的分析方法監控。一旦相對於形成的結合物的量或剩餘的非結合的聚合物的量達到坪值，則認為反應完成。如有需要，使用已知方法將產物混合物純化，以分離過量的試劑、非結合的反應物(如活性劑)、不希望有的多結合物質、和/或未反應的聚合物。
例如可以使用凝膠過濾色譜法分離具有不同分子量的結合物。級分可以通過多種不同的方法進行分析，如(i)用於蛋白質含量的在280nm的OD、(ii)BSA蛋白質分析、(iii)用於PEG含量的碘試驗(Sims等人，Anal.Biochem.，10760-63，1980)、或(iv)SDS-PAGE，隨後用碘化鋇進行染色。
位置異構體(即具有連接在分子上不同位置的聚合物的具有相同或基本上相同分子量的結合物)的分離可以通過反相HPLC或離子交換色譜法進行。
可以將結合產物在有或沒有殘留的緩衝液存在下凍幹用於儲存。在有些情況下，優選將用於結合的緩衝液如乙酸鈉交換為可以在冷凍乾燥過程中被容易地除去的揮發性緩衝液如碳酸銨或乙酸銨。或者，緩衝液更換步驟可使用製劑緩衝液進行，使得凍幹後的結合物處於適合於重構在製劑緩衝液中並最終用於對哺乳動物給藥的形式。
C.用於結合的示例性藥劑用於與通過本發明的方法形成的聚合物結合的生物活性劑可為以下的任何一種或多種。適當的藥物可選自例如安眠藥和鎮靜劑、精神興奮劑、安定藥、呼吸藥物、抗驚厥藥、肌肉鬆弛藥、抗帕金森藥(多巴胺拮抗劑)、鎮痛藥、抗炎藥、抗焦慮藥(抗焦慮劑)、食慾抑制劑、抗偏頭痛藥、肌肉收縮藥(muscle contractants)、抗感染藥(抗生素、抗病毒藥、抗真菌劑、疫苗)、抗關節炎藥、抗瘧藥、止吐藥、抗癲癇藥(anepileptics)、支氣管擴張藥、細胞因子、生長因子、抗癌藥、抗血栓形成藥、抗高血壓藥、心血管藥物、抗心律失常藥、抗氧化劑、抗哮喘藥、激素藥物包括避孕藥、擬交感神經藥、利尿藥、脂類調節劑、抗雄激素藥、抗寄生蟲藥、抗凝血劑、抗瘤形成藥、抗腫瘤藥、血糖過低用藥、營養劑和增補劑、生長增補劑、抗腸炎藥、疫苗、抗體、診斷劑、和造影劑。
更具體地，可將活性劑分成多個結構類別中的一類，包括但不限於小分子、肽、多肽、蛋白質、抗體、多糖、甾族化合物、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、脂肪、電解質等。優選地，用於與本發明的包含羧基的聚合物結合的活性劑具有未加修飾的氨基、羥基、或硫羥，或者經過修飾以包含至少一個這種基團。
活性劑的具體例子包括但不限於門冬醯胺酶(aspariginase)、amdoxovir(DAPD)、抗排卵肽、貝卡普勒明、降鈣素、cyanovirin、denileukin diftitox、紅細胞生成素(EPO)、EPO激動劑(如約10-40個胺基酸長度並且包括如WO 96/40749中所述的特定核序列的肽)、αdornase、紅細胞生成刺激蛋白(NESP)、凝血因子如凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XII、凝血因子XIII、von Willebrand因子；ceredase、伊米苷酶、α-葡糖苷酶、膠原蛋白、環孢菌素、α防衛素、β防衛素、exedin-4、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、促血小板生成素(TPO)、α-1蛋白酶抑制因子、依降鈣素、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)、纖維蛋白原、非格司亭、生長激素、人生長激素(hGH)、生長激素釋放激素(GHRH)、GRO-β、GRO-β抗體、骨形態蛋白如骨形態蛋白-2、骨形態蛋白-6、OP-1；酸性成纖維細胞生長因子、鹼性成纖維細胞生長因子、CD-40配體、肝素、人血清白蛋白、低分子量肝素(LMWH)、幹擾素如幹擾素α、幹擾素β、幹擾素γ、幹擾素ω、幹擾素τ、複合幹擾素；白細胞介素和白細胞介素受體如白細胞介素-1受體、白細胞介素-2、白細胞介素-2融合蛋白、白細胞介素-1受體拮抗劑、白細胞介素-3、白細胞介素-4、白細胞介素-4受體、白細胞介素-6、白細胞介素-8、白細胞介素-12、白細胞介素-13受體、白細胞介素-17受體；乳鐵蛋白(lactoferrin)和乳鐵蛋白片段、促黃體素釋放激素(LHRH)、胰島素、前胰島素、胰島素類似物(如單醯化的胰島素，如美國專利5,922,675中所述的)、支化澱粉、C-肽、生長抑素、生長抑素類似物包括奧曲肽、加壓素、促卵泡激素(FSH)、流行性感冒疫苗、胰島素樣生長因子(IGF)、insulintropin、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、纖維蛋白溶酶原活化劑如阿替普酶、尿激酶、瑞替普酶、鏈激酶、帕米普酶、蘭替普酶、和teneteplase、神經生長因子(NGF)、osteoprotegerin、血小板衍生生長因子、組織生長因子、轉化生長因於-1、血管內皮細胞生長因子、白血病抑制因子、角質形成細胞生長因子(KGF)、神經膠質生長因子(GGF)、T細胞受體、CD分子/抗原、腫瘤壞死因子(TNF)、單核細胞趨化蛋白-1；內皮生長因子、甲狀旁腺激素(PTH)、胰高血糖素樣肽、生長激素、胸腺素α1、胸腺素α1 IIb/IIIa抑制劑、胸腺素β10、胸腺素β9、胸腺素β4、α-1抗胰蛋白酶、磷酸二酯酶(PDE)化合物、VLA-4(非常晚期抗原-4)、VLA-4抑制劑、雙磷酸酯類(bisphosponates)、呼吸道合胞病毒抗體、囊纖維化跨膜調節劑(CFTR)基因、脫氧核糖核酸酶(Dnase)、殺菌/滲透性增加蛋白(BPI)、和抗CMV抗體。示例性的單克隆抗體包括依那西普(二聚的融合蛋白，其包括連接於IgG1的Fc部分的人類75kDTNF受體的細胞外配體結合部分)、阿昔單抗、afeliomomab、巴利西單抗、達利珠單抗、英利昔單抗、替伊莫單抗(ibritumomab tiuexetan)、米妥莫單抗、莫羅單抗-CD3、碘131-託西奠單抗結合物、奧立珠單抗、利妥西單抗、和曲妥珠單抗(herceptin)。
適於與聚合物共價連接的另外的藥物包括氨磷汀、胺碘酮、氨基己酸、氨基馬尿酸鈉、氨魯米特、氨基乙醯丙酸、氨基水楊酸、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、門冬醯胺酶、anthracycline、蓓薩羅丁、比卡魯胺、博來黴素、布舍瑞林、白消安、卡麥角林、卡培他濱、卡鉑、卡莫司汀、chlorambucin、西司他丁鈉、順鉑、克拉屈濱、氯屈膦酸二鈉、環磷醯胺、環丙孕酮、阿糖胞苷、喜樹鹼、13-順式視黃酸、全反式視黃酸；達卡巴嗪、更生黴素、柔紅黴素、去鐵胺、地塞米松、雙氯芬酸、己烯雌酚、多西他賽、多柔比星、表柔比星、雌莫司汀、依託泊苷、依西美坦、非索非那定、氟達拉濱、氟氫可的松、氟尿嘧啶、氟甲睪酮、氟他胺、吉西他濱、腎上腺素、左旋多巴、羥基脲、伊達比星、異環磷醯胺、伊馬替尼、伊立替康、伊曲康唑、戈舍瑞林、來曲唑、亞葉酸、左旋咪唑、賴諾普利、左甲狀腺素鈉、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、甲羥孕酮、甲地孕酮、美法侖、巰嘌呤、重酒石酸間羥胺、甲氨蝶呤、甲氧氯普胺、美西律、絲裂黴素、米託坦、米託蒽醌、納洛酮、尼古丁、尼魯米特、奧曲肽、奧沙利鉑、pamidronate、噴司他丁、pilcamycin、卟吩姆、潑尼松、丙卡巴肼、丙氯拉嗪、昂丹司瓊、雷替曲塞、西羅莫司、鏈佐星、他克莫司、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睪酮、四氫大麻醇、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、拓撲替康、全反視黃酸、valrubicin、長春鹼、長春新鹼、長春地辛、長春瑞濱、多拉司瓊、格拉司瓊；福莫特羅、氟替卡松、利普安醋酸亮內瑞林、咪達唑侖、阿普唑侖、兩性黴素B、podophylotoxins、核苷抗病毒藥、芳醯基腙、舒馬普坦；大環內酯類如紅黴素、竹桃黴素、醋竹桃黴素、羅紅黴素、克拉黴素、達發新、阿奇毒素、氟紅黴素、地紅黴素、交沙黴素、螺旋黴素、麥迪黴素、白黴素、米歐卡黴素、羅他黴素、andazithromycin、和swinolide A；氟喹諾酮類如環丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、曲伐沙星、阿拉曲沙星、moxifloxicin、諾氟沙星、依諾沙星、格帕沙星、加替沙星、洛美沙星、司帕沙星、替馬沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氟羅沙星、託氟沙星、普盧利沙星、伊洛沙星、帕珠沙星、克林沙星、和西他沙星；氨基糖苷類如慶大黴素、奈替米星、草履蟲素、妥布黴素、阿米卡星、卡那黴素、新黴素、和鏈黴素、萬古黴素、替考拉寧、rampolanin、麥地拉寧、多粘菌素E、達託黴素、短桿菌肽、甲磺酸粘菌素；多粘菌素如多粘菌素B、捲曲黴素、桿菌肽、penems；青黴素，包括青黴素酶敏感的藥物如青黴素G、s青黴素V；青黴素酶耐受性藥物如甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林、萘夫西林；革蘭氏陰性微生物活性劑如氨苄西林、阿莫西林、和海他西林、cillin、和galampicillin；抗假單胞菌青黴素如羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、和哌拉西林；頭孢菌素如頭孢泊肟、頭孢丙烯、ceftbuten、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢噻吩、頭孢匹林、頭孢氨苄、cephradrine、頭孢西丁、頭孢孟多、頭孢唑林、頭孢噻啶、頭孢克洛、頭孢羥氨苄、頭孢來星、頭孢呋辛、頭孢雷特、頭孢噻肟、頭孢曲秦、頭孢菌素VII、頭孢吡肟、頭孢克肟、頭孢尼西、頭孢哌酮、頭孢替坦、頭孢美唑、頭孢他啶、氯碳頭孢、和拉氧頭孢；單環β內醯胺如氨曲南；和碳青黴烯類如亞胺培南、美羅培南、羥基乙磺酸噴他脒、硫酸沙丁胺醇、利多卡因、硫酸奧西那林、倍氯米松diprepionate、曲安西龍乙醯胺、布地奈德丙酮化物、氟替卡松、異丙託溴銨、氟尼縮松、色甘酸鈉、和酒石酸麥角胺；紫杉烷如紫杉醇；SN-38、和酪氨酸磷酸化抑制劑。
上述示例性的生物活性劑包括適當的類似物、激動劑、拮抗劑、抑制劑、異構體、及其可藥用鹽形式。關於肽和蛋白質，本發明包括合成的、重組的、未加修飾的、糖基化的、和非糖基化的形式，以及其生物活性片段。上述生物活性的蛋白質另外包括具有一個或多個胺基酸被取代(如半胱氨酸)、刪除等的變體，以及具有至少某種程度的母體(未加修飾的)蛋白質的活性的得到的變體蛋白質。
V.藥用組合物和給藥方法本發明還包括藥物製劑，其包括與藥物賦形劑組合的本文提供的結合物。示例性的賦形劑包括但不限於選自碳水化合物、抗微生物劑、抗氧化劑、表面活性劑、緩衝液、及其組合的那些。
碳水化合物如糖、衍生化的糖如糖醇、醛糖酸、酯化的糖、和/或可作為賦形劑存在的糖聚合物。具體的碳水化合物賦形劑包括例如單糖如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖如棉子糖、松三糖、麥芽糖糊精、右旋糖酐、澱粉等；和糖醇如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡萄糖醇)、吡喃碳基山梨糖醇、肌醇等。
賦形劑還可包括無機鹽或緩衝劑如檸檬酸、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硝酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、及其組合。
製劑也可包括抗微生物劑，用於預防或阻止微生物生長。適用於本發明的抗微生物劑的非限制性例子包括苯扎氯銨、苄索氯銨、苯甲醇、西吡氯銨、三氯叔丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、thimersol、及其組合。
抗氧化劑也可以存在於製劑中。抗氧化劑用於預防氧化，從而預防製劑的結合物或其它組分的變質。用於本發明的適當的抗氧化劑包括例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基茴香醚、丁基化羥基甲苯、次磷酸、單硫代甘油、沒食子酸丙基酯、亞硫酸氫鈉、甲醛合次硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、及其組合。
表面活性劑可作為賦形劑存在。示例性的表面活性劑包括聚山梨醇酯如「吐溫20」和「吐溫80」和pluronics如F68和F88(都得自BASF，Mount Olive，New Jersey)；脫水山梨醇酯；脂質如磷脂如卵磷脂和其它磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺(雖然優選不是脂質體形式)、脂肪酸和脂肪酸酯；甾體如膽固醇；和螯合劑如EDTA、鋅和其它這種適當的陽離子。
酸或鹼可作為製劑中的賦形劑存在。可使用的酸的非限制性例子包括選自鹽酸、乙酸、磷酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富馬酸、及其組合的那些。適當的鹼的例子包括但不限於選自氫氧化鈉、乙酸鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀、乙酸銨、乙酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸鈉、甲酸鈉、硫酸鈉、硫酸鉀、富馬酸鉀、及其組合的鹼。
藥物製劑包括所有類型的製劑，特別是適合於注射的那些，如可以被重新組成的粉末、以及懸浮液和溶液。組合物中結合物(即，活性劑與本文中所述的聚合物之間形成的結合物)的量隨許多因素而變化，但是最佳地為在將組合物儲存在單位劑量容器(如小瓶)中時為治療有效劑量。另外，可以將藥物製劑容納在注射器中。治療有效劑量可以用實驗方法測定，通過重複給藥遞增量的結合物以測定產生臨床上所需的終點的量。
組合物中任何單獨的賦形劑的量隨賦形劑的活性和對組合物的具體需要而變化。通常，任何單獨的賦形劑的最佳用量通過常規實驗測定，即，通過製備包含不同量(從低到高的)賦形劑的組合物考查穩定性和其它參數，然後測定實現最佳性能而沒有顯著副作用的範圍。然而，通常，賦形劑以約1重量％到約99重量％的量存在於組合物中，優選約5重量％-98重量％、更優選約15-95重量％的賦形劑，最優選低於30重量％的濃度。
前述藥物賦形劑及其它在RemingtonThe Science Practice ofPharmacy，第19版，Williams Williams，(1995)；the Physician′s DeskReference，第52版，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)；和Kibbe，A.H.，Handbook of Pharmaceutical Excipients，第三版，AmericanPharmaceutical Association，Washington，D.C.，2000中有所描述。
本發明的藥物製劑通常(但不一定)通過注射給藥，並且因此通常為在即將給藥之前製成液體溶液或懸浮液。藥物製劑又可以採取其它形式如糖漿劑、霜劑、膏劑、片劑、粉末等。給藥的其它方式還包括如經肺、直腸、透皮、透黏膜、經口、鞘內、皮下、動脈內等。用於非腸道給藥的適當的製劑類型特別地包括即用型(ready-for-)注射溶液、用於使用之前與溶劑組合的乾粉、即用型注射懸浮液、用於在使用之前與介質組合的乾燥不溶性組合物、和用於在給藥之前稀釋的乳劑和液態濃縮物。
本發明還提供用於將本文提供的結合物對患者給藥的方法，所述患者患有對用結合物處理敏感的狀況，通過本領域技術人員測定。該方法包括給藥(通常通過注射)治療有效量的結合物，優選作為藥物製劑的一部分提供。
給藥的實際劑量隨主體的年齡、體重和一般狀況；以及治療的狀況的嚴重程度；護理專業人員的判斷；和給藥的結合物而變化。具體藥物的治療有效量為本領域技術人員已知的並且在相關的參考教科書和文獻中描述。通常，結合物的治療有效量為約0.001mg到100mg，優選0.01mg/天到75mg/天的劑量，更優選0.10mg/天到50mg/day的劑量。任何給定結合物(同樣，優選作為藥物製劑的一部分提供)的單位劑量可以不同的劑量給藥時間表給藥，根據臨床醫師的判斷、患者的需要等而定。
實施例提供以下實施例用於說明本發明，但是不應將其看作是對本發明的限制。例如，雖然在實施例中使用PEG，但是如上所述，本發明包括使用其它水溶性的非肽類聚合物。
這些實施例中所有的PEG試劑都得自Nektar AL，Huntsville，AL。所有的NMR數據都由Bruker生產的300或400MHz NMR波譜儀產生。
實施例1說明mPEG-OH與溴乙酸叔丁酯在鹼的存在下的反應形成叔丁酯封端的聚合物。之後，聚合物經過使用NaOH作為鹼的鹼促進的水解，隨後用磷酸酸化，從而形成最終的羧酸封端的聚合物。
實施例2和3舉例說明雙官能PEG起始原料(PEG二醇；HO-PEG-OH)的類似反應。實施例4說明基於季戊四醇核心並且具有四個活性羥基(在每個PEG「臂」的末端有一個羥基)的多官能的4臂式PEG起始原料的反應。
實施例1mPEG(30,000)-羧酸通過從含mPEG-30,000(50g，0.00167摩爾)(NOF Corporation)的甲苯(600ml)溶液中蒸除300ml甲苯對該溶液進行共沸乾燥。加入叔丁醇(70ml)、叔丁醇鉀(95％，1.75g，0.0148摩爾，8.9倍過量)和溴乙酸叔丁酯(3.3g，0.0169摩爾，10.1倍過量)，混合物在45℃下在氬氣氣氛下攪拌過夜。減壓蒸除溶劑，並將殘餘物溶於蒸餾水(1000ml)中。
用1M氫氧化鈉調節水溶液的pH到12，並將溶液攪拌18小時，通過定期加入1M氫氧化鈉保持pH 12。
用5％磷酸調節pH到3，並將產物用二氯甲烷提取。將提取液用無水硫酸鎂乾燥並加入到乙醚中。將沉澱的產物過濾並減壓乾燥，得到46.6g的產量。
NMR(d6-DMSO)3.24ppm(s，-OCH3)，3.51ppm(s，PEG主鏈)，4.01ppm(s，-CH2-COO-)。
陰離子交換色譜分析mPEG(30,000)-羧酸100％。這個分析表明在用乙醚沉澱的產物中基本上沒有起始原料或其它聚合物雜質。
實施例2PEG(10,000-二羧酸將PEG-10,000(35.25g，0.00705eq)(NOF Corporation)(在兩端由羥基封端)溶於甲苯(600ml)中並通過蒸除甲苯進行共沸乾燥。將殘餘物再溶解在無水甲苯(500ml)中。將叔丁醇(40ml)、叔丁醇鉀(4g，0.0356摩爾，5.1倍過量)和無水甲苯(40ml)合併並加入到上述反應混合物中，隨後攪拌約3.5小時。加入溴乙酸叔丁酯(7ml，0.0474摩爾，6.7倍過量)並將混合物在40℃下在氬氣氣氛下攪拌過夜。減壓蒸除溶劑，並將殘餘物溶於蒸餾水(1000ml)中。
用1M氫氧化鈉調節水溶液的pH到12.1，並將溶液攪拌過夜，通過定期加入1M氫氧化鈉保持pH 12.1。
用1M鹽酸調節pH到1.0，並將產物用二氯甲烷提取。提取液用無水硫酸鈉乾燥，濃縮並加入到乙醚中。將沉澱的產物過濾並減壓乾燥，得到33g。
NMR(d6-DMSO)3.51ppm(s，PEG主鏈)，4.01ppm(s，-CH2-COO-)。
陰離子交換色譜分析PEG(10,000)-二羧酸100％。
實施例3PEG(5,000)-二羧酸通過蒸除乙腈對PEG-5,000(35g，0.01400當量)(NOF Corporation)的乙腈(800ml)溶液進行共沸乾燥，將殘餘物再溶解在無水甲苯(300ml)中。將叔丁醇(50ml)、叔丁醇鉀(4.7g，0.0419摩爾，2.99倍過量)和無水甲苯(50ml)合併並加入到上述反應混合物中，隨後攪拌約3.5小時。加入溴乙酸叔丁酯(7.2ml，0.0488摩爾，3.48倍過量)並將混合物在室溫下在氬氣氛下攪拌20小時。減壓蒸除溶劑，並將殘餘物溶於蒸餾水(1000ml)中。
用1M氫氧化鈉調節水溶液的pH到12.0，並將溶液攪拌過夜，通過定期加入1M氫氧化鈉保持pH 12.0。
用1M鹽酸調節pH到2.0，並將產物用二氯甲烷提取。提取液用無水硫酸鈉乾燥，濃縮並加入到乙醚中。將沉澱的產物過濾並減壓乾燥，得到32g。
NMR(d6-DMSO)3.51ppm(s，PEG主鏈)，4.01ppm(s，-CH2-COO-)。
陰離子交換色譜分析PEG(5,000)-二羧酸100％。
實施例44臂-PEG(10,000)-四羧酸通過在80℃下在減壓下蒸除1,000ml甲苯對多臂式PEG(4-臂)，MW 10kDa(Nektar，Huntsville AL)(160g，0.064當量)的甲苯(2,300ml)溶液進行共沸乾燥。在另一個容器中，將叔丁醇(17.3ml)和叔丁醇鉀(7.18g，0.128摩爾，2.00倍過量)混合，然後加入到上述經乾燥的甲苯溶液中。將得到的溶液在45℃攪拌約3.5小時。加入溴乙酸叔丁酯(20.8ml，0.141摩爾，2.20倍過量)並將混合物在45℃下在氬氣氣氛下攪拌12小時。減壓蒸除溶劑，並將殘餘物溶於蒸餾水(1,600ml)中。
用1M氫氧化鈉調節水溶液的pH到12.0，將溶液攪拌17小時，同時通過定期加入1M氫氧化鈉保持pH 12.0。
然後用1M磷酸調節pH到1.5，並將產物用二氯甲烷提取。提取液用無水硫酸鈉乾燥，濃縮並加入到乙醚中。將沉澱的產物過濾並減壓乾燥，得到15.5g。
NMR(d6-DMSO)3.51ppm(s，PEG主鏈)，4.01ppm(s，-CH2-COO-)，取代100％。
在-20℃儲存8個月之後，GPC分析與原來的產物相同。因此，在儲存過程中沒有發生可檢測的降解。
通過前述說明書的教導本發明所述領域的技術人員可想出本發明的許多改進和其它實施方案。因此，本發明不限於公開的具體實施方案，並且改進和其它實施方案意在被包括在權利要求的範圍內。
權利要求
1.製備用羧基官能化的水溶性非肽類聚合物的方法，該方法包括i)使酯試劑R(C＝O)OR′，其中R′為叔基且R包括官能團X，與水溶性非肽類聚合物POLY-Y反應形成聚合物的叔酯，其中Y為與X反應形成共價鍵的官能團；和ii)在水溶液中用強鹼處理聚合物的叔酯，形成聚合物的羧酸鹽。
2.權利要求1的方法，其另外包括iii)在水溶液中用無機酸處理聚合物的羧酸鹽，將羧酸鹽轉化為羧酸，從而形成羧酸官能化聚合物。
3.權利要求1或2的方法，其中X為離去基團並且Y為羥基。
4.權利要求1或2的方法，其中所述強鹼為鹼金屬氫氧化物。
5.權利要求1或2的方法，其中所述用強鹼處理有效產生約11到13的反應pH。
6.權利要求2的方法，其中所述無機酸為在水溶液中產生非親核性陰離子的酸。
7.權利要求6的方法，其中酸選自硫酸、硝酸、磷酸、和鹽酸。
8.權利要求1的方法，其中叔酯試劑具有以下結構 其中X為離去基團；R1和R2各自獨立地選自氫、烷基、環烷基、烷氧基、芳基、芳烷基、和雜環；R3-R5各自獨立地選自低級烷基、芳基、芳烷基、和環烷基，其中任何的R3-R5可結合形成環或環系統；其中R1到R5的任一個，除了氫之外，可被選自低級烷基、低級烷氧基、C3-C6環烷基、滷代、氰基、氧代(酮)、硝基、和苯基取代；和n為1到約24。
9.權利要求8的方法，其中n為1到6。
10.權利要求9的方法，其中n為1或2。
11.權利要求8-10中任一項的方法，其中R1和R2各自獨立地為氫或未取代的低級烷基，並且R3到R5各自獨立地為未取代的低級烷基或苯基。
12.權利要求8-10中任一項的方法，其中R1和R2各自獨立地為氫或甲基，並且R3到R5各自獨立地為甲基、乙基、或苯基。
13.權利要求12的方法，其中R1和R2各自為H並且n為1。
14.權利要求13的方法，其中叔酯試劑為滷代乙酸叔丁酯。
15.權利要求1或2的方法，其中聚合物選自聚(亞烷基二醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羥基烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥基烷基甲基丙烯酸酯)、聚(糖)、聚(α-羥基乙酸)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚唑啉、聚(N-丙烯醯基嗎啉)、及其二元共聚物或三元共聚物。
16.權利要求15的方法，其中聚合物為聚(乙二醇)。
17.權利要求16的方法，其中聚(乙二醇)為線型的並且在一端被所述官能團Y封端以及在另一端被另一官能團Y′或封端基團封端。
18.權利要求2的方法，其另外包括將羧酸轉化為活化的羧酸衍生物。
19.權利要求18的方法，其中所述衍生物為活化酯。
20.權利要求18的方法，其另外包括通過使所述羧酸衍生物與生物活性分子上的官能團反應使所述聚合物與所述分子結合。
21.權利要求20的方法，其中羧酸衍生物為活化酯，並且所述分子上的官能團為親核基團。
22.權利要求21的方法，其中所述親核基團為氨基、羥基、或硫羥。
23.製備用羧基官能化的聚(乙二醇)(PEG)的方法，該方法包括i)使叔酯試劑R(C＝O)OR′，其中R′為叔烷基並且R包括官能團X，與聚合物PEG-Y反應形成PEG叔酯，其中Y為與X反應形成共價鍵的官能團；和ii)在水溶液中用強鹼處理PEG叔酯，形成PEG羧酸鹽。
24.權利要求23或24的方法，其進一步包括iii)在水溶液中用無機酸處理PEG羧酸鹽，將羧酸鹽轉化為羧酸，從而形成PEG羧酸。
25.權利要求23或24的方法，其中X為離去基團並且Y為羥基。
26.權利要求23的方法，其中所述強鹼為鹼金屬氫氧化物。
27.權利要求24的方法，其中酸選自硫酸、硝酸、磷酸、和鹽酸。
28.權利要求23的方法，其中叔酯試劑具有以下結構 其中X為離去基團；R1和R2各自獨立地選自氫、烷基、環烷基、烷氧基、芳基、芳烷基、和雜環；R3-R5各自獨立地選自低級烷基、芳基、芳烷基、和環烷基，其中任何的R3-R5可結合形成環或環系統；其中R1到R5中的任一個，除了氫之外，可被選自低級烷基、低級烷氧基、C3-C6環烷基、滷代、氰基、氧代(酮)、硝基、和苯基取代；和n為1到約24。
29.權利要求28的方法，其中n為1到6。
30.權利要求29的方法，其中n為1或2。
31.權利要求28-30中任一項的方法，其中R1和R2各自獨立地為氫或未取代的低級烷基，並且R3到R5各自獨立地為未取代的低級烷基或苯基。
32.權利要求28-30中任一項的方法，其中R1和R2各自為H並且n為1。
33.權利要求32的方法，其中叔酯試劑為滷代乙酸叔丁酯。
34.權利要求23、24或33中任一項的方法，其中聚(乙二醇)為線型的並且在一端被所述官能團Y封端以及在另一端被另一官能團Y′或封端基團封端。
35.權利要求中23、24或33中任一項的方法，其中PEG的分子量為約100到約100,000Da。
36.權利要求35的方法，其中PEG的分子量為約300到約60,000Da。
37.權利要求24的方法，其另外包括將PEG-羧酸轉化為活化的羧酸衍生物。
38.權利要求37的方法，其中所述衍生物為活化酯。
39.權利要求37的方法，其另外包括通過使所述羧酸衍生物與生物活性分子上的官能團反應使所述PEG與所述分子結合。
40.通過權利要求2的方法生產的包括羧酸官能化聚合物的分離的聚合物產物，其中產物包含低於5重量％的所述POLY-Y聚合物，餘量基本上由所述羧酸官能化聚合物組成。
41.權利要求40的聚合物產物，其包含低於2重量％的所述POLY-Y聚合物。
42.權利要求40的聚合物產物，其包含低於0.5重量％的所述POLY-Y聚合物。
43.權利要求40-42中任一項的聚合物產物，其基本上不含低分子量有機酸。
44.權利要求40-42中任一項的聚合物產物，其基本上不含單體有機羧酸。
45.權利要求40-42中任一項的聚合物產物，其基本上不含三氟乙酸。
46.權利要求40的聚合物產物，其中所述羧酸官能化聚合物為PEG羧酸。
47.權利要求46的聚合物產物，其中所述羧酸官能化聚合物為mPEG-CH2-COOH，並且所述聚合物產物包含低於5重量％的mPEG-OH。
48.權利要求47的聚合物產物，其包含低於2重量％的mPEG-OH。
49.權利要求48的聚合物產物，其包含低於0.5重量％的mPEG-OH。
50.權利要求47-49中任一項的聚合物產物，其基本上不含三氟乙酸。
51.權利要求46的聚合物產物，其中所述羧酸官能化聚合物為HOOC-CH2-PEG-CH2-COOH，並且所述聚合物產物包含低於5重量％的HO-PEG-OH。
52.權利要求51的聚合物產物，其包含低於0.5重量％的HO-PEG-OH。
53.權利要求51或52的聚合物產物，其基本上不含三氟乙酸。
54.權利要求46的聚合物產物，其中所述羧酸官能化聚合物為由PEG-(CH2-COOH)x表示的多官能支化或多臂式羧酸官能化PEG，其中x為3到8，並且所述產物包含低於5重量％的PEG-(OH)x。
55.權利要求54的聚合物產物，其基本上不含三氟乙酸。
56.在通過使叔酯試劑R(C＝O)OR′，其中R′為叔烷基基團並且R包括官能團X，與聚合物PEG-Y反應，其中Y為與X反應形成共價鍵的官能團，形成PEG叔酯，製備用羧基官能化的聚(乙二醇)(PEG)聚合物的方法中，包括以下的改進措施在水溶液中用強鹼處理PEG叔酯，形成PEG羧酸鹽。
57.權利要求56的改進措施，其中所述改進措施進一步包括在水溶液中用無機酸處理PEG羧酸鹽，將羧酸鹽轉化為羧酸，從而形成PEG羧酸。
58.權利要求56的改進措施，其中所述強鹼為鹼金屬氫氧化物。
59.權利要求56的改進措施，其中所述用強鹼處理有效產生約11到13的反應pH。
60.權利要求57的改進措施，其中酸選自硫酸、硝酸、磷酸、和鹽酸。
全文摘要
本發明公開了製備攜帶羧基官能團水溶性非肽類聚合物，特別是羧酸官能化的聚(乙二醇)(PEG)聚合物的方法，以及這些方法的產物。通常，使酯試劑R(C＝O)OR′(其中R′為叔基並且R包括官能團X)與水溶性非肽類聚合物POLY－Y(其中Y與X反應形成共價鍵的官能團)反應形成聚合物的叔酯，然後在水溶液中用強鹼處理聚合物的叔酯形成聚合物的羧酸鹽。通常，然後在水溶液中用無機酸處理該羧酸鹽，將羧酸鹽轉化為羧酸，從而形成羧酸官能化聚合物。
文檔編號C08F261/04GK1902257SQ200480039882
公開日2007年1月24日 申請日期2004年11月5日 優先權日2003年11月6日
發明者米爾頓·J·哈裡斯, 安東尼·科茲洛夫斯基, 郭力宏 申請人:阿拉巴馬耐科塔醫藥公司