一種植物病毒檢測基因晶片的製作方法
2023-10-26 01:56:47 1
專利名稱：一種植物病毒檢測基因晶片的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物病毒檢測基因晶片，更具體地說涉及一種利用基因晶片檢測樣品中是否含有植物病毒的方法、用於PCR的新的核酸引物以及用於檢測PCR產物的探針。
背景技術：
植物病毒是一種普遍存在的病害因素，植物病毒侵染給農業帶來嚴重的經濟損失同時也是農業可持續發展的瓶頸因素之一。目前，全球每年由植物病毒造成的農作物直接損失為200多億美元，其中對中國造成高達幾百億人民幣的損失，這還不包括地方特有的經濟作物、野生和半野生資源型植物，以及為了控制病毒病所做出的努力和代價，也不包括植物病毒引起作物品質下降造成的間接損失。我國的作物種植業、園藝業、藥材生產行業也受到植物病毒的嚴重影響，例如苜蓿花葉病毒(AlMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、PVA(馬鈴薯A病毒)、馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯帚頂病毒(PMTV)、馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)、馬鈴薯V病毒(PVV)、馬鈴薯M病毒(PVM)和馬鈴薯紡錐塊莖類病毒(PSTVD)以及香蕉束頂病毒(BBTV)、百合無症病毒(LSV)、南瓜花葉病毒(SqMV)、柑橘裂皮類病毒(CEVD)、蘋果莖溝病毒(ASGV)、桃X植原體(PXP)、PVS(馬鈴薯S病毒)、百合斑駁病毒(LMoV)、芋花葉病毒(DsMV)、小西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV)、西瓜花葉病毒(WMV)、香石竹環斑病毒(CRSV)、椰子死亡類病毒(CCCVd)、李壞死環斑病毒(PNRSV)、南方菜豆花葉病毒(SBMV)、菸草環斑病毒(TRSV)，造成巨大直接經濟損失和行業信譽下降。由於缺少可行的快速檢測方法，對植物病毒病害控制束手無策；另外在引進國外種子苗木時，只能引進來自非疫區的，從而影響了優質種苗的進口；同時，由於海關檢疫，國家口岸檢疫缺少必要的技術保障，長期以來，我國在一類、二類外檢病毒對象的關鍵技術上依賴於國外技術標準和檢測材料，限制了我國農產品的出口，制約了我國農業的發展。
目前，對於植物病毒控制還未能找到「特效藥」。因植物本身沒有免疫系統，在植物病毒控制方面基本上不能採用動物病毒相同的誘導免疫和預防接種保護的方法，對於植物病毒的有效控制只能夠依賴於防範於未然的檢驗檢疫方法。因此，建立有效地控制植物病毒的手段是當代農業生產的關鍵措施，其不僅是我國重要的經濟作物例如馬鈴薯和其它農作物高產優質的重要環節，也是維護國家生物安全和可持續農業生產的必要保障。
迄今為止，病毒的檢測技術已經歷了傳統生物學、免疫化學和核酸分子生物學檢測三個階段。目前用於植物病毒檢測的方法主要有生物學方法、血清學方法和分子生物學方法等幾類。
1)生物學方法 包括目測法和指示植物鑑別法等。該方法是一種傳統的病毒檢測方法，該方法工作量大，持續時間長，靈敏度和準確度都較差，難以檢測大量樣本。
2)血清學方法 包括酶聯免疫吸附法(ELISA)等多種方法。該方法是目前應用最廣的植物病毒檢測方法，它能同時處理大量的樣品，有很高的靈敏度和特異性。但是，抗體製備難度大，操作要求極高；尤其是不能同時檢測單個樣品中的多種病毒。
3)分子生物學方法 包括PCR(RT-PCR)法和核酸雜交檢測法等，具有極高的靈敏度。然而，PCR擴增容易出現非特異性擴增條帶和假陽性，特異性偏低，可靠性較差。核酸雜交檢測特異性強，但膜雜交一次處理樣品數量較少，手工雜交需要較長的樣品處理時間。目前該方法只在研究條件下應用，難以在生產階段推廣。
可見，各種現有植物病毒檢測方法都存在缺陷，很難做到既簡便快速，又靈敏準確，並且成本低廉地測定大量樣本，更不可能做到對同一種樣本中的多種病毒同時進行檢測，無法滿足實際需要，生產上實質上不能對許多危害性嚴重的植物病毒進行檢測。
國際病毒分類與命名委員會(ICTV)迄今確定了900多種植物病毒，一種植物往往遭受數種和數十種病毒的侵染，面對數量如此龐大的植物病毒，人們不得不探索一些高通量的檢測方法。基因晶片具有高通量的特性，正好符合這一需要。
基因晶片技術被譽為是具有劃時代意義的「革命性技術」。作為一種檢測手段，其具有靈敏度高、特異性強和高通量等特性。基因晶片用於檢測已有不少理論和應用成果，但主要集中在人類疾病診斷等方面，將基因晶片用於植物病毒檢測還未見報導。
本發明發明人認為在解決大量樣品檢測能力的基礎上保持分子檢測方法的高靈敏度和高特異性特徵將是植物病毒檢測領域的重大突破。經過辛苦的科學研究，最終本發明發明人開創性地將基因晶片用於植物病毒的檢測，根據植物病毒的特性作出不同現有技術的獨特設計，在世界範圍內率先將基因晶片的高通量處理能力和技術特點應用到植物病毒檢測，並完成了可以快速、高效、高通量地用於檢測植物病毒的基因晶片，有效地解決了常規檢測方法不能有效解決的類病毒檢測問題，成功地彌補了現有檢測方法的缺陷。
發明內容要解決的問題本發明的目的之一是將基因晶片用於植物病毒檢測領域，提供一種能夠同時檢測多種RNA植物病毒和類病毒的高通量檢測基因晶片。
本發明的另一個目的是提供用於本發明的植物病毒檢測基因晶片的特異性探針。
本發明的再一個目的是提供用於本發明的檢測方法的PCR擴增引物。
本發明的還一個目的是提供利用本發明基因晶片檢測待測樣品中植物病毒的方法。
技術方案本發明提供了一種基因晶片的用途，其特徵在於將基因晶片用於同時檢測至少2種植物病毒，優選地檢測2～122種植物病毒，最優選地檢測7-26種病毒。
本發明的基因晶片優選地可以用於以下122種病毒的檢測苜蓿花葉病毒(Alfalfa mosaic virus，AlMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaic virus，CMV)、馬鈴薯Y病毒(Potato Y virus，PVY)、馬鈴薯A病毒(potato A virus，PVA)、馬鈴薯X病毒(Potato X virus，PVX)、馬鈴薯帚頂病毒(Potato mop-top virus，PMTV)、馬鈴薯卷葉病毒(Potato leafroll virus，PLRV)、馬鈴薯V病毒(Potato V virus，PVV)、馬鈴薯M病毒(Potato M virus，PVM)、馬鈴薯紡錐塊莖類病毒(Potatospindle tuber viroid，PSTVd)、香蕉束頂病毒(Banana bunchy top virus，BBTV)、百合無症病毒(Lily symptomless virus，LSV)、南瓜花葉病毒(Squash mosaic virus，SqMV)、柑橘裂皮類病毒(Citrus exocortisviroid，CEVd)、蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)、桃潛隱花葉類病毒(Peach latent mosaic viroid，PLMVd)、馬鈴薯S病毒(Potato A virus，PVS)、百合斑駁病毒(Lily mottle virus，LiMoV)、芋花葉病毒(Dasheen masaic virus，DsMV)、小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)、西瓜花葉病毒(Watermelonmosaic virus，WMV)、香石竹環斑病毒(Camation ring spot virus，CRSV)、椰子死亡類病毒(Coconut cadang-cadang viroid，CCCVd)、李壞死環斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus，PNRSV)、南方菜豆花葉病毒(Southern bean mosaic virus，SBMV)、菸草環斑病毒(Tobacco ring spot virus，TRSV)、芹菜黃花葉病毒(Celery yellowmosaic virus，CeYMV)、茼麻黃化病毒(Abutilon mosaic virus，AbYV)、鴨蹠草花葉病毒(Commelina mosaic virus，ComMV)、莧葉斑駁病毒(Amaranthus mosaic virus，AmLMV)，豇豆綠脈帶病毒(Cowpeagreen vein-banding virus，CGVBV)、三葉草黃花葉病毒(Clover yellowmosaic virus，ClYMV)、豇豆摩洛哥蚜傳花葉病毒(Cowoea Moroccanaphid-borne mosaic virus，CMABMV)、冰草花葉病毒(Agropyronmosaic virus，AgMV)、菊芋潛病毒(Artichoke latent virus，ArLV)、豇豆皺縮花葉病毒(Cowpea rugose mosaic virus，CpRMV)、天冬門1號病毒(Asparagus 1 virus，AV-1)、文殊蘭花葉病毒(Crinum mosaicvirus，CriMV)、大麥輕型花葉病毒(Barley mild mosaic virus，BaMMV)、瑞香Y病毒(Daphne Y virus，DVY)、大麥花葉病毒(Barleyyellow mosaic virus，BaYMV)、大麥輕型斑駁病毒(Barley mildmottle virus，BaMMoV)、曼陀羅扭曲花葉病毒(Datura distottionmosaic virus，DDMV)、香蕉苞片花葉病毒(Banana bract mosaic virus，BBrMV)、曼陀羅壞死病毒(Datura necrosis virus，DNV)、菜豆普通花葉壞死病毒(Bean common mosaic necrosis virus，BCMNV)、曼陀羅鞋帶病毒(Datura shoestring virus，DSTV)、菜豆普通花葉病毒(Beancommon mosaic virus，BCMV)、山螞蟥花葉病毒(Desmodium mosaicvirus，DesMV)、甜菜花葉病毒(Beet mosaic virus，BtMV)、參薯病毒(Dioscorea alata virus，DAV)、鬼針草花葉病毒(Bidens mosaic virus，BiMV)、薯蕷綠帶花葉病毒(Dioscorea green banding mosaic virus，DGBMV)、鬼針草斑駁病毒(Bidens mottle virus，BioMoV)、茄綠花病毒(Eggplant green mosaic virus，EGMV)、豆蔻花葉病毒(Cardamonmosaic virus，CdMV)、香雪蘭花葉病毒(freesia mosaic virus，FreMV)、香石竹脈斑駁病毒(Carnation vein mottle virus，CVMV)、花生眼斑病毒(Groundnut eyespot virus，GEV)、胡蘿蔔細葉病毒(Carrot thinleaf virus，CTLV)、瓜爾豆無症病毒(Guar symptomless virus，GSLV)、木薯褐色線條病毒(Cassava brown streak virus，CBSV)、大黍花葉病毒(Guinea grass mosaic virus，GGMV)、決明黃點病毒(Cassia yellowspot virus，CasYSV)、堆心菊Y病毒(Helenium Y virus，HVY)、芹菜花葉病毒(Celery mosaic virus，CeMV)、天仙子花葉病毒(Henbanemosaic virus，HMV)、鷹嘴豆叢矮病毒(Chickpea bushy dwarf virus，CpBDV)、朱頂紅花葉病毒(Hippeastrum mosaic virus，HiMV)、三葉草黃脈病毒(Clover yellow vein virus，ClYVV)、風信子花葉病毒(Hyacinth mosaic virus，HyaMV)、哥倫比亞曼陀羅病毒(ColombianDatura virus，CDV)、印度辣椒斑駁病毒(Indian pepper mottle virus，IPMV)、暗黃鳶尾花葉病毒(Iris fulva mosaic virus，IFMV)、菸草脈帶花葉病毒(Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV)、鳶尾輕型花葉病毒(Iris mild mosaic virus，IMMV)、菸草脈斑駁病毒(Tobaccovein mottling virus，TVMV)、鳶尾重型花葉病毒(Iris severe mosaicvirus，ISMV)、菸草萎蔫病毒(Tobacco wilt virus，TWV)、石茅高梁花葉病毒(Johnsongrass mosaic virus，JGMV)、秘魯番茄病毒(Tomato Peru virus，ToPV)、甘迺迪豆病毒(Kennedya Y virus，KVY)、紫露草一吊竹梅病毒(Tradescantia-Zebrina virus，TZV)、韭蔥黃條病毒(Leek yellow stripe virus，LYSV)、栝樓斑駁病毒(Trichosanthesmottle virus，TrMV)、萵苣花葉病毒(Lettuce mosaic virus，LMV)、三葉草花葉病毒(Trifolium mountanum mosaic virus，TmMV)、旱金蓮1號病毒(Tropaeolum 1 virus，TV-1)、玉米矮花葉病毒(Maize dwarfmosaic virus，MDMV)、旱金蓮2號病毒(Tropaeolum 2 virus，TV-2)、錦葵脈明病毒(Malva vein clwaring virus，MVCV)、晚香玉病毒(tuberose virus，TuV)、萬壽菊斑駁病毒(Marigold mottle virus，MaMoV)、鬱金香帶狀碎色病毒(Tulip band-breaking virus，TBBV)、水仙退化病毒(Narcissus degeneration virus，NDV)、鬱金香碎色病毒(Tulip breaking virus，TBV)、李痘病毒(Plum pox virus，PPV)、鬱金香褪綠斑病毒(Tulip chlorotic blotch virus，TCBV)、商路花葉病毒(Pokeweek mosaic virus，PkMV)、蕪菁花葉病毒(Turnip mosaicvirus，TuMV)、塊根落葵花葉病毒(Ullucus mosaic virus，UMV)、石蒜花葉病毒(Vallota mosaic virus，ValMV)、香果蘭花葉病毒(Vanilla mosaic virus，VanMV)、報春花花葉病毒(Primula mosaicvirus，PrMV)、沃安齊賈扭曲花葉病毒(Voandzeia distortion mosaicvirus，VDMV)、毛莨斑駁病毒(Ranunculus mottle virus，RanMV)、西瓜花葉1號病毒(Watermelon mosaic 1 virus，WMV-1)、高梁花葉病毒(Sorghum mosaic virus，SrMV)、西瓜花葉2號病毒(Watermelonmosaic 2 virus，WMV-2)、大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus，SMV)、野馬鈴薯花葉病毒(Wild potato mosaic virus，WPMV)、補血草Y病毒(Statice Y virus，SVY)、紫藤脈花葉病毒(Wisteria vein mosaic virus，WVMV)、甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)、薯蕷花葉病毒(Yam mosaic virus，YMV)、甘薯羽狀斑駁病毒(Sweet potatofeathery mottle virus，SPFMV)、小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchini yellowmosaic virus，ZYMV)、甘薯G病毒(Sweet potato g virus，SPVG)、樹番茄花葉病毒(Tamarillo mosaic virus，TamMV)、發藤葫蘆花葉病毒(Telfairia mosaic virus，TeMV)、菸草蝕紋病毒(Tobacco etch virus，TEV)本發明的基因晶片更優選地可以用於以下26種病毒的檢測苜蓿花葉病毒(Alfalfa mosaic virus，AlMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaic virus，CMV)、馬鈴薯Y病毒(Potato Y virus，PVY)、馬鈴薯A病毒(potato A virus，PVA)、馬鈴薯X病毒(Potato X virus，PVX)、馬鈴薯帚頂病毒(Potato mop-top virus，PMTV)、馬鈴薯卷葉病毒(Potato leaf roll virus，PLRV)、馬鈴薯V病毒(Potato V virus，PVV)、馬鈴薯M病毒(Potato M virus，PVM)和馬鈴薯紡錐塊莖類病毒(Potato spindle tuber viroid，PSTVd)以及香蕉束頂病毒(Bananabunchy top virus，BBTV)、百合無症病毒(Lily symptomless virus，LSV)、南瓜花葉病毒(Squash mosaic virus，SqMV)、柑橘裂皮類病毒(Citrus exocortis viroid，CEVd)、蘋果莖溝病毒(Apple stem groovingvirus，ASGV)、桃潛隱花葉類病毒Peach latent mosaic viroid(PLMVd)、馬鈴薯S病毒(Potato Avirus，PVS)、百合斑駁病毒(Lilymottle virus，LiMoV)、芋花葉病毒(Dasheen masaic virus，DsMV)、小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)、西瓜花葉病毒(Watermelon mosaic virus，WMV)、香石竹環斑病毒(Carnationring spot virus，CRSV)、椰子死亡類病毒(Coconut cadang-cadangviroid，CCCVd)、李壞死環斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus，PNRSV)、南方菜豆花葉病毒(Southern bean mosaic virus，SBMV)、菸草環斑病毒(Tobacco ring spot virus，TRSV)。
本發明的基因晶片包含基質和至少2種植物病毒的特異性探針。優選地，本發明的基因晶片還包含陰性對照。所說的陰性對照是用不含病毒特異性探針的空白點樣液在晶片基質上點樣製備的。
本發明的基因晶片一般分為1-12個區，每個區分為1-6個亞區。優選地，本發明的基因晶片分為兩個區，每個區分為三個亞區。
本發明的基因晶片基質選自玻片、矽片、金屬片和膜，優選地為玻片。
本發明通過測序獲得的例如包括上述RNA病毒和類病毒等在內的植物病毒的基因組核苷酸序列，尤其是3`端序列，進行保守序列分析，從而對每種病毒設計相應的1對引物和2-5條特異性探針來製備完成本發明的基因晶片，另外本發明還可通過所設計的3』末端擴增引物和通用引物以及相應的探針製備完成本發明的基因晶片。
本發明提供了用於本發明的植物病毒檢測基因晶片的特異性探針，這些探針選自根據包含RNA植物病毒AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM、BBTV、LSV、SqMV、CEVD、ASGV、PXP、PVS、LMoV、DsMV、ZYMV、WMV、CRSV、CCCVd、PNRSV、SBMV、TRSV、ComDV、AbYV、ComMV、AmLMV、CGVBV、ArjMV、CMABMV、ArLV、CpRMV、AV-1、CriMV、BaMMV、DVY、BaYMV、BaMMoV、DDMV、BBrMV、DNV、BCMNV、DSTV、BCMV、DesMV、BtMV、DAV、BiMV、DGBMV、BioMoV、EGMV、CdMV、FreMV、CVMV、GEV、CTLV、GSLV、CBSV、GGMV、CasYSV、HVY、CeMV、HMV、CpBDV、HiMV、ClYVV、HyaMV、CDV、IPMV、IFMV、TVBMV、IMMV、TVMV、ISMV、TWV、JGMV、ToPV、KVY、TZV、LYSV、TrMV、LMV、TmMV、LiMoV、TV-1、MDMV、TV-2、MVCV、TuV、MaMoV、TBBV、NDV、TBV、PPV、TCBV、PkMV、TuMV、UMV、PVV、ValMV、VanMV、PrMV、VDMV、RanMV、WMV-1、SrMV、WMV-2、SMV、WPMV、SVY、WVMV、SCMV、YMV、SPFMV、ZYFV、SPVG、TamMV、TeMV、TEV和類病毒PSTVD的組的植物病毒的基因組核苷酸序列進行保守性序列分析而設計的探針；優選地選自根據包含RNA植物病毒AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM、BBTV、LSV、SqMV、CEVD、ASGV、PXP、PVS、LMoV、DsMV、ZYMV、WMV、CRSV、CCCVd、PNRSV、SBMV、TRSV和類病毒PSTVD的組的植物病毒的基因組核苷酸序列進行保守性序列分析而設計的探針。
其中針對AlMV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.58或SEQ IDNO.59的核苷酸序列、針對CMV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.60或SEQ ID NO.61的核苷酸序列、針對PLRV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.62或SEQ ID NO.63的核苷酸序列、針對PSTVD的特異性探針分別具有SEQ ID NO.64或SEQ ID NO.65的核苷酸序列、針對PVA的特異性探針分別具有SEQ ID NO.66或SEQ ID NO.67的核苷酸序列、針對PVM的特異性探針分別具有SEQ ID NO.68或SEQ ID NO.69的核苷酸序列、針對PVY的特異性探針分別具有SEQ ID NO.70或SEQ ID NO.71的核苷酸序列、針對PXV1的特異性探針分別具有SEQ ID NO.72或SEQ ID NO.73的核苷酸序列、針對PXV2的特異性探針分別具有SEQ ID NO.74或SEQ ID NO.75的核苷酸序列、針對TMV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.76或SEQID NO.77的核苷酸序列、針對BBTV的特異性探針分別具有SEQ IDNO.78、SEQ ID NO.79或SEQ ID NO.80的核苷酸序列、針對LSV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.81或SEQ ID NO.82的核苷酸序列、針對SqMV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.83或SEQ ID NO.84的核苷酸序列、針對CEDV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.85或SEQ ID NO.86的核苷酸序列、針對ASGV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89或SEQ ID NO.90的核苷酸序列、針對PXP的特異性探針分別具有SEQ ID NO.91、SEQID NO.92、SEQ ID NO.93或SEQ ID NO.94的核苷酸序列、針對PVS的特異性探針分別具有SEQ ID NO.95或SEQ ID NO.96的核苷酸序列、針對LMoV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.97或SEQ ID NO.98的核苷酸序列、針對DsMV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.99或SEQ ID NO.100的核苷酸序列、針對ZYMV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.101或SEQ ID NO.102的核苷酸序列、針對WMV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.103或SEQ ID NO.104的核苷酸序列、針對CRSV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.108或SEQ ID NO.109的核苷酸序列、針對CCCDV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.110、SEQ IDNO.111、SEQ ID NO.112或SEQ ID NO.113的核苷酸序列、針對PNRSV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115或SEQ ID NO.116的核苷酸序列、針對SBMV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.118或SEQ ID NO.119的核苷酸序列、針對TRSV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.122或SEQ ID NO.123的核苷酸序列。
本發明提供了一種高通量檢測待測樣品中的植物病毒的方法，該方法包括步驟7)取樣取植物材料組培苗或取莖葉組織；8)樣品總RNA抽提用常規方法抽提樣品總RNA；9)RT-標記PCR取總RNA作為第一鏈cDNA合成的模板，按常規RT方法合成第一鏈cDNA片段，以反轉錄合成的第一鏈cDNA為模板進行Cy5標記PCR，反應體系如下ddH2O10×PCR bufferd(ATG)TPDCTCy5-dCTPPrimer L R模板Taq聚合酶10)雜交用無水乙醇沉澱標記PCR產物，加雜交液，變性，置於冰上放置一段時間，然後將雜交液滴於權利要求4～12之一基因晶片的點樣區進行雜交，蓋上蓋玻片，轉移晶片於雜交艙；11)晶片掃描與圖片處理；12)數據分析，判斷樣品中植物病毒的存在。
用於以上方法的PCR擴增引物包括針對AlMV的引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、針對CMV的引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、針對PLRV的引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、針對PSTVD的引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、針對PVA的引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、針對PVM的引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、針對PVY的引物SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、針對PXV1的引物SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、針對PXV2的引物SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.18、針對TMV的引物SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.20、針對BBTV的引物SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、針對LSV的引物SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、針對SqMV的引物SEQID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27、針對CEDV的引物SEQID NO.28和SEQ ID NO.29、針對ASGV的引物SEQ ID NO.30、SEQID NO.31和SEQ ID NO.32、針對PXP的引物SEQ ID NO.33、SEQID NO.34和SEQ ID NO.35、針對PVS的引物SEQ ID NO.36和SEQID NO.37、針對LMoV的引物SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39、針對DsMV的引物SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41、針對ZYMV的引物SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43、針對WMV的引物SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45、針對CRSV的引物SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48、針對CCCDV的引物SEQ ID NO.49和SEQ IDNO.50、針對PNRSV的引物SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52、針對SBMV的引物SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54和SEQ ID NO.55、針對TRSV的引物SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57。
在本發明的方法中，PCR反應可以採用隨機引物和3`末端擴增引物。其中所說的隨機引物為Takara Biotechnology或Nonadeoxyribonucleotide mixture。其中所說的PCR反應採用35個循環，72℃延伸反應10min。另外，在所述方法中，優選地用無水乙醇沉澱標記的PCR產物，加雜交液，94℃變性3min。
有益效果本發明的基因晶片具有高度的檢測特異性，檢出率可高達100％，不出現假陽性和假陰性反應，一次雜交可檢測2種以上，最多達122種待檢病毒，且不同的檢測對象病毒之間不出現相互幹擾，能夠適應高通量檢測的要求。利用該晶片可以在數小時內完成對待檢樣品中多種病毒的雜交檢測，所需要的植物組織極少，一般僅需0.2g組織，利用本發明的基因晶片還能夠檢測常規方法不能檢測的危險性病毒和類病毒。如PSTVd，因為其沒有蛋白質，不能用常規ELISA方法進行檢測，採用本發明的基因晶片方法能夠進行有效檢測。另外，基因晶片結果的分析更容易與計算機圖像處理和定量分析軟體結合，對試驗檢測結果的輸出進行規範化。另外在保證高通量檢測的條件下，檢測的靈敏度大大高於核酸雜交和常規ELISA方法。
以下是本發明的方法與目前用於植物病毒檢測最普遍採用的ELISA法的比較(以檢測15種病毒為例進行比較)。
從上表不難看出，本發明的方法較之於ELISA法具有眾多的優點，不僅每次操作所檢測的病毒種類是前者的15倍，大量病毒檢測時的單個病毒檢測成本只是後者的30％，檢測耗時只是前者的20％，所需樣品只有前者的1/150，而且能夠檢測前者所不能檢測的類病毒，提高檢測重複性和靈敏度。
本說明書包括八幅附圖，其中附圖1是本發明的晶片點樣區示意圖，其中附圖標記1所示為基因晶片點樣區的亞區；附圖2是本發明的晶片亞區點樣方案附圖3圖示基因晶片分別檢測七種病毒的亞區掃描結果；附圖4圖示七種病毒多重標記PCR產物雜交檢測結果；附圖5圖示健康對照多重標記PCR產物雜交檢測結果；附圖6-1圖示ELISA靈敏度檢測結果；附圖6-2圖示NASH靈敏度檢測結果；附圖6-3圖示基因晶片靈敏度檢測結果。
具體實施方式
本發明的基因晶片可以通過下列步驟來製備首先通過國際上共享資料庫公開的和實驗室自己測序獲得的植物病毒的基因組核苷酸序列，尤其是3′端序列，進行保守序列分析，從而對每個病毒設計1對引物和2-5條探針，其中的植物病毒選自包含AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM、BBTV、LSV、SqMV、CEVD、ASGV、PXP、PVS、LMoV、DsMV、ZYMV、WMV、CRSV、CCCVd、PNRSV、SBMV、TRSV、ComDV、AbYV、ComMV、AmLMV、CGVBV、ArjMV、CMABMV、ArLV、CpRMV、AV-1、CriMV、BaMMV、DVY、BaYMV、BaMMoV、DDMV、BBrMV、DNV、BCMNV、DSTV、BCMV、DesMV、BtMV、DAV、BiMV、DGBMV、BioMoV、EGMV、CdMV、FreMV、CVMV、GEV、CTLV、GSLV、CBSV、GGMV、CasYSV、HVY、CeMV、HMV、CpBDV、HiMV、ClYVV、HyaMV、CDV、IPMV、IFMV、TVBMV、IMMV、TVMV、ISMV、TWV、JGMV、ToPV、KVY、TZV、LYSV、TrMV、LMV、TmMV、LiMoV、TV-1、MDMV、TV-2、MVCV、TuV、MaMoV、TBBV、NDV、TBV、PPV、TCBV、PkMV、TuMV、UMV、PVV、ValMV、VanMV、PrMV、VDMV、RanMV、WMV-1、SrMV、WMV-2、SMV、WPMV、SVY、WVMV、SCMV、YMV、SPFMV、ZYFV、SPVG、TamMV、TeMV、TEV和類病毒PSTVD的組；將合成好的探針，按所給濃度，稀釋成特定濃度為的點樣液；然後，根據點樣的數量取一定體積的點樣液於384孔板中，用進行點樣，各條探針重複點樣；點樣完畢之後，乾燥環境放置一段時間，之後用SDS搖洗，再用雙蒸水搖洗，最後室溫涼幹。製備好的晶片放於玻片盒中於4℃冰箱保存備用。
本發明通過對上述植物RNA病毒或類病毒的基因組核苷酸序列進行保守性序列分析，最終確定針對部分病毒或類病毒的引物和探針及其Tm，見下表各病毒對應的引物序列(5』-3』)
注S為正向引物；A為反向引物表2各病毒對應的探針序列(5』-3』)
在製備所需要的PCR標記產物的過程中，針對每一種RNA病毒或類病毒，首先採取3`末端擴增引物進行cDNA第一鏈的合成，在進行PCR擴增時採用一組隨機引物進行PCR擴增，也即用一組隨機引物代替樣品中所有病毒的5`末端擴增引物進行PCR擴增，所述的引物可以為商業化的分子克隆試劑商提供的PCR擴增隨機引物，其通常包括9～12個核苷酸，例如Takara Biotechnology(Dalian)Co.Ltd(寶生物工程(大連)有限公司或Nonadeoxyribonucleotide mixture；pd(N)9九個核苷酸的隨機引物商品編號(Takara Code NO.D3802)；也可以是人工合成的隨機排列的四種脫氧核苷酸的雜合體。這種PCR擴增不需要針對所有的可能含有的病毒進行添加PCR上遊引物，且能夠擴增所需要的PCR標記產物。
其中被懷疑感染待測植物病毒的樣品一般需要的取樣量較小，優選取0.2g；進行PCR擴增反應時一般為35個循環，72℃延伸反應10min。進行晶片掃描時可以將晶片插入GMS 418TM掃描儀中進行掃描，掃描的強度為80％。掃描的結果以Tiff格式保存。利用Arrayscan軟體將Tiff格式文件轉換成bmp格式文件，最後利用圖片處理軟體如ACDSee或畫圖程序將bmp格式文件轉換成JPG格式文件。
以下以實施例進一步描述本發明。這些實施例不構成對本發明的限制。
實施例1晶片的製備通過國際上共享資料庫公開的和實驗室自己測序獲得的AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM、BBTV、LSV、SqMV、CEVD、ASGV、PXP、PVS、LMoV、DsMV、ZYMV、WMV、CRSV、CCCVd、PNRSV、SBMV、TRSV、ComDV、AbYV、ComMV、AmLMV、CGVBV、ArjMV、CMABMV、ArLV、CpRMV、AV-1、CriMV、BaMMV、DVY、BaYMV、BaMMoV、DDMV、BBrMV、DNV、BCMNV、DSTV、BCMV、DesMV、BtMV、DAV、BiMV、DGBMV、BioMoV、EGMV、CdMV、FreMV、CVMV、GEV、CTLV、GSLV、CBSV、GGMV、CasYSV、HVY、CeMV、HMV、CpBDV、HiMV、ClYVV、HyaMV、CDV、IPMV、IFMV、TVBMV、IMMV、TVMV、ISMV、TWV、JGMV、ToPV、KVY、TZV、LYSV、TrMV、LMV、TmMV、LiMoV、TV-1、MDMV、TV-2、MVCV、TuV、MaMoV、TBBV、NDV、TBV、PPV、TCBV、PkMV、TuMV、UMV、PVV、ValMV、VanMV、PrMV、VDMV、RanMV、WMV-1、SrMV、WMV-2、SMV、WPMV、SVY、WVMV、SCMV、YMV、SPFMV、ZYFV、SPVG、TamMV、TeMV、TEV和類病毒PSTVD的基因組核苷酸序列，尤其是3′端序列，進行保守序列分析，從而針對每個病毒設計探針2～5條，併合成所述的DNA。將合成好的探針，按所給濃度，稀釋成濃度為10μM的點樣液40μl。依據亞區點樣方案圖進行加樣排版，點樣方案見附圖1和2。根據點樣的數量取一定體積的點樣液於384孔板中，用Cartesian Pixsys 7500點樣儀進行點樣，各條探針重複點樣5次，點間距為500μm。點樣完畢之後，乾燥環境放置30min，之後用0.2％SDS搖洗5min，再用雙蒸水搖洗2次，每次5min，最後室溫涼幹。製備好的晶片放於玻片盒中於4℃冰箱保存備用。其中每張玻片分兩個區，每個區分三個亞區。
實施例2利用基因晶片檢測植物病毒1.取樣取馬鈴薯種薯薯塊催芽萌發後在溫室隔離條件下種植的莖葉組織。
2.樣品總RNA抽提取0.2g樣品，用常規方法提其總RNA，作為RT-PCR模板。
3.RT-標記PCR取5μl總RNA(約50ng/μl)作為第一鏈cDNA合成的模板，按常規RT方法合成第一鏈cDNA片段。以反轉錄合成的第一鏈cDNA為模板進行Cy5標記PCR，反應體系為
將反應混合物經低速離心混勻，進行PCR擴增，擴增反應為35循環，72℃延伸反應10min。取8μl進行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。
4.雜交用無水乙醇沉澱標記PCR產物，加14μl雜交液(含與定位探針互補的靶片段)，94℃變性3min，立即置於冰上，放置5min。將雜交液滴於晶片的點樣區，蓋上蓋玻片，轉移晶片於雜交艙。雜交需在暗室中操作。
5.晶片掃描與圖片處理將晶片插入GMS 418TM掃描儀中進行掃描，掃描的強度為80％。掃描的結果以Tiff格式保存。利用Arrayscan軟體將Tiff格式文件轉換成bmp格式文件，最後利用圖片處理軟體如ACDSee或畫圖程序將bmp格式文件轉換成JPG格式文件。
6.數據處理判斷是否存在植物病毒。
其中基因晶片檢測設置2個制樣重複。
實施例3利用隨機引物進行基因晶片檢測植物病毒待測樣品的總RNA抽提同實施例2，取5μl總RNA(約50ng/μl)作為第一鏈cDNA合成的模板，按常規RT方法合成第一鏈cDNA片段。將cDNA進行乙醇沉澱回收，在PCR反應體系中用含有9個核苷酸的隨機引物(Takara Code NO.D3802)進行PCR條件下的Cy5標記，然後進行晶片雜交和檢測，反應的條件同實施例2，其中基因晶片檢測設置2個制樣重複。結果，陽性率為100％。
實施例4單個病毒雜交檢測本發明所用已知植物病毒和類病毒AlMV(苜蓿花葉病毒)、CMV(黃瓜花葉病毒)、PVY(馬鈴薯Y病毒)、PVA(馬鈴薯A病毒)、PVX(馬鈴薯X病毒)、TMV(馬鈴薯V病毒)和PSTVD(馬鈴薯紡錐塊莖類病毒)由國家質量檢驗檢疫總局動植物檢疫研究所、中國科學院微生物研究所和Dr.Noemi Cerovska(Institute of ExperimentalBotany in Prague，IEB CAS.Na Karlovce la，160 00 Prague 6，CzechRepublic)提供。
從用已知的標準病毒感染的馬鈴薯組織樣品中中抽提RNA樣品，經過單一病毒引物進行cDNA合成、PCR擴增標記後進行晶片雜交檢測。7種植物RNA病毒在50℃雜交條件下，檢測的具體步驟同實施例2，檢測到的亞區雜交結果如附圖3所示。
雜交結果表明CMV、PVA二者的兩條探針在50℃雜交，其中一條出現陽性雜交信號，PVX、PVY、TMV三者的兩條探針在50℃雜交，每個病毒的兩條探針均出現陽性雜交，而PSTVd和AlMV二者的四條探針在50℃雜交，分別兩條和三條探針出現陽性雜交信號。同時也看出，病毒相互間沒有出現交叉雜交，三個亞區具有相當高的重複性。本實驗是以健康馬鈴薯作為陰性對照，七種病毒雜交結果均無雜交信號。
實施例57種病毒多重PCR檢測為了進一步檢測所製備的晶片對混合感染材料進行病毒檢測的效率，將7種病毒同時接種在菸草和馬鈴薯上，抽提總RNA作為合成cDNA第一鏈的模板，用這7種病毒的混合下遊引物，在SuperScriptII作用下，置於45℃水浴中50min，75℃退火15min。取4μl RT產物做多重標記PCR擴增，反應體系為50μl。七種病毒多重標記PCR產物在50℃與晶片進行雜交，雜交檢測結果如附圖4、5所示。
多重PCR產物雜交結果表明通過一次PCR擴增和一次雜交，可以同時對7種病毒進行有效檢測。雜交結果同單個病毒檢測結果相比，除了PVA之外(兩條探針都出現陽性信號)，其它6種病毒雜交檢測結果基本相同。這說明了通過對7種病毒的多重PCR條件優化，達到了高通量檢測的目的，同時也看出在相同的反應條件下健康對照未出現雜交信號，保證了檢測結果的可靠性。
比較實施例1基因晶片、ELISA和NASH三者檢測靈敏度比較準確稱取0.6克接種CMV(1NA分離物)15天的菸葉，在液氮磨成碎片，然後等分成3份，將研磨樣品浸於液氮中保存，分別用於ELISA、NASH和晶片檢測實驗。其中三者實驗均選定了101、102、103、104、105、106、107、108這8個稀釋梯度用於靈敏度檢測。實驗另加陰性對照，三者靈敏度檢測結果見圖6-1、6-2、6-3。
結果表明用ELISA試劑盒按常規的DAS-ELISA檢測的方法只可以在104稀釋倍數下檢測到，陰性對照沒有出現陽性反應。
NASH靈敏度檢測的結果表明按常規的RNA點雜交方法只可以在104稀釋倍數下檢測到，與ELISA檢測的靈敏度相差不大。且其陰性對照亦無出現雜交信號。
從晶片靈敏度檢測實驗可以看出，在常規植物葉組織作為檢測對象時，可以在108稀釋倍數下檢測到，陰性對照亦不出現雜交信號，亞區間有相當高的重複性。
比較三者實驗結果不難看出，ELISA和NASH二者均只可以在104稀釋倍數下檢測到待檢對象，而本發明的基因晶片則可以在108稀釋倍數下檢測到待檢對象，因此，本發明的晶片法比ELISA和NASH的靈敏度高104倍。
比較實施例2基因晶片法和ELISA法檢測植物病毒的比較供試材料脫毒馬鈴薯種薯組培苗、原原種、原種和生產種，從當地市場上購買的銷售馬鈴薯。
種植方式薯塊萌發後，在溫室隔離條件下種植，試管苗直接檢測。
病毒觀察通過症狀觀察，確定感病株，通過晶片檢測AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM和PSTVD。
陽性對照接種侵染已知病毒的馬鈴薯植株，10種病毒和類病毒分別在2株植株上保存。陽性病毒為AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM和PSTVD。按照待檢樣品完全相同的處理方法進行檢測。陰性對照經過種子繁殖、未接種病毒的菸草植株或經反覆檢測證明不攜帶病毒的組培苗。
基因晶片檢測步驟同實施例2。
ELISA檢測ELISA試劑盒購自美國Advanced Diagnostics Int′l，LLC(ADI，LLC)公司。分別檢測以下病毒AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM。參照試劑盒說明進行檢測；分別用已知病毒作為陽性對照。ELISA檢測設置2個制樣重複，每次制樣設置3個點樣重複，對於不確定的檢測材料進行植株繼續培養，重複ELISA檢測。
對組培苗、原原種、生產種和銷售馬鈴薯分別用基因晶片檢測和ELISA方法進行檢測的結果如下表所示。
馬鈴薯繁殖材料用本發明的晶片和ELISA試劑盒檢測結果
注馬鈴薯1和馬鈴薯2為市場購得馬鈴薯；原原種1為霧培141-11原原種；原原種2為霧培81-5原原種；原原種3為霧培92-18原原種；原原種4為XS2-16原原種。
由此可見，本發明的植物病毒檢測晶片能夠有效進行植物材料中病毒的檢測，與國外ELISA試劑盒比較，其病毒的檢出率為100％，另外，其能夠同時檢測出ELISA方法不能檢測的類病毒病原體，具有高通量檢測、有效縮短檢測時間和樣品需要量的優點。
序列表110北京金長河科技發展有限公司120一種植物病毒檢測基因晶片160123170PatentIn version 3.1210121122212DNA213人工序列220
4001gttcgggttt gagttggtct tc 22210221124212DNA213人工序列220
4002caaacttcgt tgaatcggta tgag 24210321121212DNA213人工序列220
4003tgtgggtgac agtccgtaaa g21210421120212DNA213人工序列220
4004agatgtggga atgcgttggt 20210521120212DNA213人工序列220
4005ccactccaac tccccagaag 20210621120212DNA213人工序列220
4006tacataggga cggcttgcat 20210721120212DNA213人工序列220
4007gggaaacctg gagcgaactg 20210821120212DNA213人工序列220
4008cgaggaagga cacccgaaga 20210921125212DNA213人工序列220
4009tttctatgag atcactgcaa ccact252101021121212DNA213人工序列220
40010tgacatttcc gtccagtcca a2121011
21122212DNA213人工序列220
223r＝g或a40011gcacttcgca agaaargaga ga222101221122212DNA213人工序列220
223y＝c或t40012ccttggyctg ccagtctcta ac222101321124212DNA213人工序列220
223r＝g或a40013aaatactcgr gcaactcaat caca 242101421123212DNA213人工序列220
40014ccatccatca taacccaaac tcc 232101521122212DNA213人工序列220
40015aactggcaag cacaaggttt ca222101621122
212DNA213人工序列220
40016cagtttgggc agcattcatt tc222101721122212DNA213人工序列220
40017agcaaccaag aaagcaactt cc222101821122212DNA213人工序列220
40018gcctaactgt gccattgatg ag222101921120212DNA213人工序列220
40019gcgagtggaa cttgcctgac 202102021121212DNA213人工序列220
40020gggaacgacc ttgaactgaa a 212102121120212DNA213人工序列220
223r＝g或a
40021tgagaaacga aagggragcc 202102221120212DNA213人工序列220
223y＝c或t40022ggttcatayt tcccgctttg 202102321120212DNA213人工序列220
40023gctgattggc aagctatggg 202102421123212DNA213人工序列220
40024gatttcagct ccttgtaccc cac 232102521121212DNA213人工序列220
40025tggtgtagtt gtgccaggtg c 212102621121212DNA213人工序列220
40026tgctgctcct gttatgccac t 21
2102721120212DNA213人工序列220
40027ggggacaccc atccttctga 202102821121212DNA213人工序列220
40028ttcttgaggt tcctgtggtg c 212102921117212DNA213人工序列220
40029ccagcagcga aagaagg 172103021122212DNA213人工序列220
40030ttattgggcg taaagggtgt gt222103121119212DNA213人工序列220
40031tgtttgctcc ccacgcttt192103221121212DNA
213人工序列220
40032catcgtttac ggcgtggact a 212103321119212NA213人工序列220
40033gcggcttgct gggtcttta192103421121212DNA213人工序列220
40034cacctgtttc ctgatgacct c 212103521121212DNA213人工序列220
40035atgctggcaa ctaacgacaa g 212103621121212DNA213人工序列220
40036accagatccg acaagctcag g 212103721119212DNA213人工序列220
223r＝g或a40037
gccatttgct crgtgttcg192103821119212DNA213人工序列220
40038tgggacagag cggtggaac192103921122212DNA213人工序列220
223r＝g或a40039agtgtctcat ttgcctgraa cg222104021119212DNA213人工序列220
40040gggcttgggt gatgatgga192104121121212DNA213人工序列220
40041gcctttcagt gttctcgctt g 212104221121212DNA213人工序列220
223r＝g或a40042ccaacgctgc grcaaataat g 21
2104321119212DNA213人工序列220
40043tgccgttcag tgtcttcgc 192104421121212DNA213人工序列220
223r＝g或a40044tgatggatgg rgaagagcaa g 212104521122212DNA213人工序列220
40045tgatggatgg gagaagagca ag 222104621119212DNA213人工序列220
40046taaaccccac gacgttccg 192104721119212DNA213人工序列220
40047tcgatgacgc cacaacacg 192104821119212DNA
213人工序列220
40048ggaagcaggg tcggcaaag 192104921118212DNA213人工序列220
40049caagcgaatc tgggaagg 182105021119212DNA213人工序列220
40050aggggctaca aagggacac 192105121120212DNA213人工序列220
223y＝c或t40051aagaccacyt ggaccgtgag 202105221120212DNA213人工序列220
40052gtcctccacc atcccaatcc 202105321124212DNA213人工序列220
223r＝g或a
40053atgatggatg gagargaaca gatt 242105421124212DNA213人工序列220
40054gtgcctttca gtattttcgg agtt 242105521122212DNA213人工序列220
223y＝c或t40055tgttttgatt cacatcyctt gc222105621120212DNA213人工序列220
223r＝g或a40056tcaagtracg atggctgctg 202105721121212DNA213人工序列220
40057ccagaccacc caagattcct a 212105821127212DNA213苜蓿花葉病毒220
223y＝c或t40058
tatgccgtag ccctytgttt ggacttc 272105921138212DNA213苜蓿花葉病毒220
222(1，7，18，21，23)223y＝c或t，k＝g或t，w＝a或t40059ccttytgytgg acttcgaygc kcwgcctgag ggatctaa 382106021126212DNA213黃瓜花葉病毒40060acggagcctc accggtactg gtttat 262106121131212DNA213黃瓜花葉病毒40061tgtattcaaa agacgatgcg ctcgagacgg a 312106221129212DNA213馬鈴薯卷葉病毒40062gagcgattta ttgcttacgt tggcatacc292106321129212DNA213馬鈴薯卷葉病毒40063agggagaacg acgaccaaat ttcatattg292106421120212DNA213馬鈴薯紡錐塊莖類病毒
220
223w＝a或t40064awaaggacgg tgggagtgcc 202106521124212DNA213馬鈴薯紡錐塊莖類病毒40065caggagtaat tcccgccgaa acag 242106621122212DNA213馬鈴薯A病毒220
222(2，13)223r＝g或a40066grtcagagcc aargaggcgc at222106721127212DNA213馬鈴薯A病毒220
223w＝t或a40067agcwgcgctg aagaattcga acactaa 272106821124212DNA213馬鈴薯M病毒40068gggaaggaca catcggagaa cact 242106921125212DNA213馬鈴薯M病毒220
223r＝g或a
40069ctgatggaga ratgtcattg gagcg 252107021131212DNA213馬鈴薯Y病毒220
223r＝g或a40070tacgacatag gagaaactga ratgccaact g312107121123212DNA213馬鈴薯Y病毒40071ggagtttggg ttatgatgga tgg 232107221125212DNA213馬鈴薯X病毒40072gcacaaattc gctgcattcg acttc 252107321123212DNA213馬鈴薯X病毒40073aacccagctg ccatcatgcc caa 232107421132212DNA213馬鈴薯X病毒40074gagttcctga gtaagagaga cattggagat gt 322107521125212DNA213馬鈴薯X病毒
40075ctttctcaca ggaggtgtgg gaggc 252107621124212DNA213馬鈴薯V病毒40076aattgcagag gaggtgtgag cgtg242107721124212DNA213馬鈴薯V病毒40077aaaaggatgg aaagagccga cgag242107821128212DNA213香蕉束頂病毒220
223m＝c或a40078ggtcccttcg agtttggtgc mtttaaat282107921132212DNA213香蕉束頂病毒220
223y＝c或t40079gccatttyat attcccggg cagttatgtct ag 322108021130212DNA213香蕉束頂病毒220
223w＝a或t40080gagwtgaata aaacgaaggc gatgaatagc 30
2108121126212DNA213百合無症病毒220
223r＝g或a40081taggtctaac cgcaatgarc gtctgg 262108221127212DNA213百合無症病毒220
223r＝g或a40082gtgtcaaarg ctgcgaaccg cgtgttg 272108321125212DNA213南瓜花葉病毒40083acagtggcat aacaggagca gcaga 252108421126212DNA213南瓜花葉病毒220
223r＝g或a40084cataagcctt rgttctgcca gcacct 262108521123212DNA213柑橘裂皮類病毒40085ggatcactgg cgtccagcgg aga 232108621122
212DNA213柑橘裂皮類病毒40086tctccgctgg acgccagtga tc 222108721126212DNA213蘋果叢生植原體40087tgggtcttaa ctgacgctga ggcacg 262108821125212DNA213蘋果叢生植原體40088gctttcgtgc ctcagcgtca gttaa 252108921135212DNA213蘋果叢生植原體40089tttgactaga gttggataga ggcaagtgga atacc352109021133212DNA213蘋果叢生植原體40090ttccacttgc ctctatccaa ctctagtcaa aca 332109121130212DNA213桃X植原體40091aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc 302109221130212DNA213桃X植原體
40092cgtttacggc gtggactacc agggtatcta 302109321130212DNA213桃X植原體40093ataatggagg tcatcaggaa aacaggtggt 302109421130212DNA213桃X植原體40094ataacttcgc aagaaaatgt caagacctgg 302109521125212DNA213馬鈴薯S病毒220
223r＝g或a40095ccgacccctg aratgcggag gaatc 252109621127212DNA213馬鈴薯S病毒40096atgttgctca atgttgaagt tgtgcct 272109721126212DNA213百合斑駁病毒40097gctcttcgtg cgctgtacac tggtga 262109821125212DNA213百合斑駁病毒
40098gcgggtatcc ccacgcctca atcat 252109921126212DNA213芋花葉病毒40099gcatcacttt tctgacgcag cagagg 2621010021125212DNA213芋花葉病毒400100gcattatctg acgcaaggtg ggttt 2521010121126212DNA213小西葫蘆黃花葉病毒400101ggttgtttgg ccttgatgga aatgtt 2621010221128212DNA213小西葫蘆黃花葉病毒400102gcatgtatgg tgcctctgca tttctcat2821010321129212DNA213西瓜花葉病毒400103caagagaagc aatagcacaa atgaaggcc 2921010421126212DNA213西瓜花葉病毒220
223y＝c或t
400104ctcaacttgc tcttcyccat ccatca 2621010521125212DNA213香石竹環斑病毒400105gaaacgcatg tatgcagcag gaggc 2521010621132212DNA213香石竹環斑病毒400106gaggacgaac ctattgtgga gtgaagttga ag 3221010721131212DNA213香石竹環斑病毒400107tgacgatgtc tggaggtttg taagggatac c3121010821125212DNA213香石竹環斑病毒400108tcagttcccg tagccgccaa caaag 2521010921127212DNA213香石竹環斑病毒400109gctggtgcct aaacagcgtc agaacct 2721011021125212DNA213椰子死亡類病毒400110gggagactac ccggtggata caact 25
21011121124212DNA213椰子死亡類病毒400111tatccaccgg gtagtctccc aagc2421011221123212DNA213椰子死亡類病毒400112gcgaatctgg gaagggagcg tac 2321011321124212DNA213椰子死亡類病毒220
223s＝c或g400113ttcccagatt cgcttgasgt ttcc2421011421127212DNA213李壞死環斑病毒220
223r＝g或a400114tccctcagtt gatgggtcar aatttga 2721011521125212DNA213李壞死環斑病毒400115ccttaggaat tcggggaggc acatt 2521011621125212DNA213李壞死環斑病毒
400116caccgagagg tgacgacgac agagg 2521011721127212DNA213南方菜豆花葉病毒220
223r＝g或a400117acaccaaaca gggcaaggga rgcaata 2721011821126212DNA213南方菜豆花葉病毒220
223y＝c或t400118ttcatytgcg ctattgcttc ccttgc 2621011921131212DNA213南方菜豆花葉病毒220
223r＝g或a400119ggraacatct caaccaactc cgaaaatact g3121012021127212DNA213菸草環斑病毒400120attttggagg tcccgttaag cattcta 2721012121130212DNA213菸草環斑病毒400121gggtcaacct ccatgttgtc catatcttat 30
21012221127212DNA213菸草環斑病毒400122acatggggcc cgtcattgat cgttttg 2721012321132212DNA213菸草環斑病毒220
223y＝c或t400123gccatttyat attcccgggc agttatgtct ag 3權利要求
1.一種基因晶片的用途，其特徵在於將基因晶片用於同時檢測2～122種植物病毒。
2.如權利要求1所述的基因晶片的用途，其特徵在於將基因晶片用於同時檢測7～26種植物病毒。
3.如權利要求1或2所述的基因晶片的用途，其中所說的植物病毒選自包含RNA植物病毒AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM、BBTV、LSV、SqMV、CEVD、ASGV、PXP、PVS、LMoV、DsMV、ZYMV、WMV、CRSV、CCCVD、PNRSV、SBMV、TRSV、ComDV、AbYV、ComMV、AmLMV、CGVBV、ArjMV、CMABMV、ArLV、CpRMV、AV-1、CriMV、BaMMV、DVY、BaYMV、BaMMoV、DDMV、BBrMV、DNV、BCMNV、DSTV、BCMV、DesMV、BtMV、DAV、BiMV、DGBMV、BioMoV、EGMV、CdMV、FreMV、CVMV、GEV、CTLV、GSLV、CBSV、GGMV、CasYSV、HVY、CeMV、HMV、CpBDV、HiMV、ClYVV、HyaMV、CDV、IPMV、IFMV、TVBMV、IMMV、TVMV、ISMV、TWV、JGMV、ToPV、KVY、TZV、LYSV、TrMV、LMV、TmMV、LiMoV、TV-1、MDMV、TV-2、MVCV、TuV、MaMoV、TBBV、NDV、TBV、PPV、TCBV、PkMV、TuMV、UMV、PVV、ValMV、VanMV、PrMV、VDMV、RanMV、WMV-1、SrMV、WMV-2、SMV、WPMV、SVY、WVMV、SCMV、YMV、SPFMV、ZYFV、SPVG、TamMV、TeMV、TEV和類病毒PSTVD的組。
4.一種用於植物病毒檢測的基因晶片，該晶片包含基質和2～122種植物病毒的特異性探針。
5.如權利要求4所述的基因晶片，該晶片還包含陰性對照。
6.如權利要求4或5所述的基因晶片，該晶片分1～12個區，每個區分1～6個亞區。
7.如權利要求6所述的基因晶片，該晶片分2個區，每個區分3個亞區。
8.如權利要求4或5所述的基因晶片，其中所說的基質選自玻片、矽片、金屬片和膜。
9.如權利要求7所述的基因晶片，該晶片包含玻片和針對7～26種植物病毒的特異性探針。
10.如權利要求4或5所述的基因晶片，其中所說的特異性探針選自根據包含AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM、BBTV、LSV、SqMV、CEVD、ASGV、PXP、PVS、LMoV、DsMV、ZYMV、WMV、CRSV、CCCVd、PNRSV、SBMV、TRSV、ComDV、AbYV、ComMV、AmLMV、CGVBV、ArjMV、CMABMV、ArLV、CpRMV、AV-1、CriMV、BaMMV、DVY、BaYMV、BaMMoV、DDMV、BBrMV、DNV、BCMNV、DSTV、BCMV、DesMV、BtMV、DAV、BiMV、DGBMV、BioMoV、EGMV、CdMV、FreMV、CVMV、GEV、CTLV、GSLV、CBSV、GGMV、CasYSV、HVY、CeMV、HMV、CpBDV、HiMV、ClYVV、HyaMV、CDV、IPMV、IFMV、TVBMV、IMMV、TVMV、ISMV、TWV、JGMV、ToPV、KVY、TZV、LYSV、TrMV、LMV、TmMV、LiMoV、TV-1、MDMV、TV-2、MVCV、TuV、MaMoV、TBBV、NDV、TBV、PPV、TCBV、PkMV、TuMV、UMV、PVV、ValMV、VanMV、PrMV、VDMV、RanMV、WMV-1、SrMV、WMV-2、SMV、WPMV、SVY、WVMV、SCMV、YMV、SPFMV、ZYFV、SPVG、TamMV、TeMV、TEV和類病毒PSTVD的組的植物病毒的基因組核苷酸序列進行保守性序列分析而設計的探針的組。
11.如權利要求10所述的基因晶片，其中所說的特異性探針選自根據包含AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM、BBTV、LSV、SqMV、CEVD、ASGV、PXP、PVS、LMoV、DsMV、ZYMV、WMV、CRSV、CCCVd、PNRSV、SBMV、TRSV和類病毒PSTVD的組的植物病毒的基因組核苷酸序列進行保守性序列分析而設計的探針的組。
12.如權利要求11所述的基因晶片，其中針對AlMV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.58或SEQ ID NO.59的核苷酸序列、針對CMV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.60或SEQ ID NO.61的核苷酸序列、針對PLRV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.62或SEQ ID NO.63的核苷酸序列、針對PSTVD的特異性探針分別具有SEQ ID NO.64或SEQ ID NO.65的核苷酸序列、針對PVA的特異性探針分別具有SEQ ID NO.66或SEQ ID NO.67的核苷酸序列、針對PVM的特異性探針分別具有SEQ ID NO.68或SEQID NO.69的核苷酸序列、針對PVY的特異性探針分別具有SEQID NO.70或SEQ ID NO.71的核苷酸序列、針對PXV1的特異性探針分別具有SEQ ID NO.72或SEQ ID NO.73的核苷酸序列、針對PXV2的特異性探針分別具有SEQ ID NO.74或SEQ ID NO.75的核苷酸序列、針對TMV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.76或SEQ ID NO.77的核苷酸序列、針對BBTV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79或SEQ ID NO.80的核苷酸序列、針對LSV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.81或SEQID NO.82的核苷酸序列、針對SqMV的特異性探針分別具有SEQID NO.83或SEQ ID NO.84的核苷酸序列、針對CEDV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.85或SEQ ID NO.86的核苷酸序列、針對ASGV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89或SEQ ID NO.90的核苷酸序列、針對PXP的特異性探針分別具有SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.92、SEQ IDNO.93或SEQ ID NO.94的核苷酸序列、針對PVS的特異性探針分別具有SEQ ID NO.95或SEQ ID NO.96的核苷酸序列、針對LMoV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.97或SEQ ID NO.98的核苷酸序列、針對DsMV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.99或SEQ ID NO.100的核苷酸序列、針對ZYMV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.101或SEQ ID NO.102的核苷酸序列、針對WMV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.103或SEQ ID NO.104的核苷酸序列、針對CRSV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.108或SEQID NO.109的核苷酸序列、針對CCCDV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.112或SEQ ID NO.113的核苷酸序列、針對PNRSV的特異性探針分別具有SEQ IDNO.114、SEQ ID NO.115或SEQ ID NO.116的核苷酸序列、針對SBMV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.118或SEQ ID NO.119的核苷酸序列、針對TRSV的特異性探針分別具有SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.122或SEQ ID NO.123的核苷酸序列。
13.一種用於權利要求4-12之一的植物病毒檢測基因晶片的特異性探針，其包括針對AlMV的特異性探針SEQ ID NO.58或SEQ ID NO.59、針對CMV的特異性探針SEQ ID NO.60或SEQ ID NO.61、針對PLRV的特異性探針SEQ ID NO.62或SEQ ID NO.63、針對PSTVD的特異性探針SEQ ID NO.64或SEQ ID NO.65、針對PVA的特異性探針SEQ ID NO.66或SEQ ID NO.67、針對PVM的特異性探針SEQ ID NO.68或SEQ ID NO.69、針對PVY的特異性探針SEQ ID NO.70或SEQ ID NO.71、針對PXV1的特異性探針SEQ ID NO.72或SEQ ID NO.73、針對PXV2的特異性探針SEQID NO.74或SEQ ID NO.75、針對TMV的特異性探針SEQ ID NO.76或SEQ ID NO.77、針對BBTV的特異性探針SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79或SEQ ID NO.80、針對LSV的特異性探針SEQ IDNO.81或SEQ ID NO.82、針對SqMV的特異性探針SEQ ID NO.83或SEQ ID NO.84、針對CEDV的特異性探針SEQ ID NO.85或SEQ ID NO.86、針對ASGV的特異性探針SEQ ID NO.87、SEQID NO.88、SEQ ID NO.89或SEQ ID NO.90、針對PXP的特異性探針SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93或SEQ IDNO.94、針對PVS的特異性探針SEQ ID NO.95或SEQ ID NO.96、針對LMoV的特異性探針SEQ ID NO.97或SEQ ID NO.98、針對DsMV的特異性探針SEQ ID NO.99或SEQ ID NO.100、針對ZYMV的特異性探針SEQ ID NO.101或SEQ ID NO.102、針對WMV的特異性探針SEQ ID NO.103或SEQ ID NO.104、針對CRSV的特異性探針SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.106、SEQ IDNO.107、SEQ ID NO.108或SEQ ID NO.109、針對CCCDV的特異性探針SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.112或SEQ ID NO.113、針對PNRSV的特異性探針SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115或SEQ ID NO.116、針對SBMV的特異性探針SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.118或SEQ ID NO.119、針對TRSV的特異性探針SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.122或SEQ ID NO.123。
14.一種高通量檢測待測樣品中的植物病毒的方法，該方法包括步驟1)取樣取植物材料組培苗或取莖葉組織；2)樣品總RNA抽提用常規方法抽提樣品總RNA；3)RT-標記PCR取總RNA作為第一鏈cDNA合成的模板，按常規RT方法合成第一鏈cDNA片段，以反轉錄合成的第一鏈cDNA為模板進行Cy5標記PCR，反應體系如下ddH2O；10×PCRbuffer；d(ATG)TP；DCT；Cy5-dCTP；Primer L R；模板；Taq聚合酶；4)雜交用無水乙醇沉澱標記PCR產物，加雜交液，變性，置於冰上放置一段時間，然後將雜交液滴於權利要求4～12之一基因晶片的點樣區進行雜交，蓋上蓋玻片，轉移晶片於雜交艙；5)晶片掃描與圖片處理；6)數據分析，判斷樣品中植物病毒的存在。
15.如權利要求14所述的方法，其中PCR反應針對AlMV採用的引物具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的核苷酸序列、針對CMV採用的引物為具有SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4的核苷酸序列、針對PLRV採用的引物為具有SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6的核苷酸序列、針對PSTVD採用的引物為具有SEQ ID NO.7或SEQID NO.8的核苷酸序列、針對PVA採用的引物為具有SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10的核苷酸序列、針對PVM採用的引物為具有SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12的核苷酸序列、針對PVY採用的引物為具有SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14的核苷酸序列、針對PXV1採用的引物為具有SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16的核苷酸序列、針對PXV2採用的引物為具有SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18的核苷酸序列、針對TMV採用的引物為具有SEQID NO.19或SEQ ID NO.20的核苷酸序列、針對BBTV採用的引物為具有SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22的核苷酸序列、針對LSV採用的引物為具有SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24的核苷酸序列、針對SqMV採用的引物為具有SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.27的核苷酸序列、針對CEDV採用的引物為具有SEQ ID NO.28或SEQ ID NO.29的核苷酸序列、針對ASGV採用的引物為具有SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32的核苷酸序列、針對PXP採用的引物為具有SEQ ID NO.33、SEQID NO.34或SEQ ID NO.35的核苷酸序列、針對PVS採用的引物為具有SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.37的核苷酸序列、針對LMoV採用的引物為具有SEQ ID NO.38或SEQ ID NO.39的核苷酸序列、針對DsMV採用的引物為具有SEQ ID NO.40或SEQID NO.41的核苷酸序列、針對ZYMV採用的引物為具有SEQ IDNO.42或SEQ ID NO.43的核苷酸序列、針對WMV採用的引物為具有SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.45的核苷酸序列、針對CRSV採用的引物為具有SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47或SEQID NO.48的核苷酸序列、針對CCCDV採用的引物為具有SEQ IDNO.49或SEQ ID NO.50的核苷酸序列、針對PNRSV採用的引物為具有SEQ ID NO.51或SEQ ID NO.52的核苷酸序列、針對SBMV採用的引物為具有SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54或SEQID NO.55的核苷酸序列、針對TRSV採用的引物為具有SEQ IDNO.56或SEQ ID NO.57的核苷酸序列。
16.如權利要求14所述的方法，其中所說的PCR反應採用隨機引物或3`末端擴增引物。
17.如權利要求16的檢測植物病毒的方法，其中所說的隨機引物為Takara Biotechnology或Nonadeoxyribonucleotide mixture。
18.如權利要求16或17所述的方法，其中所說的PCR反應採用35個循環，72℃延伸反應10min。
19.如權利要求14所述的方法，其中用無水乙醇沉澱標記的PCR產物，加雜交液，94℃變性3min。
20.一種PCR擴增引物，其包括針對AlMV的引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2、針對CMV的引物SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4、針對PLRV的引物SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6、針對PSTVD的引物SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8、針對PVA的引物SEQ IDNO.9或SEQ ID NO.10、針對PVM的引物SEQ ID NO.11或SEQID NO.12、針對PVY的引物SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14、針對PXV1的引物SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16、針對PXV2的引物SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18、針對TMV的引物SEQID NO.19或SEQ ID NO.20、針對BBTV的引物SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、針對LSV的引物SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24、針對SqMV的引物SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26或SEQ IDNO.27、針對CEDV的引物SEQ ID NO.28或SEQ ID NO.29、針對ASGV的引物SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32、針對PXP的引物SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34或SEQ ID NO.35、針對PVS的引物SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.37、針對LMoV的引物SEQ ID NO.38或SEQ ID NO.39、針對DsMV的引物SEQID NO.40或SEQ ID NO.41、針對ZYMV的引物SEQ ID NO.42或SEQ ID NO.43、針對WMV的引物SEQ ID NO.44或SEQ IDNO.45、針對CRSV的引物SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47或SEQID NO.48、針對CCCDV的引物SEQ ID NO.49或SEQ ID NO.50、針對PNRSV的引物SEQ ID NO.51或SEQ ID NO.52、針對SBMV的引物SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54或SEQ ID NO.55、針對TRSV的引物SEQ ID NO.56或SEQ ID NO.57。
全文摘要
本發明涉及一種植物病毒檢測基因晶片，更具體地說涉及一種利用基因晶片檢測樣品中是否含有植物病毒的方法、用於PCR的新的核酸引物以及用於檢測PCR產物的探針。所述檢測方法能夠同時檢測待測樣品中可能含有的2～122種植物病毒，例如AlMV、CMV、PVA、PVX、PVY、TMV、BBTV、LSV、SqMV、CEVD、ASGV、PXP、PVS、LMoV、DsMV、ZYMV、WMV、CRSV、CCCVd、PNRSV、SBMV、TRSV和類病毒PSTVd等。
文檔編號C12Q1/68GK1600865SQ03157519
公開日2005年3月30日 申請日期2003年9月23日 優先權日2003年9月23日
發明者陳集雙, 杜志遊, 郎秋蕾, 王衝, 陳潔雲, 劉文洪, 谷慶琪 申請人:北京金長河科技發展有限公司