基因OsGS1;2在提高水稻對除草劑Basta抗性中的用途的製作方法

2024-03-04 02:04:15

專利名稱：：基因OsGS1;2在提高水稻對除草劑Basta抗性中的用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及植物基因工程
技術領域：
，具體涉及一種提高水稻對除草劑Basta抗性的基因OyGS7j的應用。
背景技術：
：水稻(Or少加^"raL.)是我國主要糧食作物之一，在水稻種植過程中"除草"一向是農民最為繁重的勞動之一。隨著人們生活質量的不斷提高，除草劑的應用以及抗除草劑水稻新品種的推廣日益受到人們的關注。因此，培育和推廣一種有效實用的抗除草劑水稻新品種對我國的水稻種植業甚至整個農業發展都具有十分重要的意義。1986年，轉基因農作物首次獲準進入田間試驗；1994年，第一個轉基因植物產品一延熟保鮮的轉基因番茄"FlawSaw"獲得美國農業部(USDA)和美國食品與藥品管理局(FDA)批准，進入市場；2005年，轉基因作物的全球面積比1996年增加50多倍，約9000萬hm2，其中，轉基因抗除草劑性狀在轉基因植物中應用最多，約佔78y。。Basta是一種廣譜非選擇性的除草亂其有效成分是L-phosphiothricin(PPT)的銨鹽，對植物的地上部分和地下部分均有枯死作用。Bar基因(bial叩hosresistancegen)能使植物抵抗以PPT為活性成分的除草劑。6ar基因是目前抗除草劑基因工程研究中應用最為廣泛的一個基因，也是迄今為止用得最多的一個抗除草劑選擇標記基因。因此，廣大科學研究工作者與農作物育種家們一直選用這個外源基因應用於轉基因植物的抗性篩選工作和抗Basta的品種研究。1997年抗除草劑Basta的轉基因玉米在美國的種植面積達30萬公頃以上，抗Basta的轉基因油菜在加拿大的種植面積達90萬公頃以上，佔加拿大油菜種植總面積的20%左右。現己通過生物技術將ter基因導入小麥(Vasiletal.,1993)、大麥(WanetaL,1994)、水稻(Rathoreetal.，1993)、玉米(Laurenetal.，1994)、高粱(Casasetal.,1993)、油菜和番茄(DeBlocketal.,1989)等20多種作物。然而本發明區別於以上的主要方面是選用水稻本身內源穀氨醯胺合成酶基因OsGW;2，將之超量表達，避免了由於引入外源基因對轉基因植株造成的不確定影響，不僅僅有利於提高水稻體內氮代謝水平，並且水稻在發芽、幼苗和成熟期對除草劑Basta都具有顯著的抗性。穀氨醯胺合成酶(glutaminesynthetase,GS;E.C.6.3丄2)是第一個從植物中分離純化和鑑定的酶，也是第一個被發現的能將植物無機鹽形式的氨催化同化成有機氮形式的酶。在穀氨酸合成酶的聯合作用下，GS將植物吸收的無機態氨轉變成有機形式的穀氨醯胺(Gln)和穀氨酸(Glu),在高等植物體內含氮有機物的生物合成中作為氮的供體。GS廣泛分布於高等植物的種子、葉、根、根瘤和果實等器官中，主要以胞質型GS1和葉綠體型GS2的形式存在,在植物發育過程的許多器官中具有活性。對豌豆、水稻、擬南芥、豆類玉米和大豆等高等植物GS的研究表明，GS1和GS2的生理功能與它們存在的組織和細胞特異性表達模型相關；葉綠體型GS2大量存在於葉肉細胞中，而細胞質型GS1存在於葉肉細胞中比較少，主要存在於韌皮篩管中。由於GS1在植物的根中大量存在，其主要功能是催化根中硝酸鹽還原的銨和從土壤中吸收的銨同化成有機形態氮；在豆科植物的根瘤中，GS1催化同化根瘤菌固定的氮；在發芽的子葉中，GS1催化同化活化的含氮儲存物；GS2主要分布於植物的葉中，其主要功能是在葉綠體再同化光呼吸過程中釋放出的氨中起作用。其中GS/是一個基因家族，至今發現在水稻中存在3個GS/基因(OsGSl;1,OsGSl;2和(OsGSl;3，OsGSl;1主要在地上部綠色組織中表達，OsGSl;2主要在根部表達，而OsGSl;3主要在小穗中表達。
發明內容本發明的目的在於克服現有的技術缺陷，提供了一種提高水稻對除草劑Basta的抗性的基因QyGS7;2的應用。基因OyGS7;2在提高水稻對除草劑Basta的抗性中的用途如下在水稻中超量表達編碼內源胞質型穀氨醯胺合成酶的OyG57,J基因後，發現轉基因陽性植株的種子在萌發過程中對10mg/L的Basta具有顯著的抗性，能夠正常發芽並生長，而對應的陰性植株和非轉基因野生型植株的種子則不能發芽，繼而死掉；轉基因陽性植株在幼苗期和成熟期噴施0.5%(Wv)的Basta後，仍然可以正常生長，而對應的陰性植株和非轉基因野生型植株則在兩個星期以後枯死。具體表現在種子發芽時期，100%的轉基因陽性種子可以在10mg/L的Basta篩選條件下發芽並且生長，而100%的轉基因陰性和非轉基因野生型種子發芽後卻不能繼續生長；在幼苗期，98%以上的轉基因陽性植株，但是只有7%的非轉基因野生型植株可以在噴施0.5%(v/v)的Basta條件下正常生長；在成熟期，93%以上的轉基因陽性植株，但是只有11%的轉基因陰性植株和9.7%的非轉基因野生型植株可以在塗抹0.5%(v/v)的Basta條件下正常生長(見表l)。可見，超量表達OyGW;2的轉基因植株在水稻的三個不同生育期對除草劑Basta都具有顯著的抗性。本發明是這樣實現的-本發明利用OyGS7;2的基因組片段作為應用基因，進行轉基因超量表達驗證，將該基因轉入水稻品種中花11，轉基因植株表現出對除草劑Basta極顯著的抗性現象。本發明在水稻品種中花11中(來自與中國農業科學院作物科學研究所的商業品種)，通過農桿菌介導的轉基因方法超量表達了編碼水稻內源胞質型穀氨醯胺合成酶的OyOS7;2基因，提高了水稻對除草劑Basta的抗性，為抗除草劑水稻新品種的育種和應用提供新的思路和方法。申i青人在NCBI網站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上輸入"GlutaminesynthetaseANDrice",得到序列號為AB180688的一段編碼水稻內源胞質型穀氨醯胺合成酶基因OyGS/;2的mRNA序列。在本實驗室(華中農業大學作物遺傳與改良國家重點實驗室)明恢63cDNA文庫中，根據同源匹配，找到此基因的全長cDNA序列，克隆號為EI&3-A15。通過限制性內切酶酶切方法，使用5ami//和^pn/酶切獲得此基因的全長編碼區，連接到超量表達載體pCAMBIA1301s(超表達載體pCAMBIA1301s是本實驗在載體pCAMBIA130來自澳大利亞一個公開報導和使用的質粒，參見http://www.cambia.org的基礎上改造得到的首先把載體pCAMBIA1301用多克隆位點最外端的兩個限制性核酸內切酶招"必//和五coi/進行酶切，去掉多克隆位點，再連接上一段包含C"MF35S啟動子、多克隆位點和polyA終止子的序列，從而得到了可以運用於基因超量表達的新載體pCAMBIA1301s，此載體包含GUS的報告基因和潮黴素的篩選基因)上。再進行農桿菌介導的遺傳轉化，在水稻品種中花11中，超量表達此基因，得到超量表達植株。在轉基因植株中發現，陽性植株表現為對除草劑Basta極顯著的抗性現象。本發明的優點在於(1)本發明提供了一種提高水稻對除草劑Basta抗性的基因C^GW;2的應用。申請人在水稻品種中花11中，超量表達編碼水稻內源胞質型穀氨醯胺合成酶的(^GW;2基因後，發現轉基因陽性植株對除草劑Basta具有極顯著的抗性(見圖4)。具體表現在種子發芽時期，100%的轉基因陽性種子可以在10mg/L的Basta篩選條件下發芽並且生長，而100%的轉基因陰性和非轉基因野生型種子發芽後卻不能繼續生長；在幼苗期，98%以上的轉基因陽性植株，但是只有7%的非轉基因野生型植株可以在噴施0.5%(v/v)的Basta條件下正常生長；在成熟期，93%以上的轉基因陽性植株，但是只有11%的轉基因陰性植株和9.7%的非轉基因野生型植株可以在塗抹0.5%(v/v)的Basta條件下正常生長(見表l)。(2)本發明首次在水稻中超量表達一個參與水稻氮代謝並且能夠影響對除草劑抗性的基因CWJSH並且避免了引入外源基因對轉基因植株造成的不確定影響。為水稻培育新品種提供了新的思路和方法，也為其它作物利用同源基因法獲得新品種提供了理論支持。(3)本發明中應用的基因可以為水稻等禾穀類作物以及其它作物的營養代謝研究提供支持，為更詳細的研究基因的功能提供參照。圖1為提高水稻對除草劑Basta抗性的基因OyGW;2的應用技術路線示意圖。圖2為載體pCAMBIA1301s結構示意圖。圖2a是載體pCAMBIA1301結構示意圖；圖2b是在多克隆位點中，插入片段的結構示意圖；圖2c是改造後的載體pCAMBIA1301s的結構示意圖。圖3為超表達轉化載體的結構示意圖。可見OyGS7，？基因被35S啟動子超量表達。圖4分為圖4a圖4b圖4c:圖為超量表達OyGS7;2基因的轉基因植株相對與陰性植株和非轉基因野生型植株在種子萌發期，幼苗期和成熟期都表現為對除草劑Basta的極顯著抗性現象。圖4a:超量表達QyGW;2的轉基因陽性植株(A1,A3)相對於陰性植株(Neg)、非轉基因野生型植株(CK)在種子萌發時期體現的抗除草劑Basta現象，CK-basta為野生型植株在MS培養基上正常發芽生長。圖4b:超量表達(9sGW;2的轉基因陽性植株(A3)相對非轉基因野生型植株(CK)在幼苗時期體現的抗除草劑Basta現象。圖4c:超量表達OyOy^的轉基因陽性植株(Al，A3，A4)相對於陰性植株(Neg)、非轉基因野生型植株(CK)在成熟期體現的抗除草劑Basta現象，CK-basta為野生型植株葉片沒有塗抹Basta的正常生長情況。具體實施例方式申i青人在NCBI網站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上輸入"GlutaminesynthetaseANDrice",得到序列號為AB180688的一段編碼水稻內源胞質型穀氨醯胺合成酶基因O^G^U的mRNA序列。在本實驗室(華中農業大學作物遺傳與改良國家重點實驗室)明恢63cDNA文庫中，根據同源匹配，找到此基因的全長cDNA序列，克隆號為EI#03-A15。通過限制性內切酶酶切方法，使用SamF/和〖;w/酶切獲得此基因的全長編碼區，把該片段連接到超表達載體質粒pCAMBIA1301s(超表達載體pCAMBIA1301s是本實驗在載體pCAMBIA130來自澳大利亞一個公開報導和使用的質粒，參見http://www.cambia.org的基礎上改造得到的首先把載體pCAMBIA1301用多克隆位點最外端的兩個限制性核酸內切酶歷"必//和五coi/進行酶切，去掉多克隆位點，再連接上一段包含Cfl^F35S啟動子、多克隆位點和polyA終止子的序列，從而得到了可以運用於基因超量表達的新載體pCAMBIA1301s，此載體包含GUS的報告基因和潮黴素的篩選基因)上，用農桿菌介導的方法，在水稻品種中花ll中超量表達C^GW;2基因，獲得轉基因植株。通過分子生物學手段，即PCR和Southem、Western分子雜交方法鑑定轉基因後代的陽性植株和陰性植株。在Basta篩選條件下觀察鑑定轉基因植株後代，發現轉基因植株表現出對除草劑Basta極顯著的抗性現象。以下實施例進一步定義本發明，並描述了分離C^GS厶2基因，遺傳轉化，以及Basta抗性實驗方法和鑑定。根據以下的描述和這些實施事例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特徵，並且在不偏離本發明精神和範圍的情況下，可以對本發明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實施例l:OyGW，J基因確定和序列的獲得在NCBI網站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上輸入"GlutaminesynthetaseANDrice"，得到序列號為AB180688的一段編碼水稻內源胞質型穀氨醯胺合成酶基因OsGW;2的mRNA序列。在本實驗室(華中農業大學作物遺傳與改良國家重點實驗室)明恢63cDNA文庫中，根據同源匹配，找到此基因的全長cDNA序列，克隆號為EI#03-A15。實施例2:超量表達轉化載體的構建根據基因OsGSU的己知全長cDNA序列尋找合適的酶切位點，通過限制性內切酶酶切方法，使用Sam///和《p"/酶切獲得此基因的全長編碼區，使基因按正確的方向連接到pCAMBIA1301s載體上，並通過測序驗證基因序列的完整與正確性。實施例3:超量表達的轉基因實驗包含編碼水稻內源胞質型穀氨醯胺合成酶的OyGS/;2基因的片段連接到載體pCAMBIA1301s上後，採用轉基因的方法，得到轉基因的水稻小植株，本發明的轉基因具體步驟如下將得到的正確克隆的質粒通過農桿菌(EHA105由澳大利亞CAMBIA實驗室提{共，參見NewJgA6aCen'wmhelperplasmidsforgenetransfertoplants,1993,TransgenicRes2:208-218)介導水稻遺傳轉化體系導入到水稻品種中花11中，經過預培養、侵染、共培養、篩選具有潮黴素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到轉基因植株。農桿菌介導的水稻(粳稻亞種)遺傳轉化體系主要應用Hiei等人報導的方法(參見Efficienttransformationofrice，s加'vaL.，mediatedby々ra6""m.簡andsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA，1994，PlantJournal6:271-282)基礎上進行優化。本發明的遺傳轉化的主要步驟、培養基及其配製的方法如下所述(1)試劑和溶液縮寫本發明中培養基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-節基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧節青黴素)；KT(Kinetin，激動素);NAA(Napthaleneaceticacid，萘乙酸);IAA(Indole-3-aceticacid，卩引哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyaceticacid，，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙醯丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮黴素)；DMSO(DimethylSulfoxide,二甲基亞碸)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)(2)溶液配方1)N6培養基大量元素母液(按照10倍濃縮液(10X)配製)硝酸鉀(KN03)28.3克磷酸二氫鉀(KH2P04)4.0克硫酸銨((NH4)2S04)4.63克硫酸鎂(MgS04'7H20)1.85克氯化鈣(CaCl2'2H20)1.66克將上述試劑逐一溶解，然後用蒸餾水定容至1000毫升。2)N6培養基微量元素母液(按照100倍濃縮液(100X)配製碘化鉀(KI)0.08克硼酸(H3B03)0.16克硫酸錳(MnS(V4H20)0.44克硫酸鋅(ZnS04'7H20)0.15克將上述試劑在20-25攝氏度下溶解並用蒸餾水定容至1000毫升。3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(按照100X濃縮液配製)將3.73克乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA'2H20)和2.78克FeS(V7H20分別溶解，混合併用蒸餾水定容至1000毫升，至70'C溫浴2小時，4'C保存備用。4)維生素貯存液(按照100X濃縮液配製)煙酸(Nicotinicacid)O.l克維生素B1(ThiamineHC1)O.l克維生素B6(PyridoxineHCl)O.l克甘氨酸(Glycine)0.2克肌醇(Inositol)10克加蒸餾水定容至1000毫升，4"C保存備用。5)MS培養基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X濃縮液配製)硝酸銨(NH4N03)16.5克硝酸鉀19.0克磷酸二氫鉀1.7克3.7克氯化鈣4.4克將上述試劑在20-25'C溫度下溶解，並用蒸餾水定容至1000毫升。6)MS培養基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X濃縮液配製)硫酸錳(MnS04'4H20)2.23克硫酸鋅(ZnS04'7H20)0.86克硼酸(H3B03)0.62克碘化鉀(KI)0.083克鉬酸鈉(Na2Mo04'2H20)0.025克硫酸銅(CuS04'5H20)0.0025克氯化鈷(CoCl2'6H20)0.0025克將上述試劑在20-25°C溫度下溶解，並用蒸餾水定容至1OOO毫升。7)2，4-D貯存液(l亳克/毫升)的配製秤取2,4-D100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10毫升蒸餾水溶解完全後定容至100毫升，於20-25'C溫度下保存。8)6-BA貯存液(l毫克/毫升)的配製秤取6-BA100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10毫升蒸餾水溶解完全後定容至100毫升，20-25'C溫度保存。9)萘乙酸(NAA)貯存液(l毫克/毫升)的配製秤取NAA100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10毫升蒸餾水溶解完全後定容至100毫升，4'C保存備用。10)噴哚乙酸(IAA)貯存液(l毫克/毫升)的配製秤取IAA100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10毫升蒸餾水溶解完全後定容至100毫升，4'C保存備用。11)葡萄糖貯存液(0.5克/毫升)的配製秤取葡萄糖125克，然後用蒸餾水溶解定容至250毫升，滅菌後4'C保存備用。12)AS貯存液的配製秤取AS0.392克，加入DMSOIO毫升溶解，分裝至1.5毫升離心管內，4'C保存備用。13)1N氫氧化鉀貯存液秤取氫氧化鉀5.6克，用蒸餾水溶解定容至100毫升，20-25'C溫度保存備用。(3)用於水稻遺傳轉化的培養基配方1)誘導培養基N6max母液(取已經製備好的10X濃縮液，下同)N6mix母液(取已經製備好的100X濃縮液，下同)Fe2+EDTA貯存液(取己經製備好的100X濃縮液，下同)維生素貯存液(取己經製備好的100X濃縮液，下同)2,4-D貯存液(取上述製備好的)脯氨酸(Proline)CH蔗糖Phytagel加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸並定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口後按常規方法滅菌(12rC下滅菌25分鐘，下述的培養基滅菌方法與本培養基的滅菌方法相同)。2)繼代培養基IOO毫升IO毫升IO毫升IO毫升2.5毫升0.3克0.6克30克3克N6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe2+EDTAlt存液(100X)維生素貯存液(100X)2,4-D貯存液CH蔗糖PhytagelIOO毫升IO毫升IO毫升IO毫升2.0毫升0.5克0.6克30克3克加蒸鎦水至900毫升，lN氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸並定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。3)預培養基N6max母液(10X)12.5毫升N6mix母液(100X)1.25毫升Fe2+EDTAlfc存液(100X)2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5毫升2,4-D貯存液0.75毫升CH0.15克蔗糖5克瓊脂粉1.75克加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。使用前加熱溶解培養基並加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養皿中(25毫升/皿)。4)共培養基N6max母液(10X)12.5毫升N6mix母液(100X)1.25毫升Fe2+EDTA貝亡存液(100X)2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5毫升2,4-D貯存液0.75毫升CH0.2克蔗糖5克瓊脂粉1.75克加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。使用前加熱溶解培養基並加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養皿中(25毫升/每皿)。5)懸浮培養基N6max母液(10X)5毫升N6mix母液(100X)0.5毫升Fe2+EDTA貯存液(100X)0.5毫升維生素貯存液(100X)l毫升2,4-D貯存液0.2毫升CH0.08克蔗糖2克加蒸餾水至100毫升，調節pH值到5.4，分裝到兩個100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法滅菌。使用前加入i毫升無菌葡萄糖貯存液和ioo微升Asie存液。6)選擇培養基N6max母液(10X)25毫升N6mix母液(100X)2.5毫升Fe2+EDTA貯存液(100X)2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5毫升2,4-D貯存液0.625毫升CH0.15克蔗糖7.5克瓊脂粉1.75克加蒸餾水至250毫升，調節pH值到6.0，封口，按上述方法滅菌。使用前溶解培養基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分裝倒入培養皿中(25毫升/皿)。(注第一次選擇培養基羧苄青黴素濃度為400毫克/升，第二次及以後選擇培養基羧苄青黴素濃度為250毫克/升)。7)預分化培養基N6max母液(10X)25毫升N6mix母液(100X)2.5毫升Fe2+EDTA貯存液(100X)2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5亳升6-BA貯存液0.5毫升KT貯存液0.5毫升NAA貯存液50微升IAA貯存液50微升CH0.15克蔗糖7.5克瓊脂粉1.75克加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，封口，按上述方法滅菌。使用前溶解培養基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分裝倒入培養皿中(25毫升/皿)。8)分化培養基N6max母液(10X)IOO毫升N6mix母液(100X)IO毫升Fe2+EDTAC存液(100X)IO毫升維生素貯存液(100X)IO毫升6-BA貯存液2毫升KT貯存液2毫升NAA貯存液0.2毫升IAA貯存液0.2毫升CHl克蔗糖30克Phytagel3克加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調節pH值到6.0。煮沸並用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。9)生根培養基MSmax母液(10X)50毫升MSmix母液(100X)5毫升Fe2+EDTA5C存液(100X)5毫升維生素貯存液(100X)5毫升蔗糖20克Phytagel3克加蒸餾水至900毫升，用1N氫氧化鉀調節pH值到5.8。煮沸並用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法滅菌。(4)農桿菌介導的遺傳轉化步驟(EHA105由澳大利亞CAMBIA實驗室提供，參見NewJgro&a"eWwmhelperplasmidsforgenetransfertoplants,1993，TransgenicRes2:208-218)。3.1愈傷誘導1)將成熟的中花11水稻種子去殼，然後依次用70%的乙醇處理1分鐘，0.15%氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；2)用滅菌水洗種子4-5次；3)將種子放在誘導培養基上；4)將接種後的培養基置於黑暗處培養4周，溫度25士rC。3.2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對乾燥的胚性愈傷，放於繼代培養基上黑暗下培養2周，溫度25士rc。3.3預培養挑選緊實且相對乾燥的胚性愈傷，放於預培養基上黑暗下培養2周，溫度25士rc。3.4農桿菌培養1)在帶有對應抗性選擇的LA培養基(LA培養基的配製參照J.薩姆布魯克等，分子克隆實驗指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社，2002，北京)上預培養農桿菌￡7^/05(該菌株來自CAMBIA公司公開使用的農桿菌菌株)兩天，溫度28°C;2)將農桿菌轉移至懸浮培養基裡，28'C搖床上培養2-3小時。3.5農桿菌侵染1)將預培養的愈傷轉移至滅好菌的瓶子內；2)調節農桿菌的懸浮液至OD6oo0.8-1.0;3)將愈傷在農桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；4)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸乾；然後放置在共培養基上培養3天，溫度19-20。C。3.6愈傷洗滌和選擇培養1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農桿菌；2)浸泡在含400毫克/L羧苄青黴素(CN)的滅菌水中30分鐘；3)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸乾；4)轉移愈傷至選擇培養基上選擇培養2-3次，每次2周。3.7分化1)將抗性愈傷轉移至預分化培養基上於黑暗處培養5-7天；2)轉移預分化培養的愈傷至分化培養基上，光照下培養，溫度26'C。3.8生根1)剪掉分化時產生的根；然後將其轉移至生根培養基中光照下培養2-3周，溫度26°C。3.9移栽洗掉根上的殘留培養基，將具有良好根系的幼苗轉入溫室，同時在最初的幾天保持水分溼潤。轉化粳稻品種中花ll,得到轉基因單株To代植株。用southern檢測拷貝數，用northern檢測基因在植物體內的表達量。得到單拷貝、超表達的植株，並且進行繁殖，得到T!和T2代轉基因植株。實施例4:超表達&G^;2的轉基因植株的功能鑑定鑑定轉基因植株後代在種子萌發期，幼苗期和成熟期對除草劑Basta的抗性，發現轉基因陽性植株和陰性植株、非轉基因野生型植株相比，表現出期望的表型變化，即陽性植株對Basta具有極顯著的抗性，在Basta篩選條件下仍然可以維持正常的生長，而陰性和野生型植株則不能生長而枯死(見附圖4)。具體表現在種子發芽時期，100%的轉基因陽性種子可以在10mg/L的Basta篩選條件下發芽並且生長，而100%的轉基因陰性和非轉基因野生型種子發芽後卻不能繼續生長；在幼苗期，98%以上的轉基因陽性植株，但是只有7%的非轉基因野生型植株可以在噴施0.5%(v/v)的Basta條件下正常生長；在成熟期，93%以上的轉基因陽性植株，但是只有11%的轉基因陰性植株和9.7%的非轉基因野生型植株可以在塗抹0.5%(v/v)的Basta條件下正常生長(見表1)。由此可見，超表達(^GW;2的轉基因植株可以作為一種抗除草劑的水稻新品種來應用和推廣。1、種子萌發期對Basta抗性的鑑定方法1.配製MS培養基和添加Basta溶液的抗性篩選培養基，其Basta濃度為10mg/L。2.將需要鑑定的水稻種子去殼，並在無菌工作檯上進行消毒處理。步驟如下75%酒精浸泡1分鐘，(U5。/。HgCl2浸泡15分鐘，再用滅菌水洗滌6此以上。3.將消毒處理好的種子移至MS培養基和Basta篩選培養基上發芽一星期，觀察照相。2、幼苗期和成熟期對Basta抗性的鑑定方法1.將需要鑑定的水稻種子室溫浸種3天，37度催芽一天，之後播種；待生長至2葉期，移栽至栽培盒或栽培桶中。2.在幼苗期用0.5%(v/v)的Basta溶液噴施苗子，一個星期後觀察照相，記錄枯死苗子和綠色正常生長苗子的數目。3.在成熟期用0.5%(v/v)的Basta溶液塗抹葉片，兩個星期後觀察照相，記錄枯死葉片和綠色正常生長葉片的數目。表1本發明克隆的OyGy^轉基因植株在Basta篩選條件下的表現tableseeoriginaldocumentpage17CK:非轉基因野生型植株Neg:轉基因陰性植株Al，A3，A4-轉基因陽性植株ND:無數據。權利要求1、基因OsGS1；2在提高水稻對除草劑Basta的抗性中的用途。全文摘要本發明公開了一種基因OsGS1；2在提高水稻對除草劑Basta抗性中的用途。根據公開的編碼水稻內源穀氨醯胺合成酶的OsGS1；2基因的mRNA序列，通過同源匹配，獲得此基因的全長cDNA序列。通過限制性內切酶酶切獲得此基因的完整編碼序列，連接到超量表達載體pCAMBIA1301s上。再進行遺傳轉化，在水稻品種中，超量表達，在轉基因植株後代中發現，陽性植株相對於陰性植株和非轉基因野生型植株在種子萌發期，幼苗期和成熟期對除草劑Basta表現為極顯著的抗性。文檔編號A01H5/00GK101381732SQ200810197278公開日2009年3月11日申請日期2008年10月17日優先權日2008年10月17日發明者張啟發,練興明,蔡紅梅申請人:華中農業大學