一種辣椒疫病生防製劑及其生產方法
2024-04-05 00:29:05
專利名稱：一種辣椒疫病生防製劑及其生產方法
技術領域：
本發明屬於農作物病害生物防治技術領域。涉及一種防治辣椒真菌土傳病害的微生物活菌製劑的生產方法。本辣椒疫病生防製劑的主要有效成分為具有特定功能的放線菌。
背景技術：
辣椒是我國的特種農產品，也是人們日常生活中增味添色的蔬菜和調味品，更是重要的出口創匯優勢經濟作物。辣椒在我國種植範圍廣、面積大。據不完全統計，全國有27個省區有幹制辣椒栽培，年種植500萬畝以上，幹椒年總產60～70萬噸，年產值約50億元。陝西省種植的「秦椒」，以角果細長、顏色鮮紅、皺紋均勻、辣味佳美而久負盛名，出口遠銷港澳、新加坡、馬來西亞、日韓和歐美等國家。陝西省辣椒年種植面積60～70萬畝，約佔全國種植面積的15％，年產值6～7億元；青海省溫室辣椒種植面積約1.5萬畝，年產值高達1.5億元。辣椒已成為我省及其他省份辣椒主產區廣大農民脫貧致富的特色經濟作物，種植效益較高，在調整農業產業結構和產業化開發中有重要意義。但由於辣椒疫病流行，嚴重阻礙了辣椒生產的發展。辣椒疫病防治已成了限制辣椒產業發展的主要因素之一。
辣椒疫病亦稱辣椒枯萎病、辣椒疫黴病，是由辣椒疫黴(Phytophthora capsici)引起的一種土傳病害，可稱之為「辣椒癌症」，常造成辣椒減產，甚止絕收，已成為世界範圍內辣椒的毀滅性病害。自80年代在我國發現以來已在陝西鳳翔、岐山、扶風辣椒主產區造成了重大損失辣椒疫病發病率高達50％～80％，一般減產30％～50％，嚴重時造成絕收；青海、新疆、甘肅、寧夏及其它省份辣椒疫病流行造成的損失更為嚴重青海樂都、循化縣的大棚辣椒畝產值在1萬元以上，由於辣椒疫病絕收，有的農民已停止種植。青海人大代表已將辣椒疫病防治作為議案提交人大會議討論，以尋求解決辦法。辣椒疫病防治已成為陝西、新疆、青海等西北五省及全國辣椒生產面臨的重大課題。
近十年來，人們已在查清辣椒疫病病原菌的基礎上進行了一系列化學防治技術研究，取得了一定的結果，但仍未從根本上解決辣椒疫病防治難題。化學防治存在的主要問題辣椒疫病為土傳病，採用化學農藥防治時農藥必須施入土壤。而農藥施入土壤後會發生物理、化學吸附、遷移及微生物降解轉化等一系列複雜過程，嚴重影響了化學農藥的防治效果；若過度加大用量，不僅會影響辣椒生長，增加辣椒果實中農藥殘留量，抑制土壤中有益微生物生長，而且會汙染環境，增加生產成本。辣椒疫病一旦發生流行，則無法用化學農藥控制。近20餘年的化學防治研究表明，僅利用化學農藥防治辣椒疫病並不能從根本上解決問題，在目前辣椒抗病育種尚無重大進展的情況下，探求新的突破途徑是十分必要的。
本發明的研究結果表明利用能產生抗生素、且能在辣椒根際土壤和根內定植的特殊拮抗性放線菌抑制辣椒疫黴生長，從根源上消除辣椒疫病發生的條件，可以從根本上解決化學農藥不能解決的辣椒疫病的防治難題。這是一條重要且很有希望的途徑利用微生態原理中微生物間的競爭及拮抗理論，通過選育並向辣椒根圈施入拮抗性微生物，可從根本上抑制辣椒疫黴生長繁殖，防止辣椒疫病發生。
本發明研製出的辣椒疫病生物防治製劑以能抑制辣椒疫黴生長的拮抗性放線菌活菌為主要有效成分，主要用於辣椒疫病生物防治，同時對其他農作物的疫黴病害也有一定防效。
本發明研製出的辣椒疫病生物防治製劑可通過施入辣椒育苗苗床土、移栽時蘸根等方式接入辣椒根際土壤，利用拮抗菌在辣椒根際根內大量繁殖抑制辣椒疫黴生長，從根本上防治辣椒疫病大規模流行，減少或取消化學農藥使用，降低辣椒中農藥殘留，提高辣椒質量，生產綠色無公害農產品，增加辣椒出口創匯，加快農村產業結構調整和農民增收。
發明內容
本發明的主要目的提供一種利用微生態原理解決辣椒疫病問題的微生物產品及其生產方法。
發明的生物學原理利用能產生抗生素、且能在辣椒根際土壤和根內定殖的特殊放線菌抑制辣椒根際土壤中辣椒疫黴生長及侵染辣椒根系，從根源上消除辣椒疫病發生的條件，從根本上解決辣椒疫病的防治問題。
發明內容
從4500餘株分離自青海農田土壤放線菌中通過平皿拮抗性初篩、辣椒盆栽復篩、大田試驗驗證及拮抗菌在辣椒根系與土壤中的定殖能力測定等程序篩選出1株有實際應用價值的高效生防菌。
1.辣椒疫病生防菌的生物學特徵入選防菌代號為28G14，保藏在中國專利菌種保藏中心(CCTCC)，保藏號CCTCCNOM203077①28G14生防菌的分類地位28G14，原核微生物，屬於放線菌的鏈黴菌屬，未定種(streptomeces.spp)。
②28G14號生防菌的形態與培養特徵形態特徵在黃豆粉培養基上基絲分枝、發達、均勻，氣絲分枝、稀薄，分化出直狀孢子絲，孢子柱形至球形；在高氏1號上基絲分枝、發達、均勻，氣絲分枝、發達，孢子絲豐茂，鉤狀或頂端螺旋狀，孢子球形。
培養特徵在黃豆粉培養基上無氣絲，基絲棕褐色，產褐色素；在高氏1號上孢子絲灰色、粉狀，基絲棕褐色，產褐色素。
生理生化特徵水解澱粉；不產生卵磷脂酶；在石蕊牛奶培養基中不產酸、不產鹼、不凝乳，腖化牛奶；液化明膠；產生H2S；在酪氨酸瓊脂上產生黑色素；不分解纖維素；對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假絲酵母、青黴、西瓜枯萎病菌及黃瓜枯萎病菌均無拮抗作用。初步鑑定為鏈黴菌屬中的灰褐類群。
③28G14號生防菌的鑑定特徵(表1、2、3)A.28G14號生防菌的碳源利用(表1)表1 28G14對14種碳源的利用
B.28G14號生防菌的氮源利用(表2)表2 28G14對14種氮源的利用
C.28G14號生防菌的抗藥性標記(表3)表3 28G14對10種抗生素(mg/ml)及2種農藥的抗藥性特徵
④28G14號生防菌的在平皿內對辣椒疫病病原菌的拮抗性28G14號生防菌對供試辣椒疫黴的拮抗圈直徑達到19mm。
⑤28G14號生防菌在辣椒根系中的定殖作用(表4)單接拮抗菌及拮抗菌與辣椒疫黴同時接種時，辣椒根內的拮抗菌數量(104個/g根)分別為14.3及5.2，辣椒根內無疫黴，辣椒不發病；單接疫黴時辣椒根內的疫黴數量為27×104個/g根，辣椒發病死亡(表4)。
表4，28G14號生防菌在辣椒根系中的定殖作用(定殖密度104個/g根)
2.辣椒疫病生防製劑在盆栽實驗中對辣椒疫病的防效(表5)表5 28G14號拮抗菌在不同生育期對辣椒疫黴的盆栽試驗抗病性(未滅菌土壤)處理試驗辣椒株數 辣椒發病率(％)試驗時間(d) 3 45辣椒幼苗期盆CK1(未接疫黴)40 0 00栽試驗 CK2(接疫黴) 40 52.9 100 10028G14+疫黴40 0 00試驗時間(d) 7 14 30開花-結椒期 CK1(未接疫黴)40 0 00辣椒盆栽試驗CK2(接疫黴) 40 0 100 10028G14+疫黴40 0 0143.辣椒疫病生防製劑在田間實驗中對辣椒疫病的防效(表6)表6 28G14蘸根接種處理對辣椒疫病的田間防效(2003年，陝西省岐山青化鄉)
4.辣椒疫病生防製劑的發酵工藝採用固態發酵工藝，發酵培養基成分如下固體發酵基質原料包括有機和無機原料。有機原料(大米粉、玉米粉、黃豆餅粉麩皮等)主要為微生物提供碳源、能源及部分氮源將大米、玉米及黃豆餅粉碎至粒徑1mm左右。無機配料土壤、黃沙，除了提供少量無機養分離子外，主要用作填充料，增加固態培養基的疏鬆度和通氣性。土壤，系普通黃土母質發育土壤，在中國北方廣泛分布；黃沙，普通建築用，過1mm篩。
生防製劑固態發酵培養基1號配方大米粉∶砂∶土＝30∶35∶35，培養物的活菌數(1.6×1016cfu/g)；
2號配方玉米粉∶砂∶土＝20∶40∶40，培養物的活菌數(2.0×1016cfu/g)；生防製劑固態發酵培養方法按上述配方比例配料，再按乾料∶營養液＝1∶0.30～0.45的比例加入高氏1號液體培養基，攪拌均勻，121℃×30min滅菌，冷卻，按5％～10％用量接種生防菌菌懸液，拌勻，在滅菌培養盤中28℃培養，4～5d即可。
具體實施例方式
1.二級菌種的擴大培養∶將生防菌28G14斜面菌種接入加有250ml黃豆粉液體培養基〔可溶澱粉5.0，蔗糖10.0，蛋白腖2.0，酵母膏2.0，NaCl 2.0，K2HPO4，MgSO4.7H2O 0.5，CaCO31.0，黃豆粉浸汁(1L水加50g黃豆粉煮沸30分鐘，過濾取汁)1L，pH7.2～7.4，121℃滅菌30min。〕500ml三角瓶中，在搖床上28℃恆溫振蕩培養3d即可用作菌劑製備的接種劑。
2.菌劑製備按1號或2號配方比例配料，再按乾料∶營養液＝1∶0.30～0.45的比例加入高氏1號液體培養基，攪拌均勻，121℃×30min滅菌，冷卻，按5％～10％用量接種生防菌菌懸液，拌勻，在滅菌培養盤中28℃培養4～5d；發酵產物自然風乾、低溫減壓乾燥或低溫通風烘乾(40～45℃)，粉碎即可。
3.生防活菌製劑的用量與用法①蘸根2～3kg/畝；按固態菌劑∶水＝1∶4～5的比例將菌劑與清水混合均勻呈糊狀，移栽前將辣椒根系浸入生防製劑糊狀物中8～10小時或直接蘸根，使根系表面充分粘附生防菌接種材料，然後按常規3株1穴的方法栽植即可。
②苗床土處理將固態發酵產物按5％～10％的用量加入苗床土中並充分混勻，其餘措施同常規辣椒育苗方法。辣椒移栽時根系所帶的營養土中有大量生防菌，移栽後繼續在辣椒根際土壤中生存、繁殖，可以有效抑制辣椒疫黴生長及對辣椒的侵染，從而達到防病的結果。
與現有的辣椒疫病化學防治方法相比，本發明具有以下主要優點1.能有效解決辣椒疫黴的流行難題辣椒連茬種植導致辣椒根際土壤中辣椒疫黴數量大幅度增加，引起辣椒疫病發生。辣椒育苗或移栽時接種辣椒疫病生防菌，生防菌可在辣椒根際土壤中繁殖並侵染辣椒根系，可以從根本上抑制辣椒疫黴在辣椒根際土壤中大量繁殖及侵染辣椒根系，進而達到防治辣椒疫病流行的目的。
2.無化學農藥殘留，無毒副作用本發明的理論基礎是微生物生態學，用於辣椒疫病防治的生防菌來源於農田土壤，經過工業發酵擴大培養後再施入農田，對人及其它動物無毒副作用，使用後無任何化學農藥殘留，對生產綠色食品有重要意義。
3.推廣應用後社會及經濟效益明顯本發明產品的生產原料主要為農產品或農副產品，原料來源廣，價格低廉，生產成本低；辣椒預防接種時辣椒生防製劑用量少，用法簡單，田間使用時不增加作業難度；企業生產及農民施用該製劑均有明顯的社會、經濟及生態效益。
4.本製劑可採用固態法發酵生產設備投入少，管理較為簡單，易於中小企業使用。
權利要求
1.一種用於辣椒疫病防治的生物活菌製劑。其特徵在於放線菌為活菌製劑的主要有效成分；製劑主要用固態培養法生產；該製劑的主要防治對象為辣椒疫黴(Phytophthoracapsici)。
2.根據權利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌製劑，其特徵在於活菌製劑的有效放線菌為鏈黴菌屬(streptomeces.spp)。該生防菌的形態與培養特徵如下形態特徵①在黃豆粉培養基(成分公知)上基絲分枝、發達、均勻；氣絲分枝、稀薄，分化出直狀孢子絲，孢子柱形至球形；②在高氏1號上基絲分枝、發達、均勻，氣絲分枝、發達，孢子絲豐茂，鉤狀或頂端螺旋狀，孢子球形。培養特徵①在黃豆粉培養基上無氣絲，基絲棕褐色，產棕褐色素；②在高氏1號(成分公知)上孢子絲灰色、粉狀，基絲棕褐色，產棕褐色素。生理生化特徵水解澱粉；不產生卵磷脂酶；在石蕊牛奶培養基中不產酸、不產鹼、不凝乳，腖化牛奶；液化明膠；產生H2S；在酪氨酸瓊脂上產生黑色素；不分解纖維素；對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假絲酵母、青黴、西瓜枯萎病菌及黃瓜枯萎病菌均無拮抗作用。該生防菌的碳源、氮源利用其抗藥性標記特徵(表1、2、3)如下表1 28G14對14種碳源的利用
表2 28G14對14種氮源的利用
表3 28G14對10種抗生素(mg/ml)及2種農藥的抗藥性特徵
3.根據權利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌製劑，其特徵在於該發明的基本原理是從農田及辣椒根際土壤中篩選具有雙重功能的特殊放線菌①能產生拮抗辣椒疫黴的抗生素，②能在辣椒根際土壤和辣椒根內定植；利用所選特殊放線菌製成活菌製劑，通過蘸根或施入苗床土的方法給辣椒根系接種，進而使辣椒根系及根際土壤中辣椒疫黴拮抗菌的數量達到一定水平，實現抑制辣椒根際土壤中辣椒疫黴生長及侵染辣椒根系的目的，從根源上消除辣椒疫病發生的條件，從根本上解決辣椒疫病流行難題。
4.根據權利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌製劑，其特徵在於該活菌製劑用固態發酵法培養，培養溫度28～30℃，培養時間3～5d；
5.根據權利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌製劑，其特徵在於該活菌製劑的固態發酵培養基成分包括有機和無機原料兩部分有機原料，主要為微生物提供碳源、能源及部分氮源，包括大米粉、玉米粉、黃豆餅粉及麩皮等；無機配料土壤、黃沙等。配料前需將大米、玉米及黃豆餅粉碎至粒徑1mm左右。土壤，系普通黃土母質發育土壤，在中國北方廣泛分布；黃沙，普通建築用。黃沙過1mm篩。生防製劑固態發酵培養基成分(質量比)1號配方大米粉∶砂∶土＝30∶35∶35；2號配方玉米粉∶砂∶土＝20∶40∶40。
6.根據權利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌製劑，其特徵在於生防製劑固態發酵培養方法如下①二級菌種的擴大培養將生防菌28G14斜面菌種接入加有250ml黃豆粉液體培養基(可溶澱粉5.0，蔗糖10.0，蛋白腖2.0，酵母膏2.0，NaCl2.0，K2HPO4，MgSO4.7H2O0.5，CaCO31.0，黃豆粉浸汁(1L水加50g黃豆粉煮沸30分鐘，過濾取汁)1L，pH7.2～7.4，121℃滅菌30min。)的500ml三角瓶中，在搖床上28℃恆溫振蕩培養3～4d，即可用作菌劑製備的接種劑。②菌劑製備按1號配方或2號配方配料，再按乾料∶營養液＝1∶0.30～0.45的比例加入高氏1號液體培養基(成分公知)，攪拌均勻，121℃×30min滅菌，冷卻，按5％～10％用量接種生防菌菌懸液，拌勻，在滅菌培養盤中28℃培養4～5d；發酵產物自然風乾、低溫減壓乾燥或低溫烘乾(40～45℃)，粉碎即可。
7.根據權利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌製劑，其特徵在於生防活菌製劑的用量與用法如下①蘸根30～40kg/公頃；按固態菌劑∶水＝1∶4～5的比例將菌劑與清水混合均勻呈糊狀，移栽前將辣椒根系浸入生防製劑糊狀物中8～10小時或直接蘸根，使根系表面充分粘附生防菌接種材料，然後按常規3株1穴的方法栽植即可。②苗床土處理將固態發酵產物按5％～10％的用量加入苗床土中並充分混勻，其餘育苗措施同常規辣椒育苗。辣椒移栽時根系所帶的營養土中有大量生防菌，移栽後繼續在辣椒根際土壤中生存、繁殖，可有效抑制辣椒疫黴生長及其對辣椒的侵染，從而達到防病的目的。
全文摘要
本發明屬於農作物病害生物防治技術領域。涉及一種防治辣椒真菌土傳病害的微生物生防活菌製劑的生產及使用方法。本製劑的主要有效成分為放線菌利用能產生抗生素、且能在辣椒根際土壤和根內定殖的拮抗性特殊放線菌在辣椒根際土壤及辣椒根系大量繁殖抑制辣椒疫黴生長，從根源上消除辣椒疫病發生條件，解決化學農藥難以解決的辣椒疫病防治難題；採用固態培養法生產，原料主要為農副產品，來源廣，價格低廉；本製劑的主要防治對象為辣椒疫黴(Phytophthora.capsici)。本製劑可通過施入辣椒苗床土、移栽時蘸根等方式接入辣椒根際土壤，用量少，用法簡單。使用該製劑無化學農藥殘留，推廣應用後社會及經濟效益明顯。
文檔編號C12N1/20GK1543801SQ200310116789
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月22日 優先權日2003年11月22日
發明者薛泉宏, 蔡豔, 司美茹, 塗璇, 陳佔全, 袁虎林, 來航線, 牛小磊 申請人:西北農林科技大學, 楊凌科瑞微生物工程研究所