增加植物脅迫耐性的方法

2024-04-05 04:55:05

專利名稱：增加植物脅迫耐性的方法
相關申請本申請要求享有序列號為60/317,724，申請日為2001年9月6日的美國臨時申請的優先權，其全文在此引入作為參考。
政府保證聲明本發明受助於NSF基金IBN-9808398和DBI-9813360。政府對本發明享有某些權利。
背景技術：
發明領域本發明涉及增加植物脅迫耐性的方法和組合物，更特別地，本發明提供了用於提高植物抗旱性、耐鹽性和抗凍性的方法和組合物。
背景技術：
植物通過改變它們的基因表達分布型來響應局部環境變化，最終導致在細胞和全植物水平上產生各種各樣的適應響應(Bray，1993；Thomashow，1999；Hasegawa等，2000；Zhu等，1997；Ingram和Bartel，1996)。植物響應環境非生物脅迫的一個重要調節劑是植物激素——脫落酸(ABA)，ABA與植物對非生物脅迫如低溫、乾旱和鹽鹼的響應密切相關，同時也和植物的生長和發育，包括胚胎發生、種子休眠、發育和根生長及葉蒸騰的調節密切相關(Koornneef等，1998；McCourt，1999；Leung和Girudat，1998；Rock，2000)。有證據表明在植物中，ABA在脅迫響應的基因調節中的角色有兩層，首先，在冷、乾旱或鹽脅迫的環境下，植物增加ABA的積累，乾旱脅迫更突出地影響到ABA的積累；其次，通過外源性ABA的誘導可表達許多脅迫響應基因，和在ABA生物合成或響應缺陷型的突變植物中，上述響應基因的脅迫誘導減少了。
基於ABA在種子發芽過程中的抑制影響的遺傳學分析，已經產生出具有減少的ABA生物合成或改變的ABA響應性的突變體(Koornneef等，1998；McCourt，1999；Leung和Girudat，1998；Rock，2000)。擬南芥的模式突變體組包括aba1、aba2和aba3。ABA1基因所編碼的玉米黃質環氧酶的功能是在ABA生物合成反應的早期階段將玉米黃質轉變為紫黃質。迄今為止，關於ABA2或ABA3的分子克隆未見報導。這些aba突變體的常表型包括種子休眠和發芽過程中對NaCl脅迫抗性的損失，和當從高溼度環境轉移到低溼度環境後的萎蔫。利用ABA缺陷突變體與ABA響應突變體研究基因脅迫調節，發現在植物中，脅迫響應基因的表達通過ABA-依賴和ABA-不依賴兩種途徑介導(Shinozaki和Yamaguchi-Shinozaki，1997；Leung和Girudat，1998；Rock，2000；Thomashow，1999)。雖然在ABA-依賴和ABA-不依賴基因調節的分子機制之間所隱含的不同仍是不清楚的，但是脅迫響應基因的啟動子和激活這些基因的轉錄因子的分析支持在不同的途徑中存在截然不同的調節機制。ABRE(ABA-響應元件)複合物位於通過ABA介導基因誘導的啟動子中(Guiltinan等，1990；Yamaguchi-Shinazaki和Shinozaki，1994；Shen和Ho，1995；Vasil等，1995)，而DRE/CRT(脫水響應元件)介導的冷和滲透脅迫響應不依賴於ABA(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，1994；Stockinger等，1997)。儘管在轉錄激活過程中存在不同，遺傳學分析已經揭示了在非生物脅迫下在控制基因表達中ABA-依賴和ABA-不依賴途徑具有密切的相互作用(Ishitani等1997；Xiong等1999a)。
在本領域中已充分意識到，仍然需要一些提高植物抗旱性的方法。
發明概述本發明的一個目的是提供增加植物脅迫耐性的方法和組合物。
本發明的另一目的是提供具有增加的脅迫抗性的植物或植物細胞。
本發明的再一目的是提供一種增加植物脅迫抗性的方法，包括在植物中過量表達鉬輔因子硫化酶(molybdenum cofactor sulfurase)。
本發明的目的還可以是提供一種增加植物細胞脅迫抗性的方法，包括在植物細胞中過量表達鉬輔因子硫化酶。
本發明的目的還可以是提供由編碼鉬輔因子硫化酶的核酸轉化的一種植物或植物細胞。
因此，本發明還提供了一種生產用編碼鉬輔因子硫化酶的核酸轉化的植物或植物細胞的方法。
本發明還提供了一種具有SEQ ID NO2胺基酸序列的分離的和純化的鉬輔因子硫化酶。
本發明還提供了一種生產上述鉬輔因子硫化酶的方法，包括在鉬輔因子硫化酶被表達的環境下培養轉化了編碼鉬輔因子硫化酶的核酸的宿主細胞，和分離該鉬輔因子硫化酶。
在另一實施方案中，本發明提供了一種具有鉬輔因子硫化酶活性的分離的和純化的酶，該酶的胺基酸序列與SEQ ID NO2相比具有70％到小於100％的同源性。
本發明還提供了一種生產上述酶的方法，包含在該酶被表達的環境下培養轉化編碼了該酶的核酸的宿主細胞，和分離該酶。
本發明還提供利用報告基因的方法進行ABA遺傳學和擬南芥中的脅迫信號轉換的研究。在RD29A啟動子(包含ABRE和DRE/CRT元件，Yamaguchi-Shinozaki，1994)控制下，通過在擬南芥中導入螢火蟲螢光素酶報告基因構建ABA和脅迫響應發光植物。該RD29A-LUC植物是突變形成的，響應冷、乾旱、鹽或ABA的具有異常生物發光的突變體已被分離出(Ishitani等，1997)。存在著一組對NaCl脅迫響應具有發光減少的突變體，這裡，我們鑑定並克隆了兩個來自該組的等位突變體，這兩個突變體被命名為los5-1和los5-2(低表達滲透響應基因)，在冷和滲透脅迫環境下，顯示具有減少的脅迫響應基因表達。LOS5在滲透脅迫調節的基因表達中的角色是通過ABA介導的，LOS5的冷響應調節是不依賴於ABA，LOS5在冷和滲透脅迫響應基因表達中的功能是不依賴於CBF/DREB1或DREB2A轉錄因子。對於冰凍、鹽和乾旱脅迫，los5突變體植物的更易受傷害，暗示對於植物的脅迫耐性LOS5起關鍵作用。在響應乾旱脅迫中，該突變體植物也顯示出增強的水分蒸騰損失和較少的ABA累積，等位基因測試表明los5等位於aba3突變體。LOS5/ABA3的作圖克隆法揭示其編碼一個推定的鉬輔因子(MoCo)硫化酶，該酶催化MoCo脫硫型的硫化反應，與先前所發現在硫引入MoCo的這一反應中aba3發生病變的結果一致(Schwartz等，1997a)。硫醯化的MoCo是在ABA生物合成的最後一步中起作用的ABA乙醛氧化酶的輔因子。ABA、鹽和乾旱脅迫使得LOS5/ABA3基因的表達上調節，這些數據為ABA生物合成提供了重要的認識並能更加深對脅迫基因調節和脅迫耐性的了解。
通過隨後的附圖參考和下述的


，對本發明更完全的評價和本發明許多附帶的優點將更容易獲得，同時也能更好理解本發明。

圖1 los5突變植物的生物發光表型(A)在瓊脂平板上的野生型(左)和los5-1(右)的幼苗的形態；(B)(A)在0℃低溫試驗48小時後的發光圖；(C)在瓊脂平板上的野生型(左)和los5-1(右)的幼苗的形態；(D)用100μMABA處理4小時後的發光圖；(E)在300mM NaCl浸泡的濾紙上的野生型(左)和los5-1(右)的幼苗的形態；(F)(E)用300mM NaCl處理5小時後的發光圖；(G)在圖1B、1D和1F中所示的野生型和los5-1植物在冷(0℃，48小時)、ABA(100μM，4小時)、或NaCl(300mM，5小時)處理響應的發光強度的定量圖，在對照中顯示了那些未處理的植物的結果；(H)低溫劑量-反應曲線，該試驗在-5℃或-10℃中持續3小時，緊接著在室溫下保溫2小時，在照相前其它溫度的試驗持續了48小時；(I)NaCl劑量-反應曲線。試驗時間3小時。
右邊的顏色刻度顯示光強度從暗藍(最低)到白(最高)，(G)到(I)中的數據代表平均誤差和標準誤差(n＝20)，空白的符號代表野生型；實心的符號代表los5-1。
圖2 los5-1和野生型植物中脅迫響應基因的轉錄水平。未處理的幼苗(對照，C)；或低溫處理(冷，0℃，24小時)；100μM ABA，2小時；300mM NaCl，3小時；或30％ PEG，5小時；肌動蛋白作為額外對照；WT，野生型。
圖3 los5-1植株的冷凍敏感性(A)在冷凍試驗前的植株；(B)在冷凍試驗(-7℃，5小時)後的植株，該圖是在冷凍試驗7天後拍攝的。
圖4 los5-1突變植株的脯氨酸累積和滲透脅迫敏感性(A)未經過處理的los5-1和野生型植株中的脯氨酸累積(對照)，或150mM NaCl處理，或50μM ABA處理，數據表示平均誤差和標準誤差(n＝3)；(B)通過用30％PEG進行電解質滲漏試驗測定野生型和los5-1植株中的乾旱敏感性，數據表示平均誤差和標準誤差(n＝4)；(C)los5-1植株對NaCl脅迫更敏感，一周齡的los5-1，los6/aba1和野生型幼苗從MS營養瓊脂培養基轉移進不含NaCl(0mM NaCl)或含100mM NaCl的MS瓊脂平板，注意因為NaCl脅迫los5-1突變體的葉子彎曲，該圖是在幼苗轉移到試驗平板3周後拍攝的。
圖5葉形態和los5-1突變體植株的萎蔫表型(A)土壤中的野生型植株；(B)土壤中的los5-1突變體植株；(C)野生型和los5-1蓮座狀植株在根脫離後馬上飽滿；(D)los5-1植株在根脫離後10分鐘萎蔫，箭頭指向的是los5-1中的萎蔫的葉子；(E)野生型(左)和los5-1花序在從90％相對溼度轉移到30％相對溼度10分鐘後的形態，注意los5-1植株是萎蔫的；(F)在分離的los5-1和野生型幼苗用或不用100μM ABA的處理後累積的水蒸騰損失，數據是平均誤差和標準誤差(n＝4)。
圖6受外源性ABA作用的野生型、los5-1和los6/aba1幼苗在冷或鹽脅迫調節中RD29A-LUC的表達量(A)los5-1和los6-1突變體的鹽脅迫響應通過ABA的施用得到緩解；(B)ABA的施用無法緩解在los5-1突變體的冷脅迫響應，數據是平均誤差和標準誤差(n＝20)，冷，0℃，48小時；ABA，100μM，4小時；和Na，300mM NaCl，4小時。
圖7定位克隆LOS5及LOS5基因和基因產物的組構(A)LOS5定位於染色體I的短臂並定位在BAC克隆的F19K19上；(B)LOS5基因的結構和los5/aba3突變的位置，該位置與轉錄起始密碼子相關，實心框表示開放閱讀框，在框之間的線條表示內含子；(C)LOS5蛋白的總體結構。
圖8編碼LOS5蛋白的cDNA序列圖9 LOS5和它的來自其它生物體的同系物的序列對比。有黑影的殘基表示相同，灰影的表示相似。由點組成的線表示引入最大對比時的缺口；推定的吡哆醛磷酸鹽結合基序是用實心下劃線，保守的半胱氨酸結構域是短條下劃線；在PLP結構域中保守的關鍵賴氨酸殘基用星號標出，保守的半胱氨酸殘基用方格標出。los5/aba3突變的位置也被示出(實心圓圈表示引入終止密碼子)，LOS5/ABA3和其同系物的序列接收號是如下LOS5/ABA3，AY034895；人，BAA91354；果蠅(Drosophilamelanogaster的Mal蛋白)，AAF50901；牛(Bos Taurus的MCSU)，BAA98133；和麴黴菌(構巢麴黴Aspergillus nidulans的HxB)，AAF22564。
圖10在ABA缺陷或不敏感突變體中LOS5/ABA3基因的表達和脅迫基因的調節(A)LOS5在植株不同部位的表達；(B)在野生型幼苗中乾旱誘導的LOS5的表達的上調節；(C)在野生型和los5-1植株中LOS5在不同的脅迫處理下的表達；(D)LOS5和在los5-1、aba1-1和abi1-1植株中選擇的其它脅迫響應基因的表達；(E)在ABA-缺陷型突變體中CBF2和DREB2A的表達。
對照，未處理；冷4℃，12小時；ABA，100Mm ABA4小時；NaCl，300mM 5小時；PEG，30％PEG 5小時；顯示微管蛋白和肌動蛋白作為額外對照。
圖11 LOS5/ABA3催化的反應鉬輔因子(MoCo)的脫硫型/二氧型(左)需要在兩個末端氧基團之一通過LOS5/ABA3鉬輔因子硫化酶硫化產生MoCo的硫化物型(右)，MoCo的硫化物型是乙醛氧化酶(AO)和黃嘌呤脫氫酶(XDH)的輔因子，然而MoCo的二氧型是硝酸鹽還原酶(NR)和催化亞硫酸鹽氧化酶(SOX)的輔因子。乙醛氧化酶催化ABA生物合成的最後一步，反應瞬間的給硫體可來源於LOS5/ABA3或其它供體的半胱氨酸殘基。蝶呤的結構和它的編號方式依據Rajagoplant(1991)。
圖12過量表達LOS5基因可減少擬南芥植物葉水分損失的速率，分離自土壤生長中蓮座狀階段的幼苗的葉子在室溫光照的條件下放置，該圖在分離後的規定的不同時間拍攝得到。
發明詳述優選的實施方案的描述如下實施例所詳述的，過量表達本文所述的鉬輔因子硫化酶可為植株提供了增強的抗旱性，這樣的植株也期望具有更多的抗鹽性和抗凍性。耐旱性與耐鹽性和耐凍性密切相關的，特別與ABA相關，因此損失los5功能的突變體對鹽或冷凍脅迫更敏感，也暗示過量表達的植株對鹽和冷凍脅迫可能更具有耐性。因此，在本發明的上下文中，術語「增加植物脅迫耐性」指如下內容之一或任意的組合增加耐旱性、增加抗鹽性(如土壤鹽鹼)、和增加抗凍性。正如將會被本領域所意識到的，增加與過量表達鉬輔因子硫化酶植株相關的沒有過量表達該酶的植株的脅迫耐性。
除非另有限定，本文中使用的所有科技術語具有與分子生物學領域的普通技術人員通常理解同樣的含義。雖然與本文中所描述的那些相似或相當的方法或材料能被用於本發明的試驗或測試，但是本文描述了適合的方法和材料。所有在本文中提及的出版物、專利申請文件、專利文件、和其他參考文獻，其全文在此引入作為參考。假使產生衝突，以本發明所詳述的，包括定義作為參考。另外，本文說明的原料、方法和實施例不希望受限制。
根據分子生物學的標準教科書的參考文獻，包括定義和方法及實施基礎技術的手段也包含在本發明中。參見，例如，Maniatis等，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版，紐約(1982)和Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版，紐約(1989)；植物分子生物學實驗方法，Maliga等編，冷泉港實驗室出版，紐約(1995)；擬南芥，Meyerowitz等編，冷泉港實驗室出版，紐約(1994)和這裡所引用的不同文獻。
術語「植物」包括整個植物，植物器官(如葉子、莖、根等)，種子和植物細胞和該植株的後代。能被用於本發明方法的植物種類通常可擴寬到能適應轉化技術的高等植物的種類，包括單子葉植物和雙子葉植物。優選的植物包括水稻、玉米、麥、棉花、花生和大豆。
因此，本發明的一個實施方案是，通過增加植物中可利用蛋白的數量，植物的耐鹽性可被增強或增加，優選通過增強植物中鉬輔因子硫化酶基因的表達。
因此，本發明的一個實施方案是帶有本發明的多核苷酸的植物細胞，和優選帶有分離的本發明的多核苷酸的轉基因植物。
在本文中所使用的術語「增強」表示在植物細胞和/或相應DNA編碼的植物中一種或更多的酶的胞內活性的增加，增強作用也可以通過各種各樣的細菌細胞操作方法來達到。為達到增強的作用，特別是過量表達，相應基因的拷貝數目能被增加，一個強啟動子能被使用，或位於結構基因上遊的啟動子和調節區或核糖體結合位點能被突變，表達盒被整合到結構基因的上遊可執行同樣的方式。另外，還可以通過採用可誘導的啟動子來增加表達，編碼相應的具有高活性的酶的基因也能被使用，也可以通過測量來延長mRNA的活力來提高表達。此外，可通過阻止酶的降解來增加作為一個整體的酶的活性，而且，這些調節方式可任意地組合任何所期望的手段。這些或其它改變植株中基因活性的方法已被描述，如，植物分子生物學實驗方法，Maliga等編，冷泉港實驗室出版，紐約(1995)中所描述的。
編碼具有高活性的相應的或變異的酶的基因也可被使用，優選與天然酶的活性相比具有更多活性的相應的酶，更優選至少在5、10、25％或50％範圍內具有更多的活性，最優選超過天然酶活性的兩倍。
在本發明的上下文中，多核苷酸序列與本發明的序列具有至少70％「同源性」，優選至少80％同源性，更優選它的鹼基排序和鹼基序列相應於本發明的序列具有至少90％同源性。根據本發明所述，「同源蛋白」被理解為包含具有至少70％的相應的胺基酸序列的胺基酸序列的蛋白，優選至少80％，更優選至少90％，相應的胺基酸序列如SEQ ID NO2所示；其中相應的胺基酸序列可理解為意指相應的胺基酸是同樣的，或互相是同源胺基酸。術語「同源胺基酸」表示那些具有相應屬性，特別與它們的電荷、疏水性、空間屬性等相關的胺基酸。因此，該蛋白與SEQ ID NO2相比可具有從70％到小於100％的同源性。核苷酸或胺基酸序列的同源性、序列相似性或序列同一性通常可通過已知的軟體或電腦程式如BestFit或Gap配對比較程序(GCG Wisconsin包，Genetics ComputerGroup，575 Science Drive，Madison，Wisconsin 53711)。Bestfit使用Smith和Waterman局部同源性算法，應用數學進展2482-489(1981)，來找出在兩個序列之間同一性或相似性最佳的片段。Gap執行全面比對時該序列的所有部分和另一相似序列的所有部分的比對使用Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol，48443-453(1970)所記載的方法。當使用序列比對程序如Bestfit時，為測定序列同源性、相似性或同一性的程度，可使用預設設置，或選擇一個適當的得分矩陣來優化同一性、相似性或同源性得分。同樣地，當使用一個程序如BestFit來測定兩個不同胺基酸序列之間的序列同一性、相似性或同源性時，也可用預設設置，或選擇一個適當的得分矩陣，如blosum45或blosum80來優化同一性、相似性或同源性得分。
本發明也涉及具有相應於SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列或其片段的包含完整基因的多核苷酸或其片段，也可用包含所述的相應於SEQID NO1或其片段的多核苷酸的序列的探針通過雜交相應的基因庫篩選獲得，和分離該DNA序列。
本發明的多核苷酸序列適合作為RNA、cDNA和DNA的雜交探針，可分離那些與SEQ ID NO1序列具有高度相似性的cDNA或基因。
本發明的多核苷酸序列也可適合作為多聚酶鏈式反應(PCR)的引物以產生編碼具有鉬輔因子硫化酶活性的酶的DNA序列。
本文所述的寡核苷酸，可作為探針或引物，包含多於30，優選至多30，更優選至多20，最優選至少15個連續的核苷酸。長度為至少40或50個核苷酸的寡核苷酸也適合。
術語「分離的」表示被移離其天然環境。
術語「多核苷酸「通常指多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，也可表示未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。
術語「多肽」意指包含二個或更多的經肽鍵連接的胺基酸的肽或蛋白質。
本發明的多肽包括如SEQ ID NO2所示的多肽，也包括那些和如SEQ ID NO2所示的多肽相比，具有至少70％同源性的多肽，優選至少80％同源性，和更優選那些和如SEQ ID NO2所示的具有鉬輔因子硫化酶活性的多肽相比，具有至少90％到95％同源性的多肽。因此，上述多肽可具有與SEQ ID NO2相比從70％到至多100％的同源性。
本發明也涉及源於SEQ ID NO1具有簡併的遺傳密碼的編碼DNA序列。同樣地，本發明還涉及和SEQ ID NO1或其部分雜交的DNA序列。此外，本領域的技術人員也可意識到保守胺基酸置換如丙氨酸置換甘氨酸或在蛋白內天冬氨酸被穀氨酸置換作為「定向突變」能對該蛋白的活性不產生任何的根本變化，即起中性的功能。眾所周知蛋白的N-和/或C-末端的改變不會實質上地損害它的功能，甚至可以使功能穩定。
同時，本發明也涉及和SEQ ID NO1或其部分雜交的DNA序列。最後，本發明涉及使用來自SEQ ID NO1的寡核苷酸引物通過多聚酶鏈式反應(PCR)產生的DNA序列。這種類型的寡核苷酸通常具有至少15個核苷酸的長度。
術語「嚴格條件」或「嚴格雜交條件」包括涉及在多核苷酸雜交其靶序列的條件下，與其他序列相比達到一個可檢測的較大程度(如，至少大於背景強度2倍)，嚴格條件依賴於序列及在不同的條件中將不同。通過控制雜交的嚴格條件和/或洗滌條件，和探針(同源探針)具有100％互補的靶序列可被鑑別出。可選擇地，嚴格條件也能調節以允許在序列中出現一些錯配，使較低同源性程度的序列也能被檢測出(異源探針)。
典型地，嚴格條件是指那些鹽濃度低於大約1.5M Na離子，典型地大約0.01到1.0M Na離子濃度(或其它鹽)、pH在7.0到8.3之間，對於短的探針(如10到50個核苷酸)溫度在至少大約30℃、對於長的探針(如大於50個核苷酸)溫度在至少大約60℃的條件。嚴格條件也可通過額外添加去穩定劑如甲醯胺來達到，典型的低嚴格條件包括在含有30％到35％甲醯胺、1M NaCl，1％SDS(十二烷基磺酸鈉)、37℃的緩衝液中雜交，和在含有1X到2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉鹽)，50到55℃條件下衝洗。典型的中等嚴格條件包括在含有40％到45％甲醯胺、1M NaCl、1％SDS、37℃的緩衝液中雜交，和在含有0.5X到1XSSC，55到60℃條件下衝洗。典型的高度嚴格條件包括在含有50％甲醯胺、1M NaCl，1％SDS，37℃的緩衝液中雜交，和在含有0.1X SSC，60到65℃條件下衝洗。
特異性是雜交後衝洗的典型功能，關鍵的因素是最終洗滌緩衝液的離子強度和溫度。如DNA-DNA雜交，根據Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138267-284(1998)Tm＝81.5℃.+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％型)-500/L的方程式，其中M是單價陽離子的摩爾濃度，％GC是鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％型是甲醯胺在雜交緩衝液中的百分比，L是在鹼基配對中的雜交長度，Tm可推算出來。Tm是在50％的互補靶序列與完全配對的探針雜交時(在標準的離子強度和pH下)的溫度。Tm每減少大約1℃，就會產生1％的錯配；因此，可通過Tm來調節雜交和/或衝洗的條件以雜交具有預定同一性的序列。例如，若要獲得具有大約90％同一性的序列，那麼Tm可以減少10℃。通常，嚴格條件可選自比特異序列和它的互補序列在規定的離子強度和pH條件下的熱溶解點(Tm)大約低5℃的條件。但是，高度嚴格條件只能在比熱溶解點(Tm)低1、2、3或4℃條件下雜交和/或衝洗來實現；中度嚴格條件能在比熱溶解點(Tm)低6、7、8、9或10℃條件下雜交和/或衝洗來實現；低度嚴格條件能在比熱溶解點(Tm)低11、12、13、14、15或20℃條件下雜交和/或衝洗來實現。使用該方程式，雜交和衝洗混合物、和想要的Tm、和那些本領域的普通技術人員所應當了解的雜交的嚴格條件中的變量、和/或衝洗溶液在本文都有闡述。如果所要的錯配程度導致Tm低於45℃(水溶液中)或32℃(甲醯胺溶液中)，可優先增加SSC的濃度這樣就可用較高的溫度。在Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等，編，Greene Publishing和Wiley-Interscience，紐約(2000)，第2章中可找到關於核酸雜交的詳盡的指南。
因此，用前述的信息，有經驗的實驗人員可以鑑定和分離和本發明的多核苷酸實質上相似的多核苷酸。在分離這樣的一個多核苷酸的過程中，該多核苷酸可作為本發明的多核苷酸，如，增加植物耐鹽性的多核苷酸。
本發明的一個實施方案是篩選具有與本發明的多核苷酸具有實質上相似的多核苷酸，優選那些編碼具有鉬輔因子硫化酶活性的蛋白的多核苷酸。
本發明的多核苷酸序列能被一或多個適合的質粒載體攜帶，如對於植物或類似物為本領域所周知的載體。
在一個實施方案中，攜帶有該多核苷酸的具有合適細胞型的適當的載體的細菌或真菌菌株有利於傳播此多核苷酸。常規的傳播多核苷酸的方法和在這些細胞型中產生蛋白的方法是本領域的公知技術，如在Maniatis等，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版，紐約(1982)和Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版，紐約(1989)中已被描述。
在另一優選的實施方案中多核苷酸包含SEQ ID NO1、和SEQ IDNO1互補的多核苷酸、和SEQ ID NO1具有至少70％、80％和90％同一性的多核苷酸；或那些在嚴格條件下和SEQ ID NO1雜交的序列。該嚴格條件包括在5X SSC，溫度為50到68℃下衝洗。因此，該多核苷酸與SEQ ID NO1可有70％到小於100％的同一性。
在另一優選的實施方案中本發明的多核苷酸存在於質粒和/或宿主細胞中。優選地，該多核苷酸存在於植物細胞或轉基因植物中。優選地，該植物是擬南芥或選自包含小麥、玉米、花生、棉花、燕麥和大豆植物的組中。在一個優選的實施方案中，該多核苷酸是可操作地連接一個啟動子，優選一個誘導型啟動子。
在另一優選的實施方案中本發明提供了一種篩選編碼具有鉬輔因子硫化酶活性的蛋白質的多核苷酸的方法，包含用把發明的多核苷酸雜交要被檢測的多核苷酸，表達該多核苷酸以產生蛋白質，和檢測該蛋白是否具有鉬輔因子硫化酶的活性。
在另一優選實施方案中，本發明提供了一種檢測與SEQ ID NO1所示的核苷酸具有至少70％同源性的核酸，與SEQ ID NO1互補的序列和/或編碼蛋白具有SEQ ID NO2所示的胺基酸序列，包含將一個核酸樣品與包含來自SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的至少15個連續的核苷酸或來自SEQ ID NO1的互補序列的至少15個連續的核苷酸的探針或引物接觸。
在另一優選實施方案中，本發明提供了一種生產與本發明多核苷酸具有至少70％同源性的核酸的方法，包括將一個核酸樣品與包含來自SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的至少15個連續的核苷酸或來自SEQ IDNO1的互補序列的至少15個連續的核苷酸引物接觸。
在另一優選實施方案中，本發明提供了一種生產鉬輔因子硫化酶蛋白的方法，包含在適合表達鉬輔因子硫化酶的條件下，培養帶有本發明的多核苷酸的宿主細胞一段時間，和收集該鉬輔因子硫化酶蛋白。
在另一優選實施方案中，本發明提供了一種生產轉基因植株的方法，包含將本發明的多核苷酸導入植株體內。
在另一優選實施方案中，本發明提供了增加植物在逆境中的耐鹽性的方法，包含將本發明的多核苷酸導入所述的植物。
本發明中所提到的轉化植物和植物細胞的方法、載體和組合物對於本領域的技術人員是眾所周知的，並不受特別地限制。具體描述的例子參見Karimi等，TRENDS in Plant Science，Vol.7，No.5，May2002，pp.193-195，在此引入作為參考。
在另一優選實施方案中，本發明提供了一種分離的多肽，包含如SEQID NO2所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO2具有至少70％，優選80％，更優選90％和最優選95％同一性的那些蛋白，上述多肽具有鉬輔因子硫化酶活性。因此，該酶與SEQ ID NO2有70％到小於100％的同源性。
為了闡明植物中低溫和滲透脅迫的信號，我們分離和鑑定了兩個等位的擬南芥突變體，los5-1和los5-2，通過冷和滲透脅迫的基因誘導它們受到損傷。在los5突變體中，在響應冷和鹽/乾旱的過程中RD29A-LUC(在脅迫響應RD29A啟動子控制下的果蠅螢光素酶報告基因)的表達量減少，但是對ABA的響應，該RD29A-LUC的表達量沒有變化。RNA印跡分析揭示在冷脅迫下，los5突變體減少了許多脅迫響應基因的誘導，在滲透脅迫下，急劇減少或完全中斷RD29A、COR15、COR47、RD22和P5CS基因的誘導。los5突變體植株的冷凍、鹽或乾旱脅迫的耐性是折衷的。los5植株是ABA缺陷型，意味著在乾旱脅迫下，該突變體植株的水分蒸騰損失增加和ABA累積的減少，與另外一個ABA缺陷型突變體aba1的比較揭示了對los5突變體低溫基因調節的削弱是特異的。遺傳學試驗表明los5是aba3的等位基因。作圖克隆法揭示了LOS5/ABA3編碼鉬輔因子(MoCo)硫化酶。鉬輔因子硫化酶催化產生鉬輔因子的硫化型，該輔因子是乙醛氧化酶在催化植物ABA生物合成的最後一步中所需要的。LOS5/ABA3基因在植株的不同部位皆有表達，其表達量的增加響應乾旱、鹽或ABA的處理。我們的結果顯示了LOS5/ABA3基因是ABA生物合成，脅迫響應基因表達量和脅迫耐性的關鍵調節因子。
結果鹽脅迫誘導下具有減少的RD29A-LUC基因表達的分離的擬南芥突變體來自表達RD29A-LUC轉基因的擬南芥植株(稱為野生型)的種子用乙基甲磺酸鹽(EMS)誘變和通過篩選具有改變的調節會議轉基因突變體以產生M2代的幼苗(Ishitani等，1997)。已分離出NaCl誘導的存在明確減少的發光的一組突變體，兩個等位的突變體，命名為los5(los1到los4是具有低溫信號特定缺失的突變體，J-K.Zhu，未公開發表的數據)，其顯示了NaCl和冷響應誘導的發光的減少，其的選定過程有詳細的描述。
如圖1所示，在冷(0℃)持續48小時(圖1B)或300mM NaCl持續5小時(圖1F)的處理後，los5-1突變體幼苗的發光強度低於野生型植株，相反地，在ABA(100μM持續5小時)處理後突變體的發光強度不低於野生型植株(圖1D)。在沒有脅迫處理的條件下，los5突變體和野生型植株的發光強度都沒有實質上的區別。圖1所示的發光強度的定量分析顯示在冷和NaCl分別處理的條件下，los5-1突變體幼苗中RD29A-LUC的表達水平只有野生型植株的8％和2％，在ABA處理的條件下，突變體和野生型的RD29A-LUC的表達水平沒有實質上的區別(圖1G)。
應用不同的低溫或NaCl劑量來測定los5突變體對冷或鹽脅迫的響應是否具有變化的閾值，，los5和野生型植株的發光量也被定量。結果顯示los5突變體植株在溫度測試中存在連續較低的發光量(圖1H)，增加NaCl濃度也無法導致野生型的表達水平的恢復(圖1I)，這些結果揭示在los5中對冷或滲透脅迫響應的減少並不是由於這些脅迫的誘導閾值的改變所導致的。
los5-1突變體植株和野生型植株回交，分析F1代幼苗的發光量和自交的F2群體，指出在核基因中los5是隱性突變(表1)。los5-1突變體植株和其它在NaCl處理下也具有減少的發光響應的突變體配對雜交可鑑別出第二個等位基因，los5-2(表1)，該los5-2突變體和los5-1具有同樣的表型(數據未給出)。
鹽、乾旱和冷脅迫減低los5突變體的基因調節為評估是否具有RD29A-LUC轉基因的los5突變體在內源性基因RD29A的表達上有相似的影響，在無脅迫(對照)、冷(0℃)持續24小時、100μMABA持續2小時、300mM NaCl持續3小時或30％PEG持續5小時處理的條件下，用RNA印跡法分析分離自los5-1和野生型植株幼苗的總RNA。結果顯示，在los5突變體內，儘管ABA誘導的內源性RD29A的表達沒有實質上的影響，但是NaCl誘導的RD29A的表達卻幾乎完全消失(圖2)。在冷處理條件下，該突變體RD29A的表達也減少了。聚乙二醇(PEG，平均分子量為6,000)被用於辨別NaCl的影響是否由離子或滲透脅迫引起的，在PEG處理條件下，los5中的RD29A的穩定的轉錄水平也極大地減少(圖2)，該結果表明著los5突變體在滲透脅迫下基因表達減少。
滲透或冷脅迫處理對los5突變體的其它脅迫響應基因的表達也有驚人的影響。已分析了許多脅迫響應基因，包括COR15A(Lin和Thomashow，1972)，KIN1(Kurkela和Franck，1990)，COR47(Gilmour等，1992)，RD22(Yamaguchi-Shinozaki等，1992)和P5CS。在滲透脅迫下，los5突變體的COR15A、KIN1和P5CS的表達幾乎完全消失(圖2)，在NaCl和PEG誘導下，RD22和COR47的表達也明顯地減少。然而，令人感興趣地是，在ABA誘導下，los5突變體中的COR47的表達增強，而COR15A和P5CS的表達卻減少(圖2)。作為對照，測定肌動蛋白基因的轉錄水平，結果顯示在脅迫處理的條件下其表達量沒有變化，分別處理的突變體和野生型之間的表達沒有明顯的不同(圖2)。
los5突變體對冰凍脅迫更敏感los5突變體中RD29A和其它脅迫響應基因的表達的減少對突變植株的脅迫耐性有一定的影響。為測試los5突變體植株對低溫的敏感性，los5-1和野生型植株在4℃保溫4周，在生長階段，突變體和野生型之間沒有發現明顯的不同，表明LOS5並不是抗寒性的關鍵因素。為測試在冷馴化中los5突變體植株是否受損，對生長在土壤中的野生型和los5-1蓮座狀植物(圖3A)進行冷馴化(4℃，光照)48小時，接著這些植株在-7℃中處理5小時，然後在人工生長箱中保溫1天，觀察到了明顯的不同在-7℃冰凍的環境中，97％的野生型植株存活，而所有los5-1突變體植株全被殺死(圖3B和未給出的數據)。此結果表明los5突變體植株具有減少的耐凍性。
los5突變體植株更敏感於乾旱和鹽脅迫的傷害如圖2所示的穩態RNA水平揭示出在鹽或乾旱(如PEG)處理下los5-1突變體植株脅迫響應基因的表達顯著減少，除P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸鹽合成酶)基因外，大多數基因的功能還不清楚。P5CS催化植物對冷凍、乾旱和鹽脅迫耐性具有重要作用的一個主要的滲壓劑——脯氨酸生物合成中的限速步驟(參見，Xin和Browse，1998；Roosens等1999；Hong等，2000)。在ABA或鹽脅迫處理過的野生型和los5-1植株中，已測定脯氨酸的含量，在無脅迫處理(對照)條件下，los5-1突變體植株的脯氨酸含量略高於野生型植株。在150mM NaCl處理下，los5-1和野生型植株中脯氨酸的含量都增加，然而，los5-1植株的增加量比野生型植株少，當用50μM ABA處理時，los5-1突變體和野生型植株的脯氨酸含量相近(圖4A)。
為測定los5突變體植株的乾旱脅迫敏感性，用30％PEG處理los5-1和野生型幼苗並將電解質滲漏的測量值作為乾旱誘導的細胞損傷的指標。在無脅迫的處理條件下，los5-1突變體的幼苗甚至比野生型有更高的電解質滲漏值，PEG處理下，在los5-1突變體中的電解質滲漏值差不多兩倍於野生型(圖4B)，這表明los5突變體植株對於乾旱脅迫更敏感。
雖然los5-1突變體種子在發芽階段對NaCl脅迫具有更強的耐性，但是該突變體根的生長與野生型相比，在對NaCl的敏感性上並沒有不同(數據未給出)。儘管NaCl脅迫對根生長的抑制具有相似的水平，los5-1突變體植株幼苗還是顯示對NaCl脅迫敏感性的增加。在NaCl濃度為75mM或更高的條件下，los5-1突變體幼苗變成淺黃色，且由於長時間暴露於上述脅迫中，幼苗被殺死，而野生型植株卻能存活(圖4C，數據未給出)。
los5突變體植株是脅迫誘導的ABA累積的缺陷型植株除對脅迫的敏感性有變化外，los5突變體在發育方面也有變化。在我們長時間培養的條件下，los5-1植株的開花時間比野生型植株大約早5天，除具有更暗的綠顏色外，los5-1突變體的葉子更狹小且邊緣呈輕微的鋸齒狀，而與之相比，野生型植株的葉子具有更圓的形態(圖5A和5B)。實際上，根據它們葉子的特徵可以辨別los5突變體植株和野生型植株。在los5-2突變體植株、los5發光型的共分離植株、和已野生型回交4次的los5-1植株中，這些可見的表型也存在。
當los5-1植株在蓮座狀階段，將其地上部分與根分離開時(圖5C)，它的嫩葉在本試驗的室溫條件(22±2℃，～30％相對溼度)下10分鐘內萎蔫。相反，在同樣的條件下，野生型植株的葉子仍然保持飽滿(圖5D)。當成熟的los5植株從人工生長箱(22℃±2℃，90％相對溼度)環境中移植到本試驗的室溫條件下，該植株的花也容易變萎蔫，而野生型植株的花仍然保持飽滿(圖5E)。觀察的結果暗示los5突變體植株可能有更高的蒸騰速率。水分蒸騰損失測定的結果顯示los5突變體植株實際上比野生型植株損失水分要更快(圖5F)，標誌著其氣孔調節存在潛在的缺陷，所以該突變體是典型的ABA缺陷或非敏感表型突變體。為測定los5突變體植株是否缺陷ABA或對ABA不敏感，在分離空中部分用於水分損失測定前，蓮座狀階段的野生型和los5-1植株用100μM ABA噴霧3小時。圖5F顯示了ABA處理並沒有明顯地影響野生型植株的水分蒸騰損失，卻明顯地減少了los5-1植株的水分損失速率，此試驗的結果和在los5-1突變體植株中ABA是缺陷的證據一致，表明los5-1不是ABA非敏感表型。
通過用免疫測定的方法檢測los5-1和野生型植株中的ABA含量。在無脅迫處理的條件下，野生型和los5-1植株葉子中的ABA的含量基本上相同(表2)。當被分離的葉子允許損失它們鮮重的30％時，野生型和los5-1突變體中的ABA含量都增加。然而，增加的數量級是不同的，在水脅迫條件下，野生型植株中的ABA含量增加了多於300％，而在los5的葉子中僅增加了80％，即野生型植株的ABA含量大約是los5突變體的250％(表2)。
這些數據清楚地表明los5-1是ABA缺陷型突變體。為測試los5是否和已知的ABA缺陷型突變體等位，los5-1首先和aba1及aba2雜交。分析F1代植株，顯示los5-1不等位任何一個已知ABA缺陷型突變體(表1和未給出的數據)。而後當aba3-1突變體變為可用時，我們將它和los5-1雜交，並通過螢光素酶成像和水分損失測定來分析F1和F2代幼苗的表型。發光圖像結果顯示用300mM NaCl處理的F1代幼苗發光量低，表明los5可能是aba3的等位基因。然而，測量F1代幼苗水分損失的試驗僅能極少部分地推斷出上述結果，因為當與野生型RD29A-LUC植株(C24背景型)雜交時，aba3/ABA3雜合植株顯示不完全的隱性表型，如F1代植株損失水分比aba3要慢，但比RD29A-LUC野生型要快。雖然來自los5-1和aba3-1雜交的F1代植株(los5/aba3)損失水分快於來自RD29A-LUC野生型和aba3-1雜交的F1代植株，但是los5-1/aba3-1雜合植株的水分損失速率仍低於los5-1或aba3-1突變體(數據未給出)。中間表型大概可能具有上述兩個生態型之間的不同的遺傳學特徵(C24型vs.Colunbia型)。
通過獨特的機制LOS5調節冷和滲透脅迫響應基因的表達對los5-1突變體植株基因表達的分析，揭示了在通過鹽和乾旱以及在更小範圍內通過冷調節脅迫響應基因的過程中LOS5作為一個關鍵的角色(圖1和圖2)。在我們的突變篩選中，通過在鹽/乾旱處理的條件下顯示具有減少的基因誘導的los6-1突變體植株定義了第二個遺傳基因座，LOS6(J.-K.Zhu，未公開的觀察)。令人感興趣地，遺傳學分析顯示los6是aba1的等位基因，通過用十分敏感和可靠的RD29A-LUC報告子並比較兩個不同ABA缺陷型突變體los5和los6，得到的結果提供了極好的機會來研究ABA在冷和滲透脅迫調節的基因表達中的角色。在鹽脅迫條件下，RD29A-LUC在los5和los6中誘導明顯減少(圖6A)。有趣的是，當ABA與鹽脅迫同時引入，RD29A-LUC在los5和los6/aba1中的表達恢復到野生型的水平或更高，意味著可用外源ABA保持鹽誘導表型所減少的ABA。該結果揭示在los5-1和los6/aba1突變體中通過鹽和乾旱使誘導的基因減少的原因唯一的解釋是ABA的不足。
使用上述兩個突變體也可用來分析冷脅迫條件下的基因誘導。在無脅迫處理中，los6、los5和野生型都沒有任何的發光表達(數據未給出)。使我們感到驚異的是，儘管los5-1中冷誘導的RD29A-LUC明顯減少，但是lso6/aba1中的表達卻是明顯地增加(圖6B)。在無數的獨立的試驗中都能觀察到los6中發光表達的增加。為測試ABA在冷基因調節中的角色，ABA處理和冷處理共同採用。RD29A-LUC表達的測試結果顯示ABA處理能使los6/aba1的發光表達量恢復到與野生型相近的水平(圖6B)，這表明在los6/aba1中冷誘導表達量的提升可能與ABA不足的結果有間接關係，相反地，給los5突變體幼苗施用ABA卻無法恢復RD29A-LUC的表達量到野生型水平。實際上，與單獨的冷處理相比，los5植株對ABA的處理沒有顯示出響應(圖6B)，暗示在冷誘導過程中，los5突變體的基因表達的減少不是因為ABA不足。
作圖克隆LOS5基因為克隆LOS5基因，C24生態型純合的los5-1突變體植株和Columbia生態型野生型植株雜交，產生的F1代植株自交。首先，在MS瓊脂平板上培養F2代的種子並分析其幼苗的發光表達。在冷處理和鹽處理的條件下通過減少的發光表達的結果來選擇推定的突變體，然後將被選擇的幼苗移植到土壤中，在減少的溼度環境中檢測成熟植株的萎蔫表型。分布遍及五條擬南芥的染色體的簡單重複序列長度多態性(SSLP)標記即存在C24和Columbia生態型之間的大小多態性用於遺傳作圖。遺傳作圖將LOS5聚焦於染色體I的短臂，在SSLP標記的AtEAT1和nga248之間(圖7A)，該區域大致相應於ABA3作圖所聚焦的位置(Leon-Kloosterzie等，1996)。選自NaCl處理的大多數突變體幼苗無法存活，最後我們使用在發芽階段具有耐鹽性表型los5突變體的種子通過作圖來選擇突變體，特別地，在添加了200mM NaCl的瓊脂培養基上培養分離的F2代種子，該鹽濃度能抑制野生型種子的發芽但不抑制los5突變體種子的發芽。將推定的los5幼苗移植到土壤中，而後通過檢查它們的萎蔫表型來確認。
當LOS5的精確作圖完成後，闡明了相應於LOS5區域的基因組DNA序列。給出了ABA缺陷表型，就可使基因組序列能選擇候選基因來發現los5突變體。詳細檢測BAC克隆中該區域的基因(http//www.arabidopsis.org/cgi-bin/maps/5chrom)鑑定出一些在ABA生物合成中具有潛在的功能的候選基因，在它們中，BAC克隆F19K19上的F19K19.13基因似乎是一個好的候選基因(圖7A)。BLAST搜索表明推定的基因產物與來自其它器官的鉬輔因子硫化酶具有高相似性。先前的研究已經指出在於硫引入MoCo的過程中aba3發生遺傳病變(Schwartz等，1997a)，乙醛氧化酶(Schwartz等，1997a；Akaba等，1998；Sagi等，1999)在ABA生物合成(Schwartz等，1997a)的最後一步中的功能需要硫化的MoCo。
通過PCR擴增野生型和los5-1突變體植株中相應於F19K19.13的基因組DNA並測序。兩者序列的比較揭示在los5-1推定的翻譯起始密碼子的下遊1083bp處G取代A。擴增和測序來自los5-2的F19K19.13基因，序列分析鑑定出los5-2中推定的翻譯起始密碼子的下遊1040bp處G取代A。上述結果強烈地暗示F19K19.13基因就是LOS5。
F19K19.13基因的產物被推定在相應於ABA3的ABA生物合成步驟中起作用。我們的遺傳分析也暗示los5-1可能是aba3-1的等位基因(表2)。綜合考慮，上述結果強烈地暗示F19K19.13是ABA3/LOS5基因。為證實該假說，我們測定了來自aba3-1和aba3-2等位基因的F19K19.13基因的序列，並將該DNA序列和那些來自Columbia(aba3-1背景基因型)和Landsberg(aba3-2背景基因型)的野生型植株的序列分別作比較，結果顯示在aba3-1中G取代A發生在3707位，在aba3-2等位體中有3處突變排成一排，在它們中間有非突變的核苷酸間隔，這些突變是3176位的G取代A，3178位的T取代A和3180位的T缺失。突變體的種類與所用的誘變的類型一致aba3-1由EMS誘變，aba3-2由γ-射線輻射來誘變(Léon-Kloosterzie等，1996)。
在四個los5/aba3突變等位基因中所有的F19K19.13DNA序列的改變被預測可導致推定的開放閱讀框的改變。綜上所述，上述的數據明確地闡述了LOS5基因座被鑑定為ABA3，和LOS5/ABA3基因是F19K19.13。在我們鑑定出los5突變體後，近來報導了第三個ABA3的突變等位基因，frsl/aba3-3(Llorente等，2000)。frsl/aba3-3(Llorente等，2000)中冰凍敏感表型和ABA缺陷的程度與los5十分相似，因此，我們建議將los5-1更名為aba3-4，將los5-2更名為aba3-5。
LOS5/ABA3編碼一個鉬輔因子硫化酶為獲得LOS5的cDNA序列，將抽提自Columbia野生型植株的mRNA進行逆轉錄PCR。RT-PCR的產物被克隆並測序(接受號AY034895)，在得到LOS5 cDNA克隆後，一個同樣的序列(接受號AF325457，Bittner F和Mendel R.R提交)也在Genebank中發布。比較它們的基因組DNA序列揭示LOS5基因由21個外顯子和20個內含子組成(圖7B)，開放閱讀框由2457個核苷酸組成，推斷編碼分子量估計為91.8kDa且具有819個胺基酸的蛋白。圖8中顯示了核酸序列和胺基酸序列(SEQ ID NO1和2)。
los5-1突變發生在第4外顯子上，胺基酸120位的色氨酸殘基發生突變成為終止密碼子因此截短了該蛋白。los5-2突變也發生在第4外顯子上，106位的小的甘氨酸殘基突變為大的帶負電荷的穀氨酸殘基。aba-1突變發生在第13外顯子上，469位的甘氨酸殘基突變為穀氨酸殘基。aba3-2突變發生在第10和11外顯子之間的連接處，387位的亮氨酸殘基突變為終止密碼子因此將該蛋白從第11外顯子處截去(圖7B和8)。
資料庫搜索顯示LOS5/ABA3和近來在牛中發現的鉬喋呤輔因子硫化酶(molybdopterin cofactor sulfurase)(MCSU)(Watanabe等，2000)具有高的序列同源性，屬於在從細菌到人中都發現的一個高度保守蛋白家族(圖10)。大體上來說，LOS5蛋白與人同系物相比具有35％的胺基酸序列同一性和53％的相似性，與果蠅的Mal蛋白相比具有34％的胺基酸序列同一性和49％的相似性，與牛的MCSU蛋白(Watanabe等，2000)相比具有35％的胺基酸序列同一性和51％的相似性，與構巢麴黴的HxB蛋白相比具有31％的胺基酸序列同一性和48％的相似性(Amrani等，1999)。LOS5/ABA3的全序列由三個結構域組成，其N-末端的結構域與I型摺疊的V類吡哆醛5』-磷酸不依賴轉氨酶[代表有異青黴素N異構酶、磷酸絲氨酸轉氨酶、天冬氨酸脫羧酶、藻青菌可溶性氫化酶的小亞基和來自棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的NifS蛋白]有高度的序列同源性。近來，許多NifS類似蛋白的結構已經被解出(Fujii等，2000；Kaiser等，2000)，因此有可能鑑別出LOS5/ABA3的NifS類似結構域的保守序列(圖7C)，這包括一個推定的吡哆醛磷酸結合基序和一個保守的半胱氨酸基序(圖7C)。圖10中分別標出了這些保守基序中關鍵殘基。值得注意的是在擬南芥基因組中許多推定的蛋白顯示出與NifS類似結構域具有明顯的序列相似性(數據未給出)。除MCSU家族成員外，連接NifS類似結構域和C-末端結構域的第二個結構域與其它蛋白顯示出極少的序列同源性，C-末端結構域與在擬南芥和其它生物體中發現的未知蛋白具有明顯的序列相似性。但是，擬南芥基因組沒有包含任何其它與LOS5/ABA3蛋白全長序列具有明顯的全序列同源性的蛋白，意味著LOS5/ABA3在基因組中是單拷貝基因。
LOS5/ABA3是廣泛表達和其在ABA和乾旱脅迫下表達的增強為分析LOS5/ABA3基因的表達型，全長的LOS5 cDNA作為用抽提自未受脅迫的野生型植株的不同部位的總RNA進行RNA印跡分析的探針。結果顯示在植株的所有部位包括根、莖、葉、花和果中可檢測到LOS5的表達基本在一個相當低的水平(圖10A)。令人感興趣地，在對乾旱(圖10B)、ABA、NaCl或PEG處理(圖10C)的響應中LOS5的轉錄水平有明顯的增加，冷處理沒有明顯地影響到LOS5的表達(圖10C和10D)。在脅迫處理的條件下los5-1幼苗中穩定的LOS5轉錄水平比野生型低相當多(圖10D)，暗示具有過早的終止密碼子的突變體的轉錄可能引發RNA監督機制以消除異常的轉錄(Hilleren和Parker，1999)。
在其它ABA缺陷型突變體、aba1-1(Koornneef等，1982)和在ABA-不敏感表型突變體、abi1-1(Koornneef等，1984)中的LOS5的表達也已經被分析。結果顯示在滲透脅迫下aba1中的LOS5的誘導與野生型沒有明顯的差別。在abi1-1突變體中，與野生型比較，其LOS5的誘導相當低(圖10D)。
比較los5/aba3、aba1和abi1突變體之間脅迫基因調節的影響與los5-1相反，aba1-1突變體在冷或ABA脅迫下RD29A轉錄的誘導沒有減少(圖10D)，事實上，在冷脅迫下與野生型相比aba1-1中的RD29A的誘導更高。在NaCl或PEG的脅迫下aba1-1突變體的RD29A的誘導減少，雖然該影響並不如los5-1的引入注目。los5-1和aba-1誘導的RD29A轉錄的不同影響與在los5-1和los6-1(不同的aba1等位基因)中所發現的RD29A-LUC表達的影響(圖6)基本上一致。通過冷和ABA脅迫，aba1-1能增強ADH的誘導，但是在NaCL或PEG脅迫中ADH的誘導減少(圖10D)。與los5-1突變體再一次明顯的對比是，los5-1突變體在冷、ABA、NaCL或PEG脅迫下ADH的誘導減少(圖10D)，在滲透脅迫下，aba1-1和los5-1的RAB18的誘導量幾乎完全消失，但是，在ABA作用下是los5-1而不是aba1-1的RAB18誘導量消失(圖10D)。比較aba1-1或los5-1，在脅迫下abi1-1突變體對RD29A或ADH的誘導具有更小的影響(圖10D)，然而，在ABA、NaCl或PEG作用下，abi1-1突變體的RAB18的誘導量減少(圖10D)。
因為CBF(Stockinger等，1997)和DREB2(Liu等，1998)轉錄因子家族是眾所周知的存在於RD29A和許多其它脅迫響應基因的啟動子中的DRE結合元件，所以測定ABA缺陷或非敏感表型突變體中的這些轉錄因子的脅迫誘導是否受到影響引起我們的注意。結果顯示los5-1/aba3-4或aba3-1中的冷特異CBF2/DREB1C沒有受明顯的影響，但是在aba2-1突變體中是增強的(圖10E)。曾報告在滲透脅迫中DREB2A被特異誘導(Liu等，1998)。在我們的處理條件下，在冷脅迫下DREB2A的表達量也上調節。有趣地是，儘管沒有ABA缺陷型突變體在滲透脅迫下的DREB2A的誘導有明顯的影響，但是與野生型相比los5顯示了增加的DREB2A的冷誘導(圖10E)。
討論ABA表型在植物的生長和發育及對環境脅迫的響應中扮演了許多重要的角色。因此了解植物中ABA生物合成的途徑是十分重要的。ABA生物合成突變作為十分重要的手段可用來了解ABA的生物合成和研究對脅迫環境響應的基因的調節。在擬南芥和其它植物如玉米、菸草和番茄中，基於ABA能促進種子休眠的遺傳分析已經產生出一系列的在ABA生物合成中缺陷的突變體(最新的觀點，見Koornneef等，1998；Culter和Krochko，1999；Loitenberg等，1999)。這些突變體的特徵鑑定和生物化學研究已經揭示出在植物中ABA通過一個經裂解類胡蘿蔔素前體的「間接」途徑被合成。擬南芥aba1(和菸草aba2)突變體缺乏環氧化玉米黃質和從花葯黃質轉變為紫黃質的過程(Rock和Zeevaart，1991)和編碼表氧化玉米黃質的受影響的基因(Marin等，1996)。通過VP14蛋白氧化裂解9-順-新黃質產生黃氧素，通過利用玉米vp14突變體(Tan等，1997)編碼VP14基因已被分離，該基因編碼9-順-環氧類胡蘿蔔素過氧化酶(NCED)(Schwartz等，1997b)。考慮到黃氧素經AB-乙醛通過兩步反應轉變成ABA，擬南芥aba2突變體削弱了該反應的第一步，因此在AB-乙醛中無法轉變黃氧素。擬南芥aba3突變體缺失了ABA生物合成的最後一步，即通過ABA乙醛氧化酶催化將AB-乙醛轉變為ABA(Schwartz等，1997a)。乙醛氧化酶脫輔基蛋白(如Seo等，2000b)或鉬輔因子(MoCo)合成酶的突變會削弱ABA的生物合成和導致植物中ABA不足。
鉬輔因子由單個的鉬原子與一個有機鉬喋呤分子的一半的硫原子配位所組成。鉬輔因子在有機體細胞中是高保守的且在包含在氮、硫和碳的新陳代謝中的氧化還原反應中被用作為轉移一個氧原子(見Kisher等評論，1997)。有報導MoCo生物合成的缺陷與在人或其它動物的許多疾病有關(見Reiss評論，2000)。在植物中，已知有三組包含MoCo的酶(參見Mendel和Schwarz評論，1999)硝酸鹽還原酶(NR)、黃嘌呤脫氫酶(XDH)和乙醛氧化酶(AO)。在擬南芥基因組的互補序列中也存在第四組酶，亞硫酸鹽氧化酶。在利用MoCo的二氧型方面，硝酸鹽氧化酶和亞硫酸鹽氧化酶存在著差別，但是，對於插入一個硫原子置換兩個末端氧原子其中之一的MoCo被修飾的生物合成的最後一步(圖11)，黃嘌呤脫氫酶和乙醛氧化酶是必需的，鉬喋呤輔因子硫化酶(MCSU)催化上述硫化反應。來自於果蠅(maroon類似，mal)(Wahl等，1982)、構巢麴黴(hxB)(Scazzocchio，1973；Amrani等，1999)和牛(watanabe等，2000)中的該步反應中存在缺陷的突變體已被鑑定。在該硫化反應步驟中缺陷的植物突變體也已被鑑定出，即菸草aba1突變體(Leydecker等，1995)，番茄flacca突變體(Marin和Marion-Poll，1997)，和擬南芥aba3突變體(Schwartz等，1997a)。生物化學特性認為這些植物突變體在ABA生物合成的最後一步中都存在缺陷，正如所期望的，這些缺陷特異於AO和XDH，但不特異於NR(Leydecker等，1995；Marin和Marion-Poll，1997；Schwartz等，1997a)。與果蠅mal突變體所類似，在擬南芥aba3突變體(Schwartz等，1997a)、菸草aba1突變體(Akaba等，1998)和番茄flacca突變體(Sagi等，1999)中用Na2S再硫化植物突變體的抽提物可以恢復XDH和AO的活性。先前的研究認為相應於各自突變體的野生型基因可能編碼在MoCo被修飾的最後一步反應中起作用的鉬輔因子硫化酶，該酶是乙醛氧化酶和黃嘌呤脫氫酶催化活性的特異因子。
削弱ABA生物合成的los5突變體的鑑定和克隆LOS5/ABA3基因闡明了LOS5/ABA3實際上是編碼一個推定的鉬輔因子硫化酶(MCSU)。自由的鉬輔因子是十分的不穩定，直到今日MCSU硫化MoCo或其它底物的酶活性還未見報導。雖然如此，來自植物和動物學研究的大量關於突變體抽提物再硫化能恢復AO或XDH或其它酶活性的證據強烈暗示MCSU在體內對MoCo的脫硫型具有硫化的活性，此外，和其它蛋白序列比較也支持MCSU具有潛在的催化活性。
與其它的MCSU蛋白類似，LOS5/ABA3基因產物在它的N-末端區域與NifS類似蛋白具有高的序列相似性(圖7C)。棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)的NifS蛋白對於固氮酶的活性是必需的，其是唯一在電子轉移中不用鉬喋呤輔因子而用鐵-鉬-硫蔟的含鉬的酶。雖然在固氮作用中NifS蛋白的確切作用未知，但是NifS蛋白在體外顯示能利用L-半胱氨酸底物來合成丙氨酸和硫化物，因此，NifS蛋白看來可通過動用來自L-半胱氨酸底物的無機硫化物在金屬蔟化合物的生物合成中作為半胱氨酸的脫硫酶(Zheng等，1993)，該反應十分類似於LOS5/ABA3催化硫化MoCo脫硫型的化學反應。事實上，NifS蛋白所需要的吡哆醛磷酸鹽結合基序和保守的半胱氨酸基序在LOS5/ABA3和它在其它生物體中的同系物中總是高度保守的(圖7C和8)，以此推測的類型V轉氨酶類似蛋白的成員和通過試驗分析(Zheng等，1993)的吡哆醛磷酸鹽(PLP)都是NifS蛋白的輔因子。假定NifS和在該類中其它的PLP依賴型蛋白高度相似，那麼PLP也可能是LOS5/ABA3的輔因子。通過LOS5/ABA3和其它近來已解出結構的NifS蛋白(Fujii等，2000；Kaiser等，2000)的比較，271位保守的賴氨酸殘基可能是PLP共價連接以形成席夫鹼的位點(Fujii等，2000)。同樣地，430位保守的半胱氨酸殘基(圖10)可能是轉硫化反應的給硫體(圖11)。在LOS5/ABA3同系物中也發現這兩個保守基序(圖10)。推測PLP和半胱氨酸基序對於LOS5/ABA3的催化活性是必需的。令人感興趣地是，aba3-1的突變發生在NifS類似區域外，但是仍然在高保守區域內，暗示該區域對於酶的功能也是必需的。
LOS5/ABA3的總的結構類似於一個通過融合兩個獨立的蛋白所引出的嵌合蛋白。C末端區域的功能雖未知，但鑑於來自不同生物的MCSU蛋白中的該結構域的高度相似性和其與擬南芥基因組中的許多未知蛋白的高度相似性，因此其也是很重要的。
涉及此明顯的多功能域結構的令人感興趣的是，los5-1和los5-2突變體都具有獨特的葉表型(圖5B)，但是在aba3-1和aba3-2中，沒有如此明顯的葉型(數據未給出)。值得注意的是，los5-1和los5-2突變發生在N末端部位，而aba3-1和aba3-2的突變發生在蛋白的中間部分。因此吸引我們推測aba3-1和aba3-2突變蛋白的N末端區域可能具有一些對於維持野生型葉子表型需要的活性。在另一方面，los5-1和los5-2突變體可能損失該活性，導致葉子外形的改變。
因為在擬南芥基因組中LOS5/ABA3是單拷貝基因，所以其廣泛的分布並不令人驚奇(圖10A)，與之相比乙醛氧化酶(AAO)基因家族每一成員都有不同的表達譜(Seo等，2000b)。然而，令人注意的是番茄flacca突變體的幼芽被報告丟失了AO和XDH活性，而在具有顯著數量ABA累積的根中保留了可測量到的活性(Sagi等，1999)。極有可能在番茄中存在超過一種的LOS5/ABA3類似MCSU基因，且根特異性同工酶在flacca突變體中還保留活性。除了flacca突變體的幼芽的ABA生物合成被削弱外，還顯示該突變體從根到幼芽的ABA運輸有同樣可能減少(Sagi等，1999)。
在目前研究中，我們證明當植物用乾旱、鹽或ABA來處理時，LOS5/ABA3基因的表達是上調節的(圖10)。我們還注意到LOS5/ABA3的啟動子區域包含推定的ABREs(如在轉錄起始密碼子上遊-253位點的ACGTGG)和DRE/CRT類似元件，暗示通過ABA和乾旱/鹽脅迫調節LOS5/ABA3基因可能的方式與其它的脅迫響應基因類似。在ABA生物合成的途徑中，通常認為VP14蛋白催化的氧化裂解9-順-新黃質的步驟是限速步驟(Tan等，1997；Schwartz等，1997b；Loitenberg等，1999；Iuchi等，2000；Thompson等，2000；Taylor等，2000)。已知LOS5/ABA3轉錄的數量相當低和事實上在擬南芥中其是唯一編碼MCSU的基因，LOS5/ABA3可能也調節ABA的生物合成。與低溫在內源性ABA生物合成中有限的影響(Thomashow，1999)所一致的是低溫對於LOS5/ABA3基因的表達幾乎沒有什麼影響(圖9C和9D)。Qin和Zeevaart(1999)也發現了低溫不誘導PvNECD1(在豆中VP14的同系物)的表達，乾旱處理(20％的鮮重損失和保溫3或6小時)明顯地增加LOS5/ABA3的表達(圖10B)，但是同樣的處理卻無法上調節AAO3基因的表達(數據未給出)。AAO3誘導減少的結果與Seo等(2000a)所觀察到在擬南芥幼苗中脫水處理(即在通風櫥中3小時)明顯誘導AAO3表達不同。這種差別的原因可能是因為我們的脅迫條件(在靜止的空氣中放置大約40分鐘以減少20％的鮮重，然後在100％的溼度下保溫3或6小時)沒有那麼嚴格，我們的結果暗示LOS5/ABA3可能是ABA生物合成反應最後一步的關鍵調節因子。與推測所一致的是，Segi等(1999)發現用Na2S硫化能增加野生型番茄的粗抽提物的AO和XDH的活性，暗示MoCo的硫化反應限制了AB-乙醛氧化酶的活性。LOS5/ABA3表達的ABA上調節(圖9C和9D)是十分令人感興趣且還暗示ABA能正反饋調節ABA的生物合成。
可得到的在ABA生物合成中產生缺陷的植物突變體已經提供了一個極好的機會來研究在不同的非生物脅迫下ABA對基因的調節，許多研究者已經利用aba1或abi1和abi2和相關的野生型植物一同來研究上述內容。擬南芥ABA缺陷型突變體aba1是第一個從擬南芥中分離的在ABA生物合成中缺陷的突變體(Koornneef等，1982)。近來，另外的擬南芥ABA缺陷型突變體，aba2和aba3也得到了(Léon-Kloosterziel等，1996)，然而，沒有報導這些近來所分離的突變體中脅迫基因的調節方式。
對aba1或abi1/2的廣泛的研究已經產生了相當多的結果，但是其中一些自相矛盾。例如，儘管Savoure等(1997)因為在冷或乾旱處理下在野生型和aba1中觀察到P5CS基因的表達水平相似，因此報導了該基因的表達是ABA不依賴型，他們認為ABA可能影響轉錄後的脯氨酸生物合成(Savoure等，1997)。在另一方面，Yoshiba等(1990)報導了在乾旱和鹽脅迫誘導的AtP5CS1受ABA依賴型和ABA不依賴型兩種途徑調節，此外，Strizhov等(1997)發現脅迫誘導的P5CS1基因的表達必需ABA，這與我們的發現是一致的(圖2)。為幫助解釋清楚此種的情況，許多已經發表的評論已經得到一致的結果(Leung和Giraudat，1998；Shinozaki和Yamaguichi-Shinozaki，1997；Thomashow，1999；Rock，2000)。雖然低溫處理能引發ABA的暫時的增加，在溫暖的溫度下施用ABA能誘導冷脅迫響應基因的表達並增加植物的耐凍性，通常認為ABA在調節DRE/CRT型基因的表達中不是一個重要的角色(Thomashow，1999)。在目前的研究中，我們發現在低溫處理的條件下，los5-1的幼苗的RD29A-LUC轉基因的表達表現出驚奇的減少(圖1B和1G)，RNA印跡分析顯示在低溫下los5-1突變體植株中COR15、KIN1、COR47、RD29A、RAB18和ADH的誘導明顯地減少(圖2和9D)。但是，在aba1-1中並沒有觀察到los5-1中所見的冷調節基因表達的減少(圖10D)，實際上，在aba1-1中ADH和RD29A的冷誘導增強了(圖10D)。類似地，los6/aba1突變體幼苗中RD29A-LUC的冷誘導表達也增強了(圖6B)。我們關於los6/aba1的結果和先前所完成的aba1-1的冷調節基因表達的結果(見Thomashow，1999的評論)是一致的。los5和aba1突變體不同的影響提出一個問題，是否ABA缺乏的結果在LOS5/ABA3冷調節基因的表達中扮演著一個重要的角色。圖6B中顯示了我們的試驗部分證實了該結果儘管用ABA處理能補充los6/aba1的冷調節基因RD29A-LUC表達的不足，但是在los5/aba3中同樣條件的處理卻失敗了(圖6B)，該結果暗示除了在ABA生物合成中的角色外，在冷調節中LOS5/ABA3還可能具有額外的功能。與此意見一致的是發現了在與los5相關的野生型植株中，內源性ABA能促使COR47、RD22、RD29A和ADH(圖2、6和9D)的表達相似或略高，而ABA卻無法誘導COR15和P5CS的表達，且使KIN1的誘導表達減少(圖2)。這些結果強烈地暗示冷信號需要LOS5/ABA3與ABA生物合成沒有直接相關的功能。目前，還不清楚LOS5/ABA3與冷或ABA調節中涉及的一些基因怎樣相互作用。
與低溫處理形成對比的是，乾旱脅迫能驚奇地刺激ABA生物合成的全過程，因此ABA與乾旱/鹽脅迫響應的關係更密切(Ingram和Bartels，1996；Bary，1993)。乾旱脅迫中的基因調節被認為包括ABA依賴和ABA不依賴的兩種途徑(Shinozaki和Yamaguchi-Shinozaki，1997)，因為如RD29A、KIN1和COR47基因具有ABRE複合物和DRE/CRT元件，推測它們在缺乏ABA的條件下可通過非生物脅迫來單獨激活，用aba1或abi1突變體的分析的確顯示了可能就是這個原因(Thoamshow，1999；Shinozki和Yamaguchi-Shinozaki，1997)。但是，我們關於los5突變體的結果清楚地表明存在一個相當不同的結果。在滲透脅迫下，los5突變體中的RD29A-LUC的表達幾乎消失(圖1F和1G)，RNA印跡分析也發現在鹽和乾旱(PEG)脅迫下los5突變體中COR15、KIN1、RD22、P5CS和RAB18的誘導實質上消失(圖2和9D)，且在逆境脅迫下還十分嚴重地削弱了RD29A、COR47和ADH的誘導(圖2和9D)。為確定los5突變體的滲透脅迫調節基因表達的影響是否因為ABA的缺乏，我們用ABA和鹽脅迫一同來分析RD29A-LUC的表達。結果指出在los5-1和los6/aba1突變體中ABA能使RD29A-LUC的表達恢復到野生型的水平(圖6A)。我們先前的野生型植株的RNA印跡分析顯示在此處理的條件下，RD29A-LUC的發光量如實地反映了內源性RD29A的表達譜(Xiong等，1999b)。這些結果暗示在los5突變體植株中觀察到的鹽/乾旱調節基因表達的不足極有可能是因為ABA的不足。目前，可供選擇的可能性是不能完全排除LOS5在調節『ABA-不依賴』的滲透脅迫信號過程中還有與ABA生物合成不相關的不為人知的功能，因為在aba1/los6中在乾旱或鹽脅迫下基因誘導的數量的減少遠不如los5(圖6A)，所以通過大量的試驗證實這些突變體具有相似程度的ABA不足。
los5的突變看上去對於鹽脅迫調節DREB2A的表達幾乎沒有影響(圖10E)，極有可能的是DREB2A的功能需要ABA-依賴因子來激活下遊基因的表達。先前，我們用RD29A-LUC作為分子標記進行的遺傳學分析顯示ABA-依賴和ABA-不依賴信號途徑可能互相獨立，當然，在它們之間還存在著密切的聯繫或「串話」(Ishitani等，1997；Xiong等，1999a)，los5突變體的分子特徵還進一步地對『ABA-不依賴』脅迫的信號轉換途徑的不依賴ABA產生懷疑，至少還涉及到DRE/CRT基因。此外，還證實DREB2A單獨異常的表達不會激活下遊基因的表達(Liu等，1998)，Liu等(1998)還認為在失活的脅迫響應基因中的DREB2A的活性可能需要轉錄後的修飾。因此，有可能的是DREB2A的磷酸化/去磷酸化或它的輔因子的功能可能依賴於ABA調節分子如ABI1、ABI2、CDPKs或無數的其它ABA響應調節因子(如Leung等，1997；Leung和Girauda，1998；Finkelstein和Lynch，2000；Rock，2000；Merlot等，2001)。ABA和脅迫信號互相依賴的關係可能成為本研究(圖6A)和別處(Bostock和Quatrano，1992；Xiong等，1996b)所觀察到的脅迫響應基因調節過程中ABA和乾旱/鹽脅迫的影響增效的機制的基礎。
實施例以上已對本發明做了全面的描述，下面的實施例只為更好地理解本發明而對本發明的進一步說明，除非另有特殊情況，否則並不限制本發明。
實施例1鑑定LOS5/ABA3基因座分離los5突變體通過農桿菌介導的轉化獲得表達RD29A-LUC轉基因的擬南芥(C24生態型)(稱為野生型)(Ishitani等，1997)，用乙基甲磺酸鹽誘變RD29A-LUC野生型的種子(Ishitani等，1997)。M2代在包含全濃度的Murashige和Skoog鹽基(MS鹽基，JRH Biosceicnes，Lenex，KS)的0.6％瓊脂平板中培養，在連續的白光和22±2℃的環境下發芽和生長。使用熱電致冷CCD照相機篩選一周齡的在低溫、ABA或滲透脅迫的條件下具有改變的RD29A-LUC(如發光)表達響應的突變體幼苗。為得到發光圖像，植株用溶於0.01％Triton X-100中的1mM蟲螢光素噴霧，並在照相前在黑暗中放置5分鐘，所有的圖像的曝光時間都是5分鐘，每一株幼苗的發光強度用WinView軟體來定量。
脅迫和ABA處理為進行ABA處理，100μM(±)-順，反-脫落酸水溶液被均勻地噴霧到幼苗的葉片上，而後該植株在冷-白光照下、在室溫保溫4小時(用於發光照相)或3小時(用於RNA分析)。為進行NaCl或PEG處理，將MS平板上的幼苗轉移到添加有300mM NaCl或30％聚乙二醇(分子量6,000)的MS溶液浸泡的濾紙上，保溫5小時。除非另有規定，將生長在平板上的幼苗在0℃在黑暗的環境中保溫48小時(為圖像分析)或12小時(為RNA分析)作為圖像分析和RNA分析的冷處理。因為在-5℃或-10℃長時間處理，會導致瓊脂培養基的冰凍，所以上述冰凍溫度的處理僅能持續3小時，處理後發光圖像獲得前，平板在室溫下放置2小時解凍。為進行ABA加NaCl的處理，幼苗被轉移到含300mM NaCl的MS溶液浸泡的濾紙上，然後馬上噴霧100μM ABA，在獲得發光圖像前，該植株在冷-白光下保溫4小時。為進行低溫加ABA處理，瓊脂平板上的幼苗在0±1℃中臨時保溫10分鐘，然後用100μM ABA噴霧，並在圖像分析前在黑暗環境和0±1℃下保溫48小時。
遺傳學分析los5突變體和作圖克隆LOS5為進行遺傳學分析，los5突變體與野生型和其它我們所分離的具有相似的發光表型的突變體雜交。用F1代和F2代幼苗來作發光分析並獲得los5發光表型。los5-1也和aba1、aba2和aba3突變體(自擬南芥生物資源中心獲得，Columbus，OH)雜交，部分得到的F1和F2代幼苗用300mM NaCl處理以發光圖像分析，部分在減少的溼度下直接在土壤中培養以獲得萎蔫表型。為進行los5突變體的遺傳作圖，C24生態型的los5-1突變體和Columbia生態型的野生型植株雜交。產生的F1代自交，當用冷處理和ABA的對照處理來排除那些沒有RD29A-LUC轉基因的突變體時，基於它們減少的發光量，在分離的F2代中純合的los5-1突變體可被篩選出。在NaCl處理中，基於它們減少的發光量，部分的幼苗也被篩選出。如先前所述的方法來進行LOS5的作圖(Lee等，2001)，通過測量斷開的基因組DNA序列所得到的SSLP標記在作重複標記(RepeatMasker)程序(http//ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker)中作為簡單重複標記使用。在被用於作為作圖的分子標記的C24和Columbia生態型之間，在4％瓊脂糖凝膠上，引物和這些簡單重複標記的側翼區配對來產生有大小多態性PCR產物。
RNA分析用如上段所述的冷、ABA、NaCl或PEG來處理MS瓊脂平板上的10天齡幼苗。在乾旱處理中，盆土中的蓮座狀階段幼苗被分離自土壤表面並允許損失20％的鮮重，該脫水材料在液氮中冷凍以進行RNA抽提前，在相對溼度為100％的容器中保溫3或6小時。來自對照或經處理的植株的總RNA用(Ishitani等，1998)所述的方法來抽提和分析，基因特異性探針已描述(Ishitani等，1998；Lee等，2001)。
脅迫耐性試驗為進行冷凍敏感性試驗，在人工培養箱(22±2℃，16小時光照和8小時黑暗)中生長3周的盆土中的野生型和los5幼苗，先在光照48小時4℃的環境中進行冷馴化。冷馴化後，這些植株在-7℃下冰凍5小時，完成該處理後，馬上將植株轉移到白光中4℃保溫過夜，第二天早晨這些植株被放置在生長箱中，用本文中所描述的方法依次測量幼苗的損傷程度。
為進行NaCl耐性測試，生長在MS平板(用1.2％瓊脂來固化)上的7天齡los5-1和野生型幼苗被轉移到添加有不同濃度NaCl的MS瓊脂平板中，這些平板垂直地放置在白光和22±2℃的環境中，每日測量根的伸長，直到第10天。為測定由PEG處理所導致的幼苗的離子滲漏，生長在MS瓊脂平板中的一周齡野生型和los5-1幼苗被仔細地從平板上剝離，先用蒸餾水洗滌，後放在含30％聚乙二醇(PEG)(分子量6,000)的溶液中5小時。處理後，幼苗先用蒸餾水衝洗，接著馬上放在有5ml水的試管中，在測量電解質含量前，試管輕輕地搖動3小時，每一次處理做四次重複。
水分損失測定為進行水分損失測定，從土壤的表面分離的蓮座狀階段的植株，在塑料稱量皿中馬上稱重，該裝有植株的稱量皿放置在實驗室工作檯上(相對溼度～30％)，在規定的一定時間間隔內稱重，作四次重複，基於最初植株的重量計算出鮮重損失的百分比。
脯氨酸試驗一周齡生長在MS瓊脂平板上的los5-1和野生型幼苗用50μM ABA噴霧或轉移到在皮氏培養皿中浸泡有150mM NaCl的濾紙上，在白光照和22±2℃的環境中保溫24小時。處理後，樣品在液氮中冰凍並在-80℃保存來進行脯氨酸試驗。脯氨酸的濃度用如Bates等(1973)所描述的方法來測定。
ABA測定切離自土壤中生長3周齡突變體和野生型植株的蓮座狀葉子放置在實驗室的工作檯上，在葉子損失了30％的最初鮮重後(大約用時2小時)，它們用溼紙巾包住並被置於密封的塑膠袋中再放5小時，作為對照的無脅迫的葉子被直接置於高溼度的密封的塑膠袋中而不損失鮮重。該葉組織用液氮來冰凍並磨成粉末，一克的組織樣品懸浮在15mL含80％甲醇、100mg/L丁基羥基甲苯和0.5g/L檸檬酸的水合物抽提液中。懸浮液在4℃下攪拌過夜，1,000g離心20分鐘，上清液轉移到新的試管中，然後真空乾燥，幹的殘留物用含100μL甲醇加900μL的Tris鹽緩衝液(50mMTris，0.1mM MgCl·6H2O，0.15M NaCl，pH7.8)溶解。該溶液中的ABA濃度用Phytodetek ABA免疫測定試劑盒(Idetek，，Inc.，Sunnyvale，CA)來檢測。
實施例2過量表達LOS5基因增加植物的耐旱性因為失去LOS5基因功能的突變體導致脅迫響應基因的不調節表達和增加對乾旱和鹽脅迫的敏感性，所以推測增加LOS5的表達可能影響在脅迫環境中的基因表達型和增加植物的耐旱性。
為了測試這種可能性，融合有CaMV 35S啟動子和轉錄增強子和LOS5全長cDNA序列被轉錄。插入片段被克隆進二元載體pCAMBIA1200中，目標質粒被分別轉移進擬南芥Columbia和C24(包含RD29A-LUC報告基因)生態型。大約70個具有各自背景生態型的轉化體被選擇用於進一步的測試，來檢查LOS5基因的過量表達對脅迫基因調節和植物水行為的影響。分析轉基因植物的幼苗1)它們在鹽脅迫處理下的RD29A-LUC轉基因的表達量；2)通過測量分離的葉片的水分損失速率得到它們的蒸騰速率；以及3)在土壤中生長的植株的耐旱性。
C24背景型中7個品系的結果表明，在300mM NaCl處理下，LOS5過量表達基因品系的RD29A-LUC報告基因的表達水平比野生型植株高出39％到96％，在4小時的試驗過程中，LOS5過量表達植株分離的葉子的水分蒸騰速率明顯地比測試的3個野生型品系的植株低。當分離的葉子放置在室內乾燥時，可以看到減少蒸騰(見圖12)，減少蒸騰可以明顯地增加植物的耐旱性。
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很明顯，在上述說明的啟示下能對本發明進行許多修改和變化。因此在所附的權利要求範圍內，除了在此描述的實例外，本發明可以有其它的方式。
熊等人的植物細胞第13卷，2001年9月2063-2083頁的內容在此全部作為參考。
序列表110朱健康熊立明120增加植物脅迫性的方法130227010US201606170PatentIn version 3.121012112460212DNA213擬南芥4001atggaagcat ttcttaagga attcggagat tattatggat acccagatgg tcccaagaac 60attcaagaga tccgcgacac cgaattcaag agattagata aaggtgttgt atacttggat120catgctggtt ctactttgta ttctgagttg cagatggaat atatttttaa ggacttcaca180agcaatgttt ttggaaatcc acatagtcaa agtgatatca gttcggccac cagtgacctt240atagcggatg ctcgacatca ggtgcttgaa tactttaatg catctcctga agattacagt300tgcttattca cctccggagc cacagcagcg ctgaagcttg tcggagagac ttttccgtgg360acccaagaca gtaatttttt gtataccatg gagaatcaca acagtgtact tggtattagg420gaatatgcat tagctcaagg tgcttcagca tgtgcagtgg atattgaaga ggcagctaac480
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1.一種增加植物脅迫抗性的方法，包含在植物中過量表達鉬輔因子硫化酶。
2.權利要求1的方法，其中的植物具有增強的耐旱性。
3.權利要求1的方法，其中的植物具有增強的耐鹽性。
4.權利要求1的方法，其中的植物具有增強的耐凍性。
5.權利要求1的方法，其中的鉬輔因子硫化酶具有SEQ ID NO2的胺基酸序列。
6.權利要求1的方法，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有SEQ IDNO2所示的序列。
7.權利要求1的方法，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有和SEQID NO1至少70％相同的序列。
8.權利要求1的方法，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有和SEQID NO1至少90％相同的序列。
9.權利要求1的方法，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸在嚴格條件下能與SEQ ID NO1的互補序列雜交，所述的嚴格條件包含在5X SSC和50到68℃下衝洗。
10.權利要求1的方法，其中鉬輔因子硫化酶的胺基酸序列具有和SEQ ID NO2至少80％的同源性。
11.權利要求1的方法，其中鉬輔因子硫化酶的胺基酸序列具有和SEQ ID NO2至少90％的同源性。
12.權利要求1的方法，其中的植物是擬南芥。
13.權利要求1的方法，其中的植物選自包括小麥、玉米、花生、棉花，燕麥和大豆的組中。
14.權利要求1的方法，其中的植物被編碼鉬輔因子硫化酶的載體轉化。
15.權利要求14的方法，其中的植物具有增強的耐旱性。
16.權利要求14的方法，其中的植物具有增強的耐鹽性。
17.權利要求14的方法，其中的植物具有增強的耐凍性。
18.權利要求14的方法，其中的鉬輔因子硫化酶具有SEQ ID NO2的胺基酸序列。
19.權利要求14的方法，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有SEQID NO1所示的序列。
20.權利要求14的方法，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有和SEQ ID NO1至少70％相同的序列。
21.權利要求14的方法，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有和SEQ ID NO1至少90％相同的序列。
22.權利要求14的方法，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸在嚴格條件下能與SEQ ID NO1的互補序列雜交，所述的嚴格條件包含在5X SSC和50到68℃下衝洗。
23.權利要求14的方法，其中鉬輔因子硫化酶的胺基酸序列具有和SEQ ID NO2至少80％的同源性。
24.權利要求14的方法，其中鉬輔因子硫化酶的胺基酸序列具有和SEQ ID NO2至少90％的同源性。
25.權利要求14的方法，其中的植物是擬南芥。
26.權利要求14的方法，其中的植物選自包括小麥、玉米、花生、棉花，燕麥和大豆的組中。
27.一種用編碼鉬輔因子硫化酶核酸轉化的植物。
28.權利要求27的被轉化的植物，其中的植物具有增強的耐旱性。
29.權利要求27的被轉化的植物，其中的植物具有增強的耐鹽性。
30.權利要求27的被轉化的植物，其中的植物具有增強的耐凍性。
31.權利要求27的被轉化的植物，其中的鉬輔因子硫化酶具有SEQID NO2的胺基酸序列。
32.權利要求27的被轉化的植物，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有SEQ ID NO1所示的序列。
33.權利要求27的被轉化的植物，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有和SEQ ID NO1至少70％相同的序列。
34.權利要求27的被轉化的植物，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有和SEQ ID NO1至少90％相同的序列。
35.權利要求27的被轉化的植物，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸在嚴格條件下能與SEQ ID NO1的互補序列雜交，所述的嚴格條件包含在5X SSC和50到68℃下衝洗。
36.權利要求27的被轉化的植物，其中鉬輔因子硫化酶的胺基酸序列具有和SEQ ID NO2至少80％的同源性。
37.權利要求27的被轉化的植物，其中鉬輔因子硫化酶的胺基酸序列具有和SEQ ID NO2至少90％的同源性。
38.權利要求27的被轉化的植物，其中的植物是擬南芥。
39.權利要求27的被轉化的植物，其中的植物選自包括小麥、玉米、花生、棉花，燕麥和大豆的組中。
40.製備權利要求27的被轉化的植物的被轉化的植物，包含用編碼鉬輔因子硫化酶的核酸轉化該植物。
41.一種用編碼鉬輔因子硫化酶的核酸轉化的植物細胞。
42.權利要求41的被轉化的植物細胞，其中的植物具有增強的耐旱性。
43.權利要求41的被轉化的植物細胞，其中的植物具有增強的耐鹽性。
44.權利要求41的被轉化的植物細胞，其中的植物具有增強的耐凍性。
45.權利要求41的被轉化的植物細胞，其中的鉬輔因子硫化酶具有SEQ ID NO2的胺基酸序列。
46.權利要求41的被轉化的植物細胞，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有SEQ ID NO1所示的序列。
47.權利要求41的被轉化的植物細胞，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有和SEQ ID NO1至少70％相同的序列。
48.權利要求41的被轉化的植物細胞，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有和SEQ ID NO1至少90％相同的序列。
49.權利要求41的被轉化的植物細胞，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸在嚴格條件下能與SEQ ID NO1的互補序列雜交，所述的嚴格條件包含在5X SSC和50到68℃下衝洗。
50.權利要求41的被轉化的植物細胞，其中鉬輔因子硫化酶的胺基酸序列具有和SEQ ID NO2至少80％的同源性。
51.權利要求41的被轉化的植物細胞，其中鉬輔因子硫化酶的胺基酸序列具有和SEQ ID NO2至少90％的同源性。
52.權利要求41的被轉化的植物細胞，其中的植物是擬南芥。
53.權利要求41的被轉化的植物細胞，其中的植物選自包括小麥、玉米、花生、棉花，燕麥和大豆的組中。
54.一種製備權利要求41的被轉化的植物細胞的方法，包含用編碼鉬輔因子硫化酶的核酸轉化該細胞。
55.一種在植物體內過量表達鉬輔因子硫化酶的方法，包含用編碼鉬輔因子硫化酶的載體轉化該植物。
56.權利要求55的方法，其中的植物具有增強的耐旱性。
57.權利要求55的方法，其中的植物具有增強的耐鹽性。
58.權利要求55的方法，其中的植物具有增強的耐凍性。
59.權利要求55的方法，其中的鉬輔因子硫化酶具有SEQ ID NO2的胺基酸序列。
60.權利要求55的方法，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有SEQID NO1所示的序列。
61.權利要求55的方法，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有和SEQ ID NO1至少70％相同的序列。
62.權利要求55的方法，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有和SEQ ID NO1至少90％相同的序列。
63.權利要求55的方法，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸在嚴格條件下能與SEQ ID NO1的互補序列雜交，所述的嚴格條件包含在5X SSC和50到68℃下衝洗。
64.權利要求55的方法，其中鉬輔因子硫化酶的胺基酸序列具有和SEQ ID NO2至少80％的同源性。
65.權利要求55的方法，其中鉬輔因子硫化酶的胺基酸序列具有和SEQ ID NO2至少90％的同源性。
66.權利要求55的方法，其中的植物是擬南芥。
67.權利要求55的方法，其中的植物選自包括小麥、玉米、花生、棉花，燕麥和大豆的組中。
68.一種在植物細胞內過量表達鉬輔因子硫化酶的方法，包含用編碼鉬輔因子硫化酶的載體轉化該植物。
69.權利要求68的方法，其中的植物具有增強的耐旱性。
70.權利要求68的方法，其中的植物具有增強的耐鹽性。
71.權利要求68的方法，其中的植物具有增強的耐凍性。
72.權利要求68的方法，其中的鉬輔因子硫化酶具有SEQ ID NO2的胺基酸序列。
73.權利要求68的方法，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有SEQID NO1所示的序列。
74.權利要求68的方法，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有和SEQ ID NO1至少70％相同的序列。
75.權利要求68的方法，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸具有和SEQ ID NO1至少90％相同的序列。
76.權利要求68的方法，其中編碼鉬輔因子硫化酶的核酸在嚴格條件下能與SEQ ID NO1的互補序列雜交，所述的嚴格條件包含在5X SSC和50到68℃下衝洗。
77.權利要求68的方法，其中鉬輔因子硫化酶的胺基酸序列具有和SEQ ID NO2至少80％的同源性。
78.權利要求68的方法，其中鉬輔因子硫化酶的胺基酸序列具有和SEQ ID NO2至少90％的同源性。
79.權利要求68的方法，其中的植物是擬南芥。
80.權利要求68的方法，其中的植物細胞選自包括小麥、玉米、花生、棉花，燕麥和大豆的組中。
81.一種具有如SEQ ID NO2所示的胺基酸序列的分離和純化的鉬輔因子硫化酶。
82.一種具有鉬輔因子硫化酶活性的分離和純化的酶，其中該酶的胺基酸序列與SEQ ID NO2有70％到小於100％的同源性。
83.一種產生權利要求81的鉬輔因子硫化酶的方法，包含在該鉬輔因子硫化酶被表達的條件下培養編碼鉬輔因子硫化酶的核酸轉化的宿主細胞，和分離該鉬輔因子硫化酶。
84.一種產生權利要求82的酶的方法，包含在該酶被表達的條件下培養編碼該酶的核酸轉化的宿主細胞，和分離該酶。
全文摘要
本發明提供用於提高植物抗旱性的方法和組合物。特別是，本發明採用在植物和植物細胞中過量表達鉬輔因子硫化酶。
文檔編號C12N15/82GK1553950SQ02817526
公開日2004年12月8日 申請日期2002年9月6日 優先權日2001年9月6日
發明者朱健康, 熊立明 申請人:美國亞利桑那大學董事會