固體支持物和提高生物材料從其中的回收率的方法

2024-04-05 11:39:05

固體支持物和提高生物材料從其中的回收率的方法
【專利摘要】本發明涉及用於生物材料的儲存和進一步處理的固體支持物。本發明特別地涉及以下固體支持物：其具有至少一個表面，所述表面包被有提高生物材料從所述支持物的回收率的化學品。還描述了製備和使用所述固體支持物的方法。
【專利說明】固體支持物和提高生物材料從其中的回收率的方法
發明領域
[0001]本發明涉及固體支持物，特別地涉及可用於生物材料例如生物製藥藥物的儲存、回收和進一步處理的固體支持物。
[0002]發明背景
[0003]使用固體支持物例如濾紙來收集和分析人血液可回溯至I960年代早期，當時Robert Guthrie博士為檢測苯丙酮尿症而使用幹血斑(DBS)樣本測定新生兒中的苯丙氨酸(Mei，J.等，2001 Journal ofNutrition, 131:1631S_1636S)。這一收集血液的新應用引發了新生兒的群體篩查以檢測可治療的遺傳代謝疾病。現在DBS用於篩查大量的新生兒代謝疾病已經40多年了。
[0004]DBS樣本通過將來自靜脈血或直接來自指尖或足跟針刺的全血點在固體支持物例如膜、玻璃纖維或紙上進行收集，使得這種方法特別適合樣本從周邊診所運輸到中心實驗室。此外，包裝在帶有乾燥劑的拉鎖(zip-lock)塑膠袋中的DBS能夠在室溫下儲存和運輸，因此避免需要i)冷鏈儲存和ii)快速專用運輸。通過將血滴塗到吸收材料例如Whatman903新生兒STD紙上收集的DBS不受IATA危險物品規定(IATA Dangerous Goods Regulations)(附錄II，2005年3月)的管制。
[0005]其他用於收集、運輸和儲存用於嬰兒和新生兒篩查目的的DBS和其他體液的固體紙質支持物包括:
[0006]1.Ahlstrom226
[0007]2.Munktell TFN (CE 標記)
[0008]3.Toyo Roshigrade545Advantec Toyo, Tokyo (參見Elvers L等 2007 ;J.1nheritMedtab Dis30,4,609)。
[0009]所有這些紙,例如Whatman903新生兒STD紙，由棉毛纖維構成。Whatman903新生兒STD紙和Ahlstr0m226紙被劃分為II類醫療衛生器材。有潛力發展為用於嬰兒和新生兒篩查目的的器材的固體紙質支持物包括由Macherey Nagel (例如MN818)、Reeve Angel (例如Double ring)和Hahnemuhle Grade2292生產的那些固體紙質支持物。
[0010]DBS的消耗費用小於I美元/測試，而且與需要液體形態和專用運輸條件的血漿相比，運輸費用顯著下降(Johannessen, A.等,2009 ；J Antimicrobial Chemotherapy,64,1126-1129)。儘管實際測試費用保持未變，並且在中心實驗室從DBS提取分析物包含一些額外的操作時間，但DBS和特別的固體紙質支持物的使用正越來越多地用於儲存和/或分析生物材料例如核酸、蛋白質等。此外，DBS還被用於藥物發現過程中，其中將候選的低分子量藥物化合物注入測試動物，並監測血液中的濃度水平。
[0011]近年來，生物技術來源的重組蛋白、肽和基於抗體的藥物以及用於基因治療的反義寡核苷酸和DNA已發展成為主流的治療藥劑，並且現在構成臨床開發下的化合物的主要部分。這些藥劑通常被稱為「生物技術藥物」或「生物製藥藥物」，以將其與低分子量藥物化合物區分。
[0012]生物技術藥物和低分子量藥物化合物的藥物代謝和藥代動力學(DMPK)分析很重要，因為DMPK分析對藥物發現至關重要，其對候選藥物可能如何被機體吸收、代謝和排出提供深入的了解。分析通常在藥物發現階段進行，並包括將目的化合物給予動物和測定生物液體中藥物(或代謝物)濃度作為時間函數。這產生了有價值的信息，例如藥物清除、生物利用度等，但是需要大量時間和資源(Beaudette, P.等，2004 ;J.0fChromatographyB809,153-158)。
[0013]與通常在藥物篩選程序中進行的DMPK分析有關的主要問題是明顯缺乏合適的用於在分析前保持血液樣本穩定性和完整性的儲存介質。目前的方法使用在指定時間從給藥的動物收集的血漿或全血。然而，這種方法有許多缺陷，包括涉及耗時步驟，其造成分析過程中的瓶頸。此外，對於時程實驗，單只動物多次抽血是有限制的。這給高通量帶來了限制並增加了動物的使用，其結果是較少的先導化合物能夠得以開發。
[0014]DBS需要少的血液體積，使得能夠從一隻動物連續取血,而不是從數隻動物混合取血，這顯著改善了 DMPK和毒理動力學數據和評估的質量。對於「3R」 (減少、優化和代替)，DBS所需要的減少的血液體積(通常15-20 μ I/斑點)的倫理學益處在臨床前藥物研發中是顯而易見的。測試動物的數量能夠顯著降低。此外，在幼年毒理學研究中非末端取血是可能的，當局正逐漸要求幼年毒理學研究作為兒科用藥的安全性評估的一部分。調整的動物毒理學研究的另一優點是數據質量的提高。
[0015]因此，由於在藥代動力學研究中迅速分析大量血液樣本的需要的增長，DBS已經成為一個有吸引力的選擇。對於作為DBS固體支持物的紙，以下的紙是合乎需要的:所述紙結合了令人滿意的力學性能和在穩定狀態下保存目的生物材料的能力，以這樣一種方法致使其可在儲存後經受進一步處理和/或分析。用於DMPK分析的這類紙的實例為被稱為903新生兒樣本收集紙的那些紙， 以及例如在US專利號5，75，126和5，939，259中描述的稱為FTA和FTA Elute的那些紙。
[0016]其他用於DMPK分析的固體支持物包括如下:
[0017]1.Ahlstrom grade226 紙:
[0018]臨床研究藥代動力學測定中的乾血漿斑的使用:定量生物分析方法的有效性(Useof Dried Plasma Spots in the Determination of Pharmacokinetics in ClinicalStudies:Validation of a Quantitative Bioanalytical Method)。
[0019]Barfield, M.等，(2011)，Anal.，Chem.,83,118-124.[0020]2.標準化濾紙:
[0021]妊娠期間拉莫三嗪和奧卡西平組合的藥物監測(Drug monitoring oflamotrigine and oxcarbazepine combination during pregnancy)。
[0022]Wegner, 1.等，(2010)，Epil印sia，51，2500-2502.[0023]3.Whatman903、FTA (DMPK-A)和 FTA Elute (DMPK-B)基質:
[0024]儲存條件對各種基於纖維素的基質上的幹血斑樣品的重量和外觀的影響(Effectof storage conditions on the weight and appearance of dried blood spot sampleson various cellulose-based substrates)。
[0025]Denniff, P.等，(2010), Bioanalysis,2,11,1817-22.[0026]4.Whatman DMPK-A、_B、_C:
[0027]DBS在定量評估Exendin-4肽上的應用；通過UHPLC-MS/MS比較血漿和DBS方法(Application of DBS for quantitative assessment ofthe peptide Exendin-4 ；comparison of plasma and DBS method by UHPLC-MS/MS)。
[0028]Kehler, R.等，(2010)，Bioanalysis，2，8，1461-1468.[0029]5.Ahlstrom grade237 紙:
[0030]基於液體提取的密封表面釆樣探針在小鼠全身薄組織切片和DBS的質譜分析中的應用(Application of a Liquid Extraction Based Sealing Surface Sampling Probefor Mass Spectrometric Analysis of DB S&Mouse Whole-Body Thin Tissue Sections)。
[0031]Van Berkel, G.等，(2009)，Anal.，Chem.，2009，81，21，9146-9152.[0032]6.Whatman FTA 血斑卡:
[0033]在臨床研究中用於藥代動力學測定的作為樣品收集技術的幹血斑:對定量生物分析方法的有效性的考慮(Dried blood spots as a sample collection technique for thedetermination of pharmacokinetics in clinical studies:considerations for thevalidation of a qua ntitative bioanalytical method)。
[0034]Spooner, N.等，(2009)，Ahal Chem.81，1557-63.[0035]7.Whatman FTA Elute Micro 卡:
[0036]幹血斑在通過LC-MS/MS測定人類全血中右美沙芬及其代謝物右啡烷中的研究(Study of dried blood spots technique for the determination of dextromethorphanand its metabolite dextrorphan in human whole blood by LC-MS/MS)。
[0037]Liang, X.等，(2009)，J.Chrom B, Anal.Tech Biomed&Life Sci，877，799-806.[0038]8.Whatman 濾紙卡:
[0039]用於在幹血斑中測定25-羥基維生素D2和25_羥基維生素D3的液相色譜/串聯質譜法:糖尿病和心臟代謝風險篩查的潛在助手(A liquid chromatography/Tandem mass spectrometry method for determination of25-hydroxy vitaminD2and25-hydroxy vitamin D3in dried blood spots:a potential adjunct to diabetesand cardiometabolic risk screening)。
[0040]Newman, M.等，(2009)，J Diabetes Sci and Tech.3，156-162.[0041]9.Toyo Roshi N0.545 濾紙(Advantec Toyo, Tokyo):
[0042]釆用LC-MS/MS對低出生體重新生兒的DBS中的17α-羥基孕烯醇酮和17α-羥孕酮的同時測定(Simultaneous determination of 17 a -hydroxypregnenoloneandl7a -hydroxyprogesterone in DBS from low birth weight infants using LC-MS/MS) o
[0043]Higashi, T.等，(2008)，J.Pharm and Biomedical Analysis，48，1，177-182.[0044]10.Whatman 樣本收集紙 BFC180:
[0045]使用幹血斑對血液中嗎啡和6-乙醯嗎啡的測定(Determination ofmorphine&6-acetylmorphine in blood with use of dried blood spots)。
[0046]Garcia-Boy, R.等，(2008)，Therapeutic Drug Monitoring，30，6，733-739.[0047]11.Whatman 濾紙(目錄號 10535097):
[0048]使用陽離子交換色譜結合串聯質譜方法對不同的人類生物基質中的陽離子抗症疾劑亞甲基藍的定量測定(Quantification of cationic ant1-malaria agentmethylene blue in different human biological matrices using cation exchangechromatography coupled to tandem mass spectrometry)。
[0049]Burhenne, J.等，(2008), J.Chrom B, Anal.Tech Biomed&LifeSci, 863, 273-282.[0050]12.Whatman3MM:
[0051]濾紙在類固醇藥理學中用於樣品收集和傳輸的應用(Use of filter paper forsample collection and transport in steroid pharmacology)。
[0052]Howe, C.等，(1997)，Clin Chem.43，1408-15.[0053]13ffhatman FTA, FTA Elute, DMPK-A> B、C, Ahlstrom226:
[0054]使用SCAPTM DBS系統和柱交換LC-MS/MS對幹血斑中的Tamiflu?和活性代謝物的測定(Determination of Tamiflu? and active metabolite in dried blood spotsusing the SCAPTM DB S system and column-switching LC-MS/MS)。
[0055]Heinig, K.等，F.Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland.[0056](參見:http://www.presearch, c0.uk/pagges/products/applications/1725/Determination % 20of % 20TamifIu % C2 % AE % 20and % 20active % 20metabolite %20in % 20dried % 20blood % 20spots % 20using % 20the % 20SCAPTM % 20DB S %20system.pdf) [0057]有潛力發展為用於DMPK目的的器材的固體紙質支持物包括Munktell TFN grade、Toyo Roshi grade545、Macherey Nagel (例如 MN818)、Reeve Angel (例如 Double ring)和 Hahnemuhle Grade2292。
[0058]為了有效地下遊處理和分析，目的分析物(例如內源蛋白質或生物技術藥物)必須易於使用符合高通量處理的相對簡單的技術從固體紙質支持物提取。
[0059]DBS和內源蛋白質檢測的組合在科學文獻中已有所描述。例如，囊性纖維化病(CF)的生物標誌物免疫反應性胰蛋白酶(IT)，Ryley等人在1981發表了來自DBS的內源性IT首次報導用於CF篩查(J.Clin,Pathol.34，906-910)。從那以後，使用來自新生兒的DBS, IT已經被常規用作CF指示物。許多商業化機構提供FDA批准的免疫測定試劑盒用於該應用。許多人簡單地使用「紙內(paper-1n)」的方法，其中含有DBS的紙孔片(punch)直接應用於免疫測定並在原位提取目的分析物。最近(Lindau-Shepard&Pass, 2010, ClinicalChe m.56,445-450)證實IT以兩種不同的同工型存在。這些作者報導開發了一種基於混懸液(或紙內)陣列的免疫測定法用於診斷CF，其利用了 IT的兩種不同的同工型。所有這些基於蛋白質的研究在未包被的Guthrie卡(Whatman903紙)上進行。
[0060]自從匿名人類免疫缺陷(HIV)篩查開始，已經進行了超過120萬份的DBS測試，用於在孕婦血液中的內源性抗-HIV抗體的血清學檢測。
[0061]這些研究已經證實:i)證實關於血液和任何相關目的蛋白的長期儲存的擔憂是沒有根據的；和ii)DBS中存在的血紅素不幹擾測定進行。
[0062]因此，生產為生物材料提供簡單、穩定的儲存介質的固體支持物是合乎需要的，所述生物材料包括i)內源性部分和ii)生物製藥或生物技術藥物，所述固體支持物在進一步處理中提供生物材料的高產率或回收率。本發明提出這些需求並提供提高從固體紙質支持物上的以DBS儲存的生物樣本中生物材料例如生物製藥藥物的回收水平的方法。
[0063]定義[0064]本文所用術語「生物材料」意指如下定義的任何「生物分子」、「合成來源的生物分子」、「生物製藥藥物」或「細胞組分」:
[0065]i)生物分子是由生命體產生的任何有機分子，包括大的多聚體分子例如蛋白質、多糖和核酸，以及小的低分子量分子例如初級代謝產物、次級代謝產物和天然產物。
[0066]ii)合成來源的生物分子是採用重組DNA技術產生或通過其他非生命的體外方法化學合成的如上文i)中定義的「生物分子」。
[0067]iii)生物製藥藥物(或「生物技術藥物」)是生物技術來源的重組蛋白質、肽或基於抗體的藥物，或用於基因治療的反義寡核苷酸、蛋白質核酸(PM)或脫氧核糖核酸(DNA)。
[0068]iv)細胞組分是獨特的、高度組織化的構成細胞和有機體的一種或多種物質。實例包括膜、細胞器、蛋白質和核酸。同時，細胞組分的大部分位於細胞本身內部，而一些可能存在於生物體的細胞外區域。
[0069]發明簡述
[0070]根據本發明的第一方面，提供一種固體支持物，其具有至少一個表面，所述表面包被有提高生物材料從所述表面的回收率的化學品，其中所述化學品選自烯類聚合物、非離子合成聚合物和蛋白質。
[0071 ] 一方面,所述固體支持物選自紙、玻璃微纖維和莫。
[0072]另一方面，所述紙是纖維素紙。優選地，所述紙是903新生兒STD或DMPK-C卡。
[0073]又一方面，所述膜選自聚酯、聚醚碸(PES)、聚醯胺(尼龍)、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、硝酸纖維素、乙酸纖維素和氧化鋁。
[0074]另一方面，所述烯類聚合物是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
[0075]又一方面，所述非離子合成聚合物是聚-2-乙基-2-噁唑啉(PEOX)。
[0076]一方面，所述蛋白質選自白蛋白和酪蛋白。
[0077]根據本發明的第二方面，提供一種從固體支持物回收生物材料的方法，包括以下步驟:
[0078]i)將上文所述的固體支持物的表面與包含生物材料的樣本接觸；
[0079]ii)乾燥支持物表面上的樣本；
[0080]iii)儲存支持物；和
[0081]iv)從所述表面提取生物材料。
[0082]一方面，步驟iii)包括在15_40°C的溫度範圍內儲存紙質支持物。優選地，溫度在20-300C的範圍內。另一方面，根據生物材料的熱穩定性，將紙質支持物儲存在較低的溫度。
[0083]樣本的性質取決於生物材料的來源。例如，所述來源可以是來自一定範圍的生物有機體，包括但不限於病毒、細菌、植物和動物。優選地，所述來源是哺乳動物或人類受試者。對於哺乳動物和人類來源，樣本可以選自組織、細胞、血液、血漿、唾液和尿液。
[0084]另一方面，所述生物材料選自生物分子、合成來源的生物分子、細胞組分和生物製藥藥物。
[0085]又一方面，所述生物材料是生物製藥藥物。
[0086]一方面，所述支持物是紙。優選所述紙是纖維素紙。更優選所述紙是903新生兒STD 或 DMPK-C 卡。[0087]根據本發明的第三方面，提供一種製備上文所述的固體支持物的方法，包括將固體支持物的至少一個表面用提高生物材料從所述表面的回收率的化學品的溶液包被，其中所述化學品選自烯類聚合物、非離子合成聚合物和蛋白質。
[0088]一方面，所述化學品選自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚-2-乙基-噁唑啉(PEOX)、白蛋白和酪蛋白。
[0089]另一方面，所述固體支持物是紙。優選所述紙是纖維素紙。更優選所述紙是903新生兒STD或DMPK-C卡。
[0090]根據本發明的第四方面，提供上文所述的固體支持物在提高生物材料從其表面的回收率中的用途。
[0091]一方面，所述生物材料是生物製藥藥物。
[0092]附圖簡述
[0093]圖1表示從施加到各種紙質基質上的幹血斑中外源加入的IL-2的回收率。
[0094]圖2表示從施加到包被有各種化學品的903新生兒STD紙上的幹血斑中外源加入的IL-2的回收率。
[0095]圖3表示從施加到包被有各種化學品的DMPK-C紙上的幹血斑中外源加入的IL_2的回收率。
[0096]發明詳述
[0097]重組IL-2 土 載體(R&D Systems ;分別為目錄號 202-1L-CF-10 μ g ；批次AE4309112 和目錄號 202-1L-10 μ g ;批次 AE4309081)以 50pg 或 IOOpg/μ I 溶解於不含鈣和鎂的Dulbecco』 s PBS (PAA ;目錄號H15-002，批次H00208-0673)，EDTA抗凝的人、兔或馬血(TCS Biosciences)。
[0098]將等份試樣(I μ I包含0、50或100pgIL-2)施加於下列GE Healthcare濾紙:903新生兒STD卡，目錄號10538069，批次6833909W082 ;DMPK_A卡，目錄號WB129241，批次FT6847509 ；DMPK-B 卡，目錄號 WB129242，批次 FE6847609 和 DMPK-C 卡，目錄號 WB129243，批次FE6847009。在室溫和環境溼度下過夜使樣本乾燥。
[0099]用合適大小的Harris Un1-core 打孔器(Sigma,目錄號 Z708860_25ea,批次 3110)從各紙質類型打取孔片(直徑3毫米)。將單個孔片放入源自人IL-2Quantikine ELISA (R&DSystems,目錄號D0250，批次273275)的IL-2微孔板的單獨孔中。這些板由小鼠抗IL-2單克隆抗體包被。使用Quantikine試劑盒提供的測試緩衝液(100 μ I)將IL_2蛋白從紙孔片上洗脫。所有後續步驟都按照Quantikine試劑盒提供的說明書使用「紙內」的方法(直接將紙孔片置入測定緩衝液中並原位直接洗脫分析物)進行。測定完成，使用Thermo ElectronCorporation,Multiskan Ascent在450nm監測微孔板的光密度。通過與已知IL-2濃度的標準曲線比較數值確定IL-2的回收率。對於每一單獨的實驗製作新的IL-2標準曲線。
[0100]另外的實驗包括903新生兒STD和DMPK-C卡在數種化學溶液(如下文所述)中飽和浸泡之後，將加有IL-2的血液施加到所述卡上。
[0101]使用的化學品
[0102]下文給出化學品及其來源的列表。
[0103]聚乙烯亞胺，含50%於水中(Fluka，目錄號P3143，批次29kl492)。
[0104]聚乙烯吡咯烷酮，含1%於水中(Sigma ;目錄號PVP40_100mg，批次llpk0097)。[0105]菊粉，含1%於水中(Sigma，目錄號 12255-lOOg，批次 079F7110)。
[0106]聚-2-乙基-2-噁唑啉，含I %於水中(Aldrich目錄號372846，批次30498PJ)。
[0107]白蛋白，含1%於水中(Sigma，目錄號A2153-10g，批次049kl586)。
[0108]牛奶來源的酪蛋白，含1%於水中(Sigma，目錄號C5890_500g，批次089k0179)。
[0109]聚乙二醇1000，含 1%於水中(Biochemika,目錄號 81189，批次 1198969)。
[0110]聚乙二醇200，含1%於水中(Fluka，目錄號81150，批次1384550)。
[0111]實驗結果
[0112]當IL-2溶解於EDTA抗凝血中時，903和DMPK-C卡促進該細胞因子的回收率為45-55%，而從DMPK-A和B卡只有2-3%被回收(見表I和圖1)。903和DMPK-C卡是基礎紙，沒有被任何化學品浸泡或包被，而DMPK-A和B卡分別被促進蛋白質、微生物和細胞變性和失活的化學品的專有混合物包被。這些卡被設計為利於核酸的運輸和長期儲存。因此，使用DMPK-A和B卡時發現的低IL-2回收水平實際上可能是存在這些變性試劑和所用的基於ELISA的抗體檢測系統的反映。ELISA檢測系統要求洗脫的IL-2顯示完整的天然結構。
[0113]
【權利要求】
1.一種具有至少一個表面的固體支持物，所述表面包被有提高生物材料從所述表面的回收率的化學品，其中所述化學品選自烯類聚合物、非離子合成聚合物和蛋白質。
2.權利要求1的固體支持物，其中所述固體支持物選自紙、玻璃微纖維和膜。
3.權利要求2的固體支持物，其中所述紙是纖維素紙。
4.權利要求2的固體支持物，其中所述膜選自聚酯、聚醚碸(PES)、聚醯胺(尼龍)、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、硝酸纖維素、乙酸纖維素和氧化鋁。
5.權利要求1-4中任一項的固體支持物，其中所述烯類聚合物是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
6.權利要求1-4中任一項的固體支持物，其中所述非離子合成聚合物是聚-2-乙基-2-噁唑啉(PEOX)。
7.權利要求1-4中任一項的固體支持物，其中所述蛋白質選自白蛋白和酪蛋白。
8.一種從固體支持物回收生物材料的方法，包括以下步驟: i)將前述權利要求中任一項的固體支持物的表面與包含生物材料的樣本接觸； ?)乾燥所述支持物的所述表面上的所述樣本； iii)儲存所述固體支 持物；和 iv)從所述表面提取生物材料。
9.權利要求8的方法，其中步驟iii)包括在15-40°C的溫度範圍內儲存所述固體支持物。
10.權利要求8或9的方法，其中所述樣本選自組織、細胞、血液、血漿、唾液和尿液。
11.權利要求8-10中任一項的方法，其中所述生物材料選自生物分子、合成來源的生物分子、細胞組分和生物製藥藥物。
12.權利要求8-11中任一項的方法，其中所述生物材料是生物製藥藥物。
13.權利要求8-12中任一項的方法，其中所述支持物是紙。
14.一種製備權利要求1-7中任一項的固體支持物的方法，包括將固體支持物的至少一個表面用提高生物材料從所述表面的回收率的化學品的溶液包被，其中所述化學品選自烯類聚合物、非離子合成聚合物和蛋白質。
15.權利要求14的方法，其中所述化學品選自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚-2-乙基-噁唑啉(PEOX)、白蛋白和酪蛋白。
16.權利要求14或15的方法，其中所述固體支持物是紙。
17.權利要求1-7中任一項的固體支持物在提高生物材料從其中的回收率中的用途。
18.權利要求1-7中任一項的固體支持物在提高生物製藥藥物從其中的回收率中的用途。
【文檔編號】G01N33/544GK103460051SQ201280010442
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年2月24日 優先權日:2011年2月25日
【發明者】J·K·霍頓, P·J·塔特內爾, S·L·J·斯圖布斯 申請人:通用電氣醫療集團英國有限公司