系統性紅斑狼瘡全血基因組中甲基化標記物il-2rg及其應用的製作方法

2024-04-05 12:39:05

專利名稱：系統性紅斑狼瘡全血基因組中甲基化標記物il-2rg及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於系統性紅斑狼瘡早期診斷的全血基因組甲基化生物標記物 IL-2RG及其應用。
背景技術：
系統性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus，簡稱SLE)是一種多器官、多 系統受累的自身免疫性疾病。作為一種典型的嚴重危害人類健康的自身免疫性疾病，其病 因和發病機制非常複雜，醫學界至今尚不十分清楚。目前，SLE的診斷主要依賴臨床表現和 實驗室檢查，臨床表現包括如面頰部蝶形紅斑等，實驗室檢查主要有狼瘡帶試驗、抗核抗體 譜等。但根據臨床表現及實驗室檢查確診時，患者往往已多器官系統受累。因此，如果能將 SLE的診斷上升到基因水平，找到一種能用於臨床的快速診斷工具，則能對該疾病的早期診 斷和儘早幹預起到重要作用。DNA低甲基化在SLE發病中起重要作用，目前已經研究發現T細胞過度表達的淋巴 細胞功能相關抗原一 1、穿孔素、CD40L及CD70基因低甲基化與系統性紅斑狼瘡的發病機制 密切相關，進而影響到染色質結構的重塑.調節基因的轉錄。然而CD 11a、穿孔素、CD70均 過度表達於SLE患者的⑶4+T細胞，調控序列均存在低甲基化，與經5 —聚胞苷處理的T細 胞基因低甲基化序列相同。它們的這種差異也主要只是存在於CD4+T細胞的基因組中，實 驗需要抽取40到60ml毫升靜脈血液分離提取足夠的CD4+T細胞，然後再提取DNA進行克 隆測序。整個實驗過程耗時廢力，並且要抽取60ml外周靜脈血液，患者的依從性往往較低。 如果能在全血基因組中找到一個甲基化生物標記，將會大大縮短試驗時間，簡化試驗流程， 提高患者的依從性。發明人通過大量閱讀相關文獻，最後篩選出IKBKG，IL2RG，RB1，ZAP70， F0S3，SH2B3C等一系列與免疫有密切關聯的基因。最後得出IL-2RG的平均甲基化水平，在 正常人和狼瘡患者之間表現有明顯的差異，可以作為系統性紅斑狼瘡的早期診斷的甲基化 生物標記。發明人的研究表明全血基因組DNA特定基因高甲基化在SLE的發病機制中起重 要作用。這種高甲基化在IL2-RG中表現明顯。全血基因組中IL2-RG特定CpG位點處於高 甲基化狀態，其甲基化改變及模式有望成為極具前途的SLE早期診斷標誌。

發明內容
本發明的目的在於提供一種用於SLE早期診斷甲基化生物標記物IL-2RG及其擴 增片段。本發明進一步目的在於提供上述用於SLE早期診斷甲基化生物標記物IL-2RG及 其擴增片段的應用方法，尤其指在製備SLE早期診斷試劑上的應用。一種系統性紅斑狼瘡全血基因組中甲基化標記物IL-2RG的序列如SEQ ID NO: 1 (見 Genebank)。
所述的系統性紅斑狼瘡全血基因組中甲基化標記物應用於製備診斷系統性紅斑 狼瘡的試劑。所述的標記物IL-2RG用於製備診斷系統性紅斑狼瘡的試劑盒。一種系統性紅斑狼瘡全血基因組中甲基化標記物IL-2RG擴增片段的序列如SEQ IDNO :2。所述的系統性紅斑狼瘡全血基因組中甲基化標記物IL-2RG擴增片段應用於製備 診斷系統性紅斑狼瘡的試劑。所述的標記物IL-2RG擴增片段用於製備診斷系統性紅斑狼瘡的試劑盒。擴增所述的IL-2RG擴增片段的引物如下，第一輪PCR的引物為SEQ ID NO 3 上遊 5，-TGGTTATTAGGATTTTTAGTTATTTAG-3，；SEQ ID NO 4 下遊 5，-TATTCACAATAACCCCTTAAAAAAA-3，；第二輪PCR引物為SEQ ID NO 5 上遊 5，-TAGATAATTTTTTGAGGTGTGTGTG-3，；SEQ ID NO 6 下遊 5，-CAATCAACCTAACCCTACTAATACC-3，。通過檢測本發明的甲基化生物標記IL-2RG的甲基化水平，統計出有意義，差異較 為明顯的特定甲基化位點，作為SLE早期診斷的依據。本發明檢測待檢樣品中IL2RG甲基化水平的方法包括步驟(1)取待檢樣品血，從 中提取全血基因組DNA，對抽提出的DNA進行亞硫酸氫鈉轉化處理。用甲基化引物分別進行 巢式PCR擴增，將PCR產物純化回收。O)PCR產物回收純化後與p-GEM T載體連接，克隆至 Dffia感受態細胞，對重組陽性克隆進行測序。(3)結果分析，序列上表現為CG的為甲基化 位點，TG的則為非甲基化位點。然後計算得出平均甲基化水平。所述針對IL2-RG進行巢式PCR時，第一輪PCR的引物為上遊，5-TGGTTATTAGGATTTTTAGTTATTTAG-3下遊 5-TATTCACAATAACCCCTTAAAAAAA-3第二輪PCR 引物為上遊 5-TAGATAATTTTTTGAGGTGTGTGTG-3下遊 5-CAATCAACCTAACCCTACTAATACC-3本發明的用於診斷紅斑狼瘡的外周血基因組中的甲基化生物標記IL_2RG能廣 泛用於紅斑狼瘡的早期診斷，以達到提高診斷效率，降低診斷成本，縮短診斷時間的目的。本發明用於定量檢測待檢樣品中紅斑狼瘡相關基因甲基化水平的方法藉助於紅 斑狼瘡相關基因集成的亞硫酸氫鈉處理的克隆測序，為臨床提供一種紅斑狼瘡早期診斷、 疾病活動性以及療效和預後評價的精確、廉價、快速的工具。


圖1為巢式PCR反應後產物的電泳圖；圖2為巢式PCR反應後產物純化回收後產物電泳圖；圖3是最後得出的各個甲基化位點正常人和狼瘡患者平均甲基化水平的比較圖；圖中方形代表病人，圓點代表正常人；50例病人VS 50正常人；圖4為13號位點至20號位點，患者的平均甲基化水平與正常人的平均甲基化水平的比較圖；圖中方形代表病人，圓點代表正常人；圖5為正常人和狼瘡患者之間甲基化水平比較圖。
具體實施例方式1從外周血組織中提取DNA一 .從Iml全血或體液中提取DNA的步驟(1)裂解1 取Iml全血，血槳，血清，淋巴細胞放入到1.5ml的離心管中，加入 400ul裂解液1。上下翻轉，使沉澱物分散，旋轉脈動15秒後放入離心機中離心，離心速率 為SOOOrpm，lmin.。倒掉上層液，可見離心管底部有血色沉澱。重複此裂解步驟一次，這次 是加入Iml裂解液1。最後用移液管吸淨所有上層液棄去，以使離心管底部的血色沉澱不再 殘留有裂解液1。(2)裂解2:在上面離心管中加入Iml裂解液2。上下翻轉，務必使沉澱物分散，旋 轉脈動15秒後放入離心機中離心，SOOOrpm，lmin.。倒掉上清液，可見離心管底部有微量淡 紅色沉澱。重複此裂解步驟一次，這次仍然是加入Iml裂解液2，最後用移液管吸淨所有上 清液棄去，以使離心管底部的灰白色沉澱不再殘留有裂解液2。(3)消化吸取蛋白酶K IOuK = 0. 2mg)加入到上面的離心管中，用移液管尖頭 反覆吹打，使蛋白酶K與沉澱物均勻接觸後，加入320ul消化液，。上下翻轉離心管，務必使 沉澱物分散於消化液中。放入58C水浴中消化15分鐘。最後可見澄明的消化液體。(4)純化在上面的消化液體中加入IlOul純化液，上下翻轉離心管幾下後，離心， 速率為15000rpm，lmin，把上清液吸出放入到裝有IOOOul無水乙醇的1. 5ml離心管中，輕輕 上下翻轉10次，可見絮狀DNA析出。用帶鉤的玻璃棒挑起絮狀DNA放入到IOOul 70%乙醇 中耒回漂洗20次，鉤出DNA，在空氣中涼幹一下後放入到IOOul彌散液中。把DNA^散液保 存於4C，過夜，使之充分彌散後使用。提取完畢。如要立即用此DNA做PCR實驗，把DNA彌散液放在58C水°浴中，保溫30分鐘，用手 指拍打離心管子，使DNA彌散後使用。提取完畢(5)收集(在DNA極少量，不能用帶鉤玻璃棒挑起的情況下)把有絮狀DNA的溶 液倒入微型柱過濾器(包括濾柱和收集管)中，濾器放入離心機內，離心8000rpm，lmin.. DNA便附著在濾漠上，棄去濾液，把濾柱放回收集管上。(6)吸取200ul 70%乙醇於濾柱內，離心8000rpm，lmin，棄去濾液。把濾柱放回收 集管上，再離心15000rpm，lmin..使吸附在濾膜上的DNA不再附有乙醇。(7)回收DNA : 上面附著DNA的濾柱放入一個乾淨的1. 5ml鳥心管中。吸取IOOul 已溫熱到58C的彌散液，輕輕放入濾膜的表面，保溫58C靜置10分鐘。離心8000rpm，lmin.， DNA彌散液便濾入到乾淨的1.5ml離心管內。保存於_20攝氏度，用於PCR實驗。2亞硫酸氫鈉測序2. IDNA的亞硫酸氫鈉處理採用Qiagen公司的EpiTect Bisulfite試劑盒處理全血基因組，DNA標本來自第 一部分實驗提取所得，操作步驟按試劑盒說明書進行
1)往緩衝液BW中加入30ml無水乙醇；2)往緩衝液BD中加入30ml無水乙醇；3)將 310ul 無酶水加入 310ug carrier RNA 中，得至Ij lug/ul 的 carrier RNA 溶 液；4)按1 100體積往緩衝液BL中加入lug/ul的carrier RNA溶液，使緩衝液BL 中 carrierRNA 的濃度為 10ug/ml ；5)根據需要處理的樣本多少溶解Bisulfite Mix，每管Bisulfite Mix中加入 SOOul的無酶水，劇烈震蕩5分鐘至完全溶解；6)在200ul的PCR管中依次加入以下各成分，充分震蕩混勻，表2-1反應體系
成分體積DNA溶液35μ1 (約 1昭)無酶水5μ1Bisulfite Mix 溶液85μ1DNA保護緩衝液35μ1
總體積
140μ1
7)在PCR儀中按下表條件進行亞硫酸氫鈉轉換 表2-2亞硫酸氫鈉處理反應條件
變性99°C5分鐘孵育60°C25分鐘變性99°C5分鐘孵育60°C85分鐘變性99°C5分鐘孵育60°C175分鐘保存20°C8)反應結束後將PCR管簡短離心，將所有的反應液體轉至乾淨的1.5ml EP管中；9)加入560ul緩衝液BL (含10ug/mlcarrier RNA,見第4步)，震蕩混勻，簡短離 心；10)將上一步所得的所有液體全部轉入帶有收集管的EpiTect spin離心柱中， 13000rpm離心1分鐘，倒掉廢液，將離心柱放回收集管中；11)往離心柱中加入500ul洗脫緩衝液BW，13000rpm離心1分鐘，倒掉廢液，將離
心柱放回收集管中；12)往離心柱中加入500ul緩衝液BD,室溫孵育15分鐘；13000rpm離心1分鐘，倒掉廢液，將離心柱放回收集管中；13) 13000rpm離心1分鐘，倒掉廢液，將離心柱放回收集管中14)往離心柱中加入500ul洗脫緩衝液BW，13000rpm離心1分鐘，倒掉廢液，將離 心柱放回收集管中；15)重複步驟14 一次；16)將離心管放入一個新的2ml的收集管中，13000rpm離心1分鐘；17)將離心管放入一個新的1. 5ml的EP管中，加20ul緩衝液EB，12000rpm離心1 分鐘洗脫DNA，所得的液體即為純化了的亞硫酸氫鈉處理後的DNA。2. 2 巢式 PCR巢式PCR的引物為上文提到的槽式引物序列，引物由上海博尚生物有限公司合 成。第一輪PCR的引物為上遊，5-TGGTTATTAGGATTTTTAGTTATTTAG-3下遊5-TATTCACAATAACCCCTTAAAAAAA-3表2-3巢式PCR第一輪反應體系
成分
體積
5 X緩衝液4ul
上遊引物(lOng/μΙ)0.8ul
下遊引物(lOng/μΙ)0.8ul
dNTPl.Oul
Taq 酶0.5ul
無酶水10.9ul
DNA2ul
總體積20ul 表2-4巢式PCR第一輪反應條件
步驟溫度時間循環數起始激活95°C3分鐘1變性95°C48秒退火55°C40秒30延伸72°C48秒最終延伸72°C5分鐘1
第二輪 PCR 引物為上遊 5-TAGATAATTTTTTGAGGTGTGTGTG-3 下遊 5-CAATCAACCTAACCCTACTAATACC-權利要求
1.一種系統性紅斑狼瘡全血基因組中甲基化標記物IL-2RG，其特徵在於，所述的 IL-2RG 的序列如 SEQ ID NO :1。
2.權利要求1所述的系統性紅斑狼瘡全血基因組中甲基化標記物應用於製備診斷系 統性紅斑狼瘡的試劑。
3.根據權利要求2所述的系統性紅斑狼瘡全血基因組中甲基化標記物IL-2RG的應用 方法，其特徵在於，所述的標記物IL-2RG用於製備診斷系統性紅斑狼瘡的試劑盒。
4.一種系統性紅斑狼瘡全血基因組中甲基化標記物IL-2RG擴增片段，其特徵在於，所 述的IL-2RG擴增片段的序列如SEQ ID NO :2。
5.權利要求4所述的系統性紅斑狼瘡全血基因組中甲基化標記物IL-2RG擴增片段應 用於製備診斷系統性紅斑狼瘡的試劑。
6.根據權利要求5所述的系統性紅斑狼瘡全血基因組中甲基化標記物IL-2RG擴增片 段的應用方法，其特徵在於，所述的標記物IL-2RG擴增片段用於製備診斷系統性紅斑狼瘡 的試劑盒。
7.擴增權利要求4所述的IL-2RG擴增片段的引物，其特徵在於，第一輪PCR的引物為SEQ ID NO 3 上遊 5，-TGGTTATTAGGATTTTTAGTTATTTAG-3，；SEQ ID NO 4 下遊 5，-TATTCACAATAACCCCTTAAAAAAA-3』 ；第二輪PCR引物為SEQ ID NO 5 上遊 5，-TAGATAATTTTTTGAGGTGTGTGTG-3』 ；SEQ ID NO 6 下遊 5，-CAATCAACCTAACCCTACTAATACC-3，。
全文摘要
本發明公開了一種系統性紅斑狼瘡全血基因組中甲基化標記物IL-2RG及其應用。其序列如SEQ ID NO1。所述的系統性紅斑狼瘡全血基因組中甲基化標記物IL-2RG應用於製備診斷系統性紅斑狼瘡的試劑；特別是用於製備診斷系統性紅斑狼瘡的試劑盒。通過檢測本發明的甲基化生物標記IL-2RG的甲基化水平，統計出有意義，差異較為明顯的特定甲基化位點，作為SLE早期診斷的依據。為臨床提供一種紅斑狼瘡早期診斷、疾病活動性以及療效和預後評價的精確、廉價、快速的工具。
文檔編號C12Q1/68GK102140511SQ20101060993
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月28日 優先權日2010年12月28日
發明者尹恆, 廖潔月, 譚怡忻, 趙明, 陸前進, 馬樂 申請人:中南大學