用於檢測番茄晚疫病菌的LAMP引物組合物和應用的製作方法

2024-04-05 07:07:05 1

本發明屬於農作物病害檢測、鑑定及防治技術領域，具體涉及番茄晚疫病菌的環介導等溫擴增（LAMP）檢測引物組合物及其應用，可用於番茄晚疫病菌快速、靈敏和特異的分子檢測，同時可用於番茄晚疫病的早期診斷和病菌的監測和鑑定。

背景技術：

番茄 (Lycopersicon esculentum Miller) 別名西紅柿、洋柿子，在植物分類上屬於茄科 (Solanaceae) 番茄屬 (Lycopersicon)。番茄含有豐富的營養成分，既是蔬菜熟食和生食，又是水果，倍受廣大群眾的喜愛。據研究測定，每人每天食用 50～100 g鮮番茄，即可滿足人體對幾種維生素和礦物質的需要。番茄中還含有豐富的抗氧化劑，可以防止自由基對皮膚的破壞，具有明顯的美容抗皺效果。隨著番茄在我國種植面積的不斷擴大和種植指數的不斷指高，番茄病蟲害種類和危害程度也呈現逐年增加和加重的趨勢，其中，由晚疫病菌(Phytophthora infestans)侵染引起的番茄晚疫病是番茄生產上發生最普遍、危害最嚴重的病害之一，無論在露地還是保護地都造成重大損失，是一種流行性很強的毀滅性病害，一般年份減產20%-30%，嚴重時可達40%-60%，甚至絕收。番茄晚疫病常與番茄其它病害（如灰黴病、早疫病）混合發生，而且發病初期症狀具一定的相似性，常給病害的正確診斷造成極大的困難，在生產中常因病害診斷不準確，未能達到實施「對症下藥」的正確防治措施而致使病害造成慘重損失的現象時有發生。因此建立番茄晚疫病菌快速檢測體系，在發病初期或症狀顯現之前對植株是否攜帶晚疫病菌進行快速準確的檢測，這對於病害的準確預測預報、制定適時有效的防治措施、控制病害的傳播和流行（蔓延）以及減少病害造成的經濟損失都具有重要的理論和實際意義。

植物病原菌傳統的檢測方法是採用選擇性培養基從土壤、植物組織或水體中分離菌株，再對這些菌株的形態等進行鑑定，來確定是否存在病原菌，或者用肉眼和藉助顯微鏡技術對發病症狀進行判定。傳統的檢測方法不僅費時、準確度低，而且要求檢測人員要有豐富的經驗，最重要一點是易遺漏潛育期或隱症的病害，以致延誤病害的防治，導致病害的暴發，因此傳統病原學檢測方法已不能滿足現代植物病理學研究的需要。

隨著分子生物學技術的不斷發展，應用PCR、血清免疫學等技術對病原菌進行特異和快速分子檢測的成功例子已越來越多，但這些分子生物學技術在一定程度上也存在了一些不足之處，如血清免疫學檢測技術在血清的製備過程耗時耗力，常常受到抗血清質量的影響，且可能存在交叉反應，特異性較差，容易造成假陽性，PCR快速檢測技術主要包括常規PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和實時螢光定量PCR等，PCR技術檢測時間較長，需要依靠PCR儀、凝膠成像系統等貴重儀器設備，不利於基層生產上推廣應用，上述缺欠限制了這些先進方法的推廣應用。

環介導等溫擴增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術是由日本榮研公司開發的一種簡便、快速、準確及廉價的核酸高效擴增技術，該技術可在60℃~65℃恆溫條件下，利用高活性的鏈置換DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 對目的DNA片段進行特異性擴增。在1小時內，能夠將少量拷貝數的目的基因擴增至109~1010個拷貝數。LAMP反應產物不僅可以通過濁度儀、real-time PCR儀及凝膠電泳儀進行檢測，而且還可以通過SYBR GreenⅠ、鈣黃綠素、羥基萘酚藍染色後，肉眼識別。由於LAMP反應簡單、快速、高效、經濟，且無需特殊設備，檢測結果可由肉眼判斷，極適合於在基層生產部門推廣應用，因而具有極為廣泛的應用前景。目前LAMP檢測主要應用於人畜病原物、食品安全和環境衛生的檢測，在植物病原菌檢測中報導較少，關於番茄晚疫病菌的LAMP檢測尚未見報導。在LAMP檢測中，國內外多數研究人員主要利用rDNA/ITS序列為靶標基因設計特異引物來對植物病原菌進行快速檢測、鑑定。然而疫黴屬卵菌的PCR分子檢測技術研究結果表明，rDNA/ITS在疫黴屬的近緣種之間變化很小，從ITS序列上設計引物很難將兩個相似高的種區分開。因此要對疫黴屬病原菌進行高靈敏性和特異性檢測，應從疫黴菌其它基因上設計引物進行檢測。目前用於疫黴菌PCR分子檢測的靶標基因主要有elicitin 基因、Ras家族相關的Ypt1編碼基因、線粒體Cox1和Cox2編碼基因以及可能編碼儲存蛋白的Lpv基因等。

本發明旨在尋找番茄晚疫病菌中新的分子檢測靶標基因。β-tubulin是真核生物看家（管家）基因之一，廣泛存在於真核生物中，在真核生物進化上非常保守，目前尚無針對該靶標基因進行晚疫病菌分子檢測的報導。

本發明基於環介導等溫擴增（LAMP）技術原理，選取疫黴菌β-tubulin基因為檢測靶標，在β-tubulin基因序列的6個區域設計了4條番茄晚疫病菌特異性引物，通過對反應體系和反應條件的優化，建立以SYBR Green Ⅰ為螢光顯色指示劑的番茄晚疫病菌可視化LAMP 檢測技術。該技術操作簡單、靈敏度和特異高，且無需貴重儀器設備，適宜于田間番茄晚疫病的早期診斷和病原菌的檢測和鑑定，對番茄晚疫病及時、有效的防治具有重要意義。

技術實現要素：

本發明的目的是提供用於檢測番茄晚疫病菌的LAMP引物組合物和應用，針對現有技術中對番茄晚疫病菌檢測和鑑定主要基於形態學特徵，方法耗時長、程序繁瑣、經驗性強、準確度低，難以做到對病害發生的及時監測和控制病原菌的傳播、流行的問題，以及現有PCR分子檢測需要依靠擴增儀等貴重儀器，且檢測時間較長等問題，提供了番茄晚疫病菌新的分子檢測方法，對番茄晚疫病菌進行LAMP檢測，檢測周期短、準確性高、靈敏性高、肉眼觀察檢測結果。

實現本發明的目的包括下列步驟（技術方案）：

1. 番茄晚疫病菌LAMP檢測特異性引物組合物的設計：通過測定番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）和其它鐮孢菌（Phytophthora spp）的β-tubulin基因序列，對疫黴屬及其它病原菌不同種間β-tubulin基因序列進行比對分析，利用在線LAMP引物設計軟體Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)設計一套番茄晚疫病菌特異性LAMP引物組，由1對外側引物F3/B3和1對內側引物FIP/BIP組成，F3/B3和FIP/BIP引物序列如下：F3: 5』-GCCGATGAGGTCATGTGC-3』，B3: 5』-GTTCACGGCCAGCTTACG-3』，FIP: 5』-AGTGGGGGTGGTGAGCTTCACTG-GACAATGAGGCCCTGTA-3』，BIP: 5』-GGTGACCTGAACCACTTGGTGTGTTC- AGCTGACCGGGGAA-3』。

2. 番茄晚疫病菌LAMP檢測方法的建立，包括以下步驟：

（1）提取待測樣品基因組DNA。

用於檢測病原菌純培養物時，採用CTAB法進行提取基因組DNA，具體方法如下：取少量菌絲粉於1.5 mL離心管中（菌絲粉剛蓋過半圓形底部為宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸鈉）【註：CTAB，SDS需60℃預熱】，使用振蕩器振蕩混勻，60℃水浴1h（DNA釋放至緩衝液中），12000 r·min-1離心15 min；取上清液700 µL，加等體積酚、氯仿、異戊醇混合液（體積比25:24:1），輕輕振蕩混勻，12000 r·min-1離心9 min；取上清液500 µL，加入等體積氯仿再抽提一次，12000 r·min-1離心5 min；取上清液350 µL，加入1/10體積3 mol·L-1 NaAc和2倍體積無水乙醇，-20℃沉澱30 min，12000 r·min-1離心5 min；棄去上清液，加入700µL 冰70%乙醇進行洗滌（稍離心；傾掉上清液），在超淨工作檯上晾乾無酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液進行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度計檢測 DNA 濃度並稀釋至100 ng/µL待用。

用於檢測植物組織中存在番茄晚疫病菌時，採用NaOH快速裂解法提取DNA，具體過程如下：向每毫克植物組織中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研缽中將組織充分磨碎成糊後轉入1.5mL離心管中，12,000 rpm離心6 min，取上清液5 µL加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均勻，取1.0 µL作為PCR模板進行擴增；

用於檢測土壤樣品中存在番茄晚疫病菌時，採用土壤DNA提取試劑盒，提取DNA。

（2）LAMP反應體系的建立：以步驟（1）提取的DNA為模板，利用外側引物F3/B3和內側引物FIP/BIP進行LAMP擴增，LAMP檢測反應體系為25 μL，包括5 μM外側引物F3和B3各1.0 μL，40 μM內側引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反應混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4，1.6 mol/L甜菜鹼(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補足至25μL；

（3）LAMP反應條件：64 ℃溫育60 min；

（4）反應結果的測定：採用螢光染料目測觀察法，待LAMP反應結束後，在LAMP反應的擴增產物中加入顯色劑SYBR greenⅠ1.0 μL，顯色結果觀察到綠色螢光的判斷為陽性，存在番茄晚疫病菌，橙色（橘黃色）判斷為陰性，不存在番茄晚疫病菌。

本發明的有益效果：本發明建立了番茄晚疫病菌的快速、簡便、特異性強、靈敏度高的LAMP檢測技術體系，可用於帶菌植株組織和土壤中番茄晚疫病菌的檢測，或用於番茄晚疫病的發病前期、初期檢測，對於確定病害防治的最佳時期具有十分重要的意義。

本發明與現有技術相比，具有以下的技術優勢和積極效果：

1、特異性強、結果可靠：靶標基因的選擇是LAMP檢測的重要因素之一。普通PCR常用的靶標基因有核糖體基因轉錄間隔區( Internal transcribed space ,ITS )，然而疫黴屬卵菌的分子檢測技術研究結果表明，rDNA-ITS在疫黴屬的近緣種之間變化很小，從ITS序列上設計引物很難將兩個相似高的種區分開。因此要對疫黴屬病原菌進行高靈敏性和特異性檢測，應從疫黴菌其它基因上設計引物進行檢測。β-tubulin是真核生物看家（管家）基因之一，廣泛存在於真核生物中，在真核生物進化上非常保守，種間存在豐富的變化，是相比rDNA‐ITS更好的分子檢測靶標。本發明分析了番茄晚疫病菌β-tubulin基因和其他病原菌在序列上的差異，選取6個特定區域，設計了4條特異性的LAMP引物，6個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，具有很強的特異性。本發明利用所設計出的LAMP引物基礎上建立了番茄晚疫病菌LAMP檢測方法，只有番茄晚疫病菌能檢測出來，其它病原菌均未檢測出，多次試驗結果均一致，說明本發明LAMP檢測方法特異性強，結果可靠。

2、靈敏度高： 本發明對番茄晚疫病菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達到10fg/ μL，具有很高的靈敏性。

3、實用性好：本發明的LAMP檢測方法不像PCR檢測法需要要熱循環儀（PCR儀）等貴重儀器設備，這樣就擺脫了對熱循環儀等貴重設備的依賴，只要有穩定的熱源，LAMP 反應就可以發生，極大擴展了LAMP使用的範圍。同時本發明的LAMP反應只需在恆溫水浴鍋中進行，反應結束之後通過的顏色變化便可直接判斷結果，從而增加了其在帶菌的植株和土壤中檢測的應用價值。

4、操作簡便快速：本發明提供的檢測番茄晚疫病菌的LAMP方法克服了現有技術中番茄晚疫病菌的生物學檢測方法所需周期長、費時費力、繁瑣、特異性差及PCR檢測技術需要熱循環儀等貴重設備，無法快速檢測番茄晚疫病菌的問題。本發明檢測方法在64℃等溫條件下，能快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到番茄晚疫病菌，不需要複雜儀器，只需一個恆溫設備即可，能較好滿足對番茄晚疫病菌的現場檢測。

附圖說明

圖1 為本發明番茄晚疫病菌的LAMP特異性檢測。圖中1、2為番茄晚疫病菌，3-7分別為辣椒疫黴菌、大豆疫黴菌、菸草疫黴菌、惡疫黴菌、棕櫚疫黴菌，8為陰性對照，1-2顯示綠色螢光。

圖2 為本發明番茄晚疫病菌LAMP檢測靈敏性。圖中1-9模板DNA濃度分別為1ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、100ag、10 ag，10為陰性對照，1-6顯示綠色螢光。

圖3 為本發明檢測方法對發病植株和帶菌土壤中番茄晚疫病菌的檢測。圖中1為陽性對照，2-3為番茄晚疫病發病葉片，4為番茄晚疫病發病田塊土壤，5-6為健康番茄葉片，7為高壓滅菌土壤，8為陰性對照， 1-4顯示綠色螢光。

具體實施方式

以下結合具體實施例對本發明作進一步闡述， 但不用來限制本發明的範圍。以下實施例均按照常規實驗條件，或已發表相關文獻中所述的操作技術規程，或按照廠商所建議的實驗條件。

實施例 1：番茄晚疫病菌環介導等溫擴增（LAMP）檢測特異性引物組合物的設計及引物特異性驗證

1.供試菌株基因組DNA的提取

採用CTAB 法提取供試菌株（表1）基因組 DNA，具體方法如下：取少量菌絲粉於1.5 mL離心管中（菌絲粉剛蓋過半圓形底部為宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸鈉）【註：CTAB，SDS需60℃預熱】，使用振蕩器振蕩混勻，60℃水浴1h（DNA釋放至緩衝液中），12000 r·min-1離心15 min；取上清液700 µL，加等體積酚、氯仿、異戊醇混合液（體積比25:24:1），輕輕振蕩混勻，12000 r·min-1離心9 min；取上清液500 µL，加入等體積氯仿再抽提一次，12000 r·min-1離心5 min；取上清液350 µL，加入1/10體積3 mol·L-1 NaAc和2倍體積無水乙醇，-20℃沉澱30 min，12000 r·min-1離心5 min；棄去上清液，加入700µL 冰70%乙醇進行洗滌（稍離心；傾掉上清液），在超淨工作檯上晾乾無酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液進行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度計檢測 DNA 濃度並稀釋至100 ng/µL待用。

表1 供試菌株

2. 番茄晚疫病菌環介導等溫擴增（LAMP）特異引物組合物的設計

通過測定番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）和其它鐮孢菌（Phytophthora spp）的β-tubulin基因序列，對疫黴屬及其它病原菌不同種間β-tubulin基因序列進行比對分析，利用在線LAMP引物設計軟體Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)設計一套黃瓜枯萎病菌特異性LAMP引物組，由1對外側引物F3/B3和1對內側引物FIP/BIP組成，F3/B3和FIP/BIP引物序列發下：F3: 5』-GCCGATGAGGTCATGTGC-3』，B3: 5』-GTTCACGGCCAGCTTACG-3』，FIP:5』-AGTGGGGGTGGTGAGCTTCACTG-GACAATGAGGCCCTGTA-3』，BIP:5』-GGTGACCTGAACCACTTGGTGTGTTC- AGCTGACCGGGGAA- 3』。

3.番茄晚疫病菌LAMP檢測方法的建立及引物特異性驗證

以表1供試菌株的DNA為模板，利用外側引物F3/B3和內側引物FIP/BIP進行LAMP擴增，LAMP檢測反應體系為25 μL，包括5 μM外側引物F3和B3各1.0 μL，40 μM內側引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反應混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4，1.6 mol/L甜菜鹼(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補足至25μL；LAMP反應條件：64 ℃溫育60 min；反應結果的測定：採用螢光染料目測觀察法進行測定。待LAMP反應結束後，在LAMP反應的擴增產物中加入顯色劑SYBR greenⅠ1.0 μL，顯色結果觀察到綠色螢光的判斷為陽性，存在番茄晚疫病菌，橙色（橘黃色）判斷為陰性，不存在番茄晚疫病菌。

4.引物特異性驗證結果

LAMP擴增結果表明，供試的菌株中只有番茄晚疫病菌顯色結果可觀察到綠色螢光，其餘疫黴菌和真菌顯色結果為橙色（附圖1），說明所設計的番茄晚疫病菌外側引物F3/B3和內側引物FIP/BIP可以將番茄晚疫病菌與其它病原菌區分開來，具有種的特異性，可用於番茄晚疫病菌快速可靠的檢測和鑑定。

實施例2：番茄晚疫病菌環介導等溫擴增（LAMP）檢測靈敏度測定

1.不同濃度基因組DNA的製備

用無菌超純水對番茄晚疫病菌基因組DNA進行稀釋，配製成10倍數量級的系列濃度備用；

2. LAMP檢測方法靈敏度測定及結果觀察

以不同濃度的番茄晚疫病菌基因組DNA為模板，利用外側引物F3/B3和內側引物FIP/BIP進行LAMP擴增，LAMP檢測反應體系為25 μL，包括5 μM外側引物F3和B3各1.0 μL，40 μM內側引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反應混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4，1.6 mol/L甜菜鹼(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，不同濃度DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補足至25μL；LAMP反應條件：64 ℃溫育60 min；反應結果的測定：採用螢光染料目測觀察法進行測定，待LAMP反應結束後，在LAMP反應的擴增產物中加入顯色劑SYBR greenⅠ1.0 μL，顯色結果觀察到綠色螢光的判斷為陽性，橙色（橘黃色）判斷為陰性。

3. LAMP擴增靈敏度檢測結果

LAMP擴增靈敏度檢測結果表明，1ng、100pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg/μL濃度的番茄晚疫病菌基因組DNA顯色結果可觀察到綠色螢光，其餘濃度及陰性對照顯色結果為橙色，說明所設計的番茄晚疫病菌外側引物F3/B3和內側引物FIP/BIP通過LAMP擴增，對番茄晚疫病菌的檢測靈敏度可達10 fg/μL（附圖2）。

實施例3：發病組織中番茄晚疫病菌的LAMP檢測

樣品採集：從福建周寧、三明、連城採集番茄晚疫病發病症狀典型的葉片及健康葉片帶回實驗室備用；

植物組織DNA的提取：採用NaOH快速裂解法提取DNA，具體過程如下：向每毫克植物組織中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研缽中將組織充分磨碎成糊後轉入1.5mL離心管中，12,000 rpm離心6 min，取上清液5 µL加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均勻，取1.0 µL作為PCR模板進行擴增。

LAMP擴增檢測及觀察：以上述提取的DNA為模板，利用外側引物F3/B3和內側引物FIP/BIP進行LAMP擴增，LAMP檢測反應體系為25 μL，包括5 μM外側引物F3和B3各1.0 μL，40 μM內側引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反應混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4， 1.6 mol/L甜菜鹼(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100】 12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補足至25μL；LAMP反應條件：64 ℃溫育60 min；反應結果的測定：採用螢光染料目測觀察法進行測定，待LAMP反應結束後，在LAMP反應的擴增產物中加入顯色劑SYBR greenⅠ1.0 μL，顯色結果觀察到綠色螢光的判斷為陽性，橙色（橘黃色）判斷為陰性。

檢測結果：檢測結果（附圖3）表明，番茄晚疫病發病的葉片通過LAMP擴增，顯色結果可觀察到綠色螢光，說明存在番茄晚疫病菌，而健康葉片及陰性對照顯色結果為橙色，說明不存在番茄晚疫病菌，該套技術能用於植物組織中番茄晚疫病菌的快速分子檢測。

實施例4：帶菌土壤中番茄晚疫病菌的LAMP檢測

樣品採集：從福建周寧、三明和連城番茄晚疫病發病嚴重的田塊採集植株根部土壤帶回實驗室備用，以高壓滅菌的土壤為對照；

土壤DNA提取：採用Sigma公司的土壤DNA提取試劑盒（Sigma,DNB100,Soil DNA Isolation Kit）提取土壤中的總DNA，取1.0 µL作為PCR模板進行擴增。

LAMP擴增檢測及觀察：以上述提取的DNA為模板，利用外側引物F3/B3和內側引物FIP/BIP進行LAMP擴增，LAMP檢測反應體系為25 μL，包括5 μM外側引物F3和B3各1.0 μL，40 μM內側引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反應混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4， 1.6 mol/L甜菜鹼(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】 12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補足至25μL；LAMP反應條件：64 ℃溫育60 min；反應結果的測定：採用螢光染料目測觀察法進行測定，待LAMP反應結束後，在LAMP反應的擴增產物中加入顯色劑SYBR greenⅠ1.0 μL，顯色結果觀察到綠色螢光的判斷為陽性，橙色（橘黃色）判斷為陰性。

檢測結果：檢測結果（附圖3）表明，番茄晚疫病發病嚴重田塊土壤DNA通過LAMP擴增，顯色結果可觀察到綠色螢光，說明存在番茄晚疫病菌，而高壓滅菌土壤及陰性對照顯色結果為橙色，說明不存在番茄晚疫病菌，該套技術可用於土壤中番茄晚疫病菌的快速分子檢測。

以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。

SEQUENCE LISTING

福建省農業科學院植物保護研究所

用於檢測番茄晚疫病菌的LAMP引物組合物和應用

4

4

PatentIn version 3.3

1

18

DNA

人工序列

1

gccgatgagg tcatgtgc 18

2

18

DNA

人工序列

2

gttcacggcc agcttacg 18

3

40

DNA

人工序列

3

agtgggggtg gtgagcttca ctggacaatg aggccctgta 40

4

40

DNA

人工序列

4

ggtgacctga accacttggt gtgttcagct gaccggggaa 40