松樹脂潰瘍病菌的分子檢測方法
2024-03-30 14:23:05 1
專利名稱：松樹脂潰瘍病菌的分子檢測方法
技術領域：
本發明涉及涉及一種適於動植物檢疫、林業生產和植物保護等部門使用的對松樹脂潰瘍病菌(Fusarium circinatum Nirenberg O′Donnell，有性階段為Gibberellacircinata Nirenberg O′Donnell)的檢測方法，特別是簡單、快速的分子檢測方法，屬生物領域。
背景技術：
松樹脂潰瘍病是當今世界為害松樹最嚴重的病害之一。1946年，松樹脂潰瘍病害在美國東南部北卡羅萊納州矮松(P.virginiana)上首次發現，主要引起樹幹、枝條產生流脂、潰瘍等症狀。加利福尼亞州最早發現該病是1986年，隨後在當地分布不斷擴大，為害寄主也不斷增多，包括松屬、花旗松等多種樹種。此外，日本1989年、墨西哥1991年、南非1994年、智利2001年也相繼報導該病害的發生。松樹脂潰瘍病呈現一種迅速蔓延之勢，對林木危害日益嚴重，尤其是1986年松樹脂潰瘍病菌使美國加利福尼亞州中部海岸的輻射松遭受毀滅性打擊，引起了澳大利亞、紐西蘭、以及歐盟等國(地區)政府的廣泛關注。目前，中國雖尚未有該病害發生的報導，但應切實加強進境種子、苗木、木材以及木質包裝的檢疫，防止松樹脂潰瘍病菌傳入境內。為此，建立松樹脂潰瘍病菌經濟、快速地檢測技術具有重要意義。
松樹脂潰瘍病菌分類上被認為是李瑟組鐮刀菌Fusarium section Liseola的一個種，其有性階段為Gibberella fujikuroi(sawada)Ito Kimura中的交配群H。除上述交配群外，G.fujikuroi至少還包括另外7個在遺傳上完全不同的交配群，分別以A、B、C、D、E、F、G命名。不同交配群具有定殖於特定寄主的傾向。開展松樹脂潰瘍病菌檢疫鑑定常常需要同時進行致病性測定或與已知標準菌株進行有性雜交，常規檢疫鑑定方法費時費力，有時結果還不準確。Viljoen A.，Sreenkamp E T以及Schweigkofler W等曾試著從基因角度揭示松樹脂潰瘍病菌與其它近緣種間的差異，相繼建立了RAPD、PCR-RFLP以及實時PCR檢測方法。然而綜觀上述方法，有的實驗重複性不強，有的操作煩瑣，檢測費用昂貴，均未能很好地解決直接從樣品中檢測松樹脂潰瘍病菌的難題，口岸直接應用難度較大。
發明內容
本發明的目的是提供一種經濟、快速、簡便、特異性強且靈敏度高的松樹脂潰瘍病菌分子檢測方法，為各口岸開展進境種子、苗木、病木木材檢疫，嚴防松樹脂潰瘍病菌傳入提供可靠的技術手段。
本發明從病菌的菌絲、分生孢子以及種子、土壤、木材中提取病菌的DNA，以樣品DNA為模板，進行第一輪通用引物的PCR擴增，以第一輪反應的產物為模板，進行第二輪特異引物的PCR擴增，擴增產物進行電泳檢測。
具體檢測方法如下①.提取松樹病菌樣品的DNA，-20℃下保存備用；②.根據GenBank公布Fusarium屬IGS序列(登錄號AY249392，AY249389，AY249397，AY249403，AY249402，AY249399，AY249398，AY249401，AY249400，AY249393，AY249395，AY249385，AY249386，AY249382，AY249384，AY249383，AY249380，AY249387，AY249391，AY249394，AY249390，AY249366，AY249388，AY249381，AY249379，AY249405，AY249404，AY249408，AY249406，AY249407，AY249409)，利用引物設計軟體(Prime 5.1)，設計一對鐮刀菌核糖體基因內間隔區(IGS)片段上的通用引物G1/G2，其序列為G15』-GCGGTGTCGGTGTGCTTGTA-3』G25』-ACTCACGGCCACCAAACCA-3』③.根據松樹脂潰瘍病菌及其近緣種、相關種IGS差異，設計一對能鑑別松樹脂潰瘍病菌的特異性引物S1/S2，其序列為S15』-CTTACCTTGGCTCGAGAAGG-3』S25』-CCTACCCTACACCTCTCACT-3』④.利用特異性引物S1/S2和通用引物G1/G2，進行松樹脂潰瘍病菌巢式PCR擴增步驟如下第一輪擴增通用引物PCR擴增反應體系總體積為25μl，反應組分為10×reaction buffer 2.5μl，2.5mmol/L MgCl21.5μl，10pmol/L上、下遊通用引物G1、G2各0.5μl，10mmol/L dNTP 2μl，5u/μl Taq酶0.25μl，DMSO 1.25μl，模板松樹脂潰瘍病菌樣品DNA提取液1μl，滅菌水補足25μl；擴增反應程序為95℃變性5min，進入循環，94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，20個循環後72℃延伸10min。
第二輪擴增特異引物PCR擴增反應體系總體積為25μl，將第1輪PCR擴增產物稀釋100倍，取1μl作為模板；其它反應組分為10×reaction buffer 2.5μl，2.5mmol/L MgCl21.5μl，10pmol/L上遊引物S1、下遊引物S2各0.5μl，10mmol/L dNTP 2μl，5u/μl Taq酶0.25μl，DMSO 1.25μl，滅菌水補足25μl；反應程序為94℃變性3min，進入循環，94℃變性35s，66℃退火55s，72℃延伸50s，40個循環後72℃延伸12min。
⑤.擴增產物進行電泳檢測取10μl擴增產物，採用1.2％的瓊脂糖凝膠，在電壓80V下電泳20～40分鐘後在紫外燈下檢測，如果存在873bp的DNA特異性條帶，則確定所檢測的的病菌為松樹脂潰瘍病菌。
綜上所述，本發明成功地建立了一套檢測松樹脂潰瘍病菌的巢式PCR方法。使用該方法進行檢測松樹脂潰瘍病菌，只需一個工作日的時間，檢測靈敏度達到最低限量病菌DNA濃度為5×10-3pg/μl，分生孢子10個/100μl。克服了形態學鑑定耗時長、準確性低及現有分子檢測重複性不強、操作煩瑣、檢測費用昂貴、檢測靈敏度低等缺點；採用本發明檢測方法，可直接從土壤、木材以及種子中快速、靈敏、準確檢測松樹脂潰瘍病菌，特別適合於口岸檢疫等時效性要求特別強的場合使用。
具體實施例方式
下面通過實例，對本發明做進一步詳細說明。
實施例 松樹脂潰瘍病菌的分子檢測供試菌株及相關特性見表1。
表1供試菌株及來源Table 1 Strains tested and their origins
NCAUR美國應用農業研究中心National Center for Agricultural Utilization Research(USA)NJAU南京農業大學Nanjing Agriculture University1.樣品DNA的提取1.1菌絲體DNA的提取1.1-1菌株培養和菌絲體收集將菌株接於PDA培養基上，20-25℃下黑暗培養10天。用接種針將菌絲體輕輕刮下，置於塑料管中，冷凍乾燥，加少許石英沙研磨至細粉，-20℃下保存。
1.1-2用CTAB法提取菌絲DNA，具體操作如下1)取0.2g菌絲粉於2ml離心管內，加入細胞裂解緩衝液1ml，10μg/ml蛋白酶K，於渦旋器上充分混合後，55℃水浴1-3h；2)將離心管12,000rpm，離心10min；3)取上清800μl，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇為25∶24∶1的混合液，輕輕顛倒混勻，12,000rpm，離心10min；取上層水相600μl，加入等體積的氯仿∶異戊醇為24∶1的混合液，輕輕顛倒混勻，12,000rpm，離心10min；4)取上層水相400μl，加入2倍體積的冰無水乙醇和1/10體積的3M NaAc，置於-20℃沉澱1-3h；5)將離心管12,000rpm，離心10min；6)棄上清，沉澱用70％乙醇洗滌一次；7)乾燥後，用100μl滅菌水溶解，加入RNase於37℃消解1h後，-20℃下保存備用。
1.2病菌孢子DNA的提取用凍融法提取病菌孢子的DNA，具體操作如下1)取100μl孢子懸浮液至2ml離心管中，加入細胞裂解緩衝液500μl，10μg/ml蛋白酶K，於渦旋器上充分混合，將離心管放入研缽中，加入適量液氮速凍2min；2)將離心管放入75℃水浴2min；3)重複上述凍融2遍，最後一次速凍後，於75℃水浴30min；1)加入250μl的7.5mol/L NH4Ac，輕輕混合後於12,000rpm，離心10min；5)取上清600μl，於一新的2ml離心管，加入2倍體積的冰無水乙醇，-20℃沉澱1h；
6)將離心管12,000rpm，離心10min；7)棄上清，沉澱用70％乙醇洗滌一次；8)乾燥後，用10μl滅菌水溶解，-20℃下保存備用。
1.3帶菌種子中病菌DNA的提取1)取20g種子於三角瓶中，加入滅菌水，充分振蕩洗滌5min，取洗滌液於4000rpm，離心5min，收集沉澱；2)棄上清，加入100μl滅菌水，充分震蕩；3)取上述100μl孢子懸浮液至2ml離心管中，加入細胞裂解緩衝液500μl，10μg/ml蛋白酶K，於渦旋器上充分混合，將離心管放入研缽中，加入適量液氮速凍2min；4)將離心管放入75℃水浴2min；5)重複上述凍融2遍，最後一次速凍後，於75℃水浴30min；6)加入250μl的7.5mol/L NH4Ac，輕輕混合後於12,000rpm，離心10min；7)取上清600μl，於一新的2ml離心管，加入2倍體積的冰無水乙醇，-20℃沉澱1h；8)將離心管12,000rpm，離心10min；9)棄上清，沉澱用70％乙醇洗滌一次；10)乾燥後，用10μl滅菌水溶解，-20℃下保存備用。
1.4帶菌土壤中病菌DNA的提取1)取0.3g土壤，烘乾研磨至細粉。
2)將研磨後的細粉加入2ml離心管內後，加入0.4％脫脂奶粉，加入細胞裂解緩衝液500μl，10μg/ml蛋白酶K，於渦旋器上充分混合，將離心管放入研缽中，加入適量液氮速凍2min；3)將離心管放入75℃水浴2min；4)重複上述凍融2遍，最後一次速凍後，於75℃水浴30min；5)加入250μl的7.5mol/L NH4Ac，輕輕混合後於12,000rpm，離心10min；6)取上清600μl，於一新的2ml離心管，加入2倍體積的冰無水乙醇，-20℃沉澱1h；7)將離心管12,000rpm，離心10min；8)棄上清，沉澱用70％乙醇洗滌一次；9)乾燥後，用10μl滅菌水溶解，-20℃下保存備用。
1.5帶菌木屑中病菌DNA的提取1)取0.5g鋸木屑，加入2ml離心管內後，加入細胞裂解緩衝液500μl，10μg/ml蛋白酶K，於渦旋器上充分混合，將離心管放入研缽中，加入適量液氮速凍2min；2)將離心管放入75℃水浴2min；3)重複上述凍融2遍，最後一次速凍後，於75℃水浴30min；4)加入250μl的7.5mol/LNH4Ac，輕輕混合後於12,000rpm，離心10min；5)取上清600μl，於一新的2ml離心管，加入2倍體積的冰無水乙醇，-20℃沉澱1h；6)將離心管12,000rpm，離心10min；7)棄上清，沉澱用70％乙醇洗滌一次；8)乾燥後，用10μl滅菌水溶解，-20℃下保存備用。
2.通用引物和特異引物的設計根據GenBank中登錄鐮刀菌rRNA基因內間隔區IGS序列(登錄號AY249392，AY249389，AY249397，AY249403，AY249402，AY249399，AY249398，AY249401，AY249400，AY249393，AY249395，AY249385，AY249386，AY249382，AY249384，AY249383，AY249380，AY249387，AY249391，AY249394，AY249390，AY249366，AY249388，AY249381，AY249379，AY249405，AY249404，AY249408，AY249406，AY249407，AY249409)，利用引物設計軟體(Prime 5.1)，設計一對鐮刀菌通用引物G1/G2，和一對針對松樹脂潰瘍病菌的特異引物S1/S2，其序列為G15』-GCGGTGTCGGTGTGCTTGTA-3』G25』-ACTCACGGCCACCAAACCA-3』S15』-CTTACCTTGGCTCGAGAAGG-3』S25』-CCTACCCTACACCTCTCACT-3』3.建立病菌檢測特異性擴增反應條件反應體系體積為25μl，反應組分為10×reaction buffer 2.5μl，2.5mmol/L MgCl21.5μl，10pmol/L上下遊引物S1、S2各0.5μl，101mmol/L dNTP 2μl，5u/μl Taq酶0.25μl，DMSO 1.25μl，模板DNA5ng，滅菌水補足25μl。以滅菌水代替模板DNA作為陰性對照。混合液在PTC-200 PCR PCR儀上進行擴增，反應程序為94℃變性3min，進入循環，94℃變性35s，66℃退火55s，72℃延伸50s，40個循環後72℃延伸12min4.特異性擴增靈敏度測試將NFUH-3的DNA稀釋成不同的濃度梯度，分別為5×105pg/μl，5×104pg/μl，5×103pg/μl，5×102pg/μl，50pg/μl，5pg/μl，5×10-1pg/μl，5×10-2pg/μl。取1μl為模板，按程序3擴增檢測靈敏度。
5.病菌檢測通用引物擴增反應體系為25μl，反應組分為10×reaction buffer 2.5μl，2.5mmol/L MgCl21.5μl，10pmol/L上下遊引物G1、G2各0.5μl，10mmol/L dNTP 2μl，5u/μl Taq酶0.25μl，DMSO 1.25μl，模板DNA提取液1μl，滅菌水補足25μl。以滅菌水代替模板DNA作為陰性對照。混合液在PTC-200 PCR儀上進行擴增，反應程序為95℃變性5min，進入循環，94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，20個循環後72℃延伸10min。
6.巢式PCR分子檢測體系的建立按程序5進行第1輪PCR擴增的反應，體系為25μl。
按程序3將第1輪PCR擴增產物稀釋100倍，取1μl作為第2輪擴增的模板進行第2輪PCR擴增反應，反應體系體積為25μl。
7.巢式PCR靈敏度的測定將提取NFUH-3的DNA稀釋成5×105pg/μl，5×104pg/μl，5×103pg/μl，5×102pg/μl，50pg/μl，5pg/μl，5×10-1pg/μl，5×10-2pg/μl，5×10-3pg/μl，5×10-4pg/μl，5×10-5pg/μl等11個濃度梯度，按程序5擴增。
將100μl H2O中的NFUH-3孢子數量分別調成1×107個，1×106個，1×105個，1×104個，1×103個，1×102個，10個，1個，離心，提取DNA，按程序5擴增。
分別在20g溼地松種子、0.3g土壤以及0.5g木屑中按1×106個，1×105個，1×104個，1×103個，1×102個，10個等6個梯度加入NFUH-3孢子液，提取DNA，按程序3擴增。
8.檢測實驗結果1)用設計的通用引物G1/G2對供試菌株的基因組DNA進行擴增，結果顯示，供試的16種鐮刀菌均可擴增出一條873bp大小的條帶，而陰性對照和其他鐮刀屬以外的種沒有擴增出此條帶。
2)用鑑定松樹脂潰瘍病菌的一對特異引物S1/S2對供試菌株基因組DNA進行擴增，結果顯示，松樹脂潰瘍病菌4個菌株可擴增出364bp大小的特異條帶，而陰性對照和其他菌株沒有擴增出特異條帶。對不同模板濃度DNA進行擴增，結果顯示使用特異引物進行一次PCR擴增最低可檢測到的病菌DNA濃度為50pg/μl。
3)巢式PCR擴增電泳結果顯示，松樹脂潰瘍病菌的4個菌株可擴增出364bp大小的特異條帶，而陰性對照和其他菌株沒有擴增出特異條帶。對不同模板濃度DNA進行巢式PCR擴增，結果顯示巢式PCR擴增最低可檢測到的病菌DNA濃度為5×10-3pg/μl，分生孢子數量為10個。
4)對巢式PCR方法在種子、苗木、木材以及土壤中檢測松樹脂潰瘍病菌的靈敏度進行了測定，結果在20g種子中能檢測出100個孢子，0.3g土壤中能檢測出1000個孢子，0.5g木屑中能檢測出100個孢子。
權利要求
1.松樹脂潰瘍病菌的分子檢測方法，其特徵是檢測方法如下①.提取松樹病菌樣品的DNA，-20℃下保存備用；②.根據GenBank公布Fusarium屬IGS序列，利用引物設計軟體Prime 5.1，設計一對鐮刀菌核糖體基因內間隔區IGS片段上的通用引物G1/G2，其序列為G15』-GCGGTGTCGGTGTGCTTGTA-3』G25』-ACTCACGGCCACCAAACCA-3』③.根據松樹脂潰瘍病菌及其近緣種、相關種IGS差異，設計一對能鑑別松樹脂潰瘍病菌的特異性引物S1/S2，其序列為S15』-CTTACCTTGGCTCGAGAAGG-3』S25』-CCTACCCTACACCTCTCACT-3』④.利用特異性引物S1/S2和通用引物G1/G2，進行松樹脂潰瘍病菌巢式PCR擴增步驟如下第一輪，通用引物PCR擴增反應體系總體積為25μl，反應組分為10×reaction buffer 2.5μl，2.5mmol/L MgCl21.5μl，10pmol/L上、下遊通用引物G1、G2各0.5μl，10mmol/L dNTP 2μl，5u/μl Taq酶0.25μl，DMSO 1.25μl，模板松樹病菌樣品DNA提取液1μl，滅菌水補足25μl；擴增反應程序為95℃變性5min，進入循環，94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，20個循環後72℃延伸10min；第二輪，特異引物PCR擴增反應體系總體積為25μl，將第1輪PCR擴增產物稀釋100倍，取1μl作為模板；其它反應組分為10×reaction buffer 2.5μl，2.5mmol/L MgCl21.5μl，10pmol/L上遊引物S1、下遊引物S2各0.5μl，10mmol/L dNTP 2μl，5u/μl Taq酶0.25μl，DMSO 1.25μl，滅菌水補足25μl；反應程序為94℃變性3min，進入循環，94℃變性35s，66℃退火55s，72℃延伸50s，40個循環後72℃延伸12min；⑤.擴增產物進行電泳檢測取10μl擴增產物，採用1.2％的瓊脂糖凝膠，在電壓80V下電泳20～40分鐘後在紫外燈下檢測，如果存在873bp的DNA特異性條帶，則確定所檢測的的病菌為松樹脂潰瘍病菌。
2.根據權利要求1所述的松樹脂潰瘍病菌的分子檢測方法，其特徵是所說的松樹病菌樣品的DNA從菌絲、分生孢子以及種子、土壤或木材中提取。
全文摘要
本發明涉及一種松樹脂潰瘍病菌的分子檢測方法，利用引物設計軟體Prime 5.1，設計一對鐮刀菌IGS片段上的通用引物G1/G2和特異性引物S1/S2，以松樹病菌樣品DNA提取液為模板，進行第一輪的通用引物PCR擴增反應；隨後PCR擴增產物稀釋100倍，取1μl作為模板，進行第二輪的特異引物PCR擴增反應。擴增產物進行電泳檢測，如果存在873bp的DNA特異性條帶，則確定所檢測的的病菌為松樹脂潰瘍病菌。用本方法檢測松樹脂潰瘍病菌，只需一個工作日的時間，檢測靈敏度達到最低限量病菌DNA濃度為5×10
文檔編號C12Q1/68GK1880476SQ20061004003
公開日2006年12月20日 申請日期2006年4月29日 優先權日2006年4月29日
發明者李百勝, 廖太林, 吳翠萍, 紀睿 申請人:中華人民共和國崑山出入境檢驗檢疫局