大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子、製備及檢測方法
2024-03-30 14:37:05 1
專利名稱：大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子、製備及檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種生物工程領域檢測用的標準分子，特別是涉及一種大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子、其製備方法及檢測方法。
背景技術：
大豆(Glycine max)是我國重要的油料作物和糧食作物，也是世界上食用油和植物蛋白的主要來源，在我國國民經濟中佔有重要地位。目前我國大豆產量居世界第四位，但仍然不能滿足國內植物油及飼料蛋白加工的需要。隨著我國進口大豆的數量逐年遞增，各種危害大豆生產的病害傳入的風險也逐漸增大。大豆莖潰瘍病(Soybean Stem Canker，簡稱SSC)是大豆生產上的一種重要病害，病原菌分別為大豆北方蓮饋蕩病菌(Diaporthe phaseolorum(Cooke etEll)Sacc. var. caulivora Athow et Caldwell,簡稱 DPC)禾口大豆南方蓮饋蕩病菌(Diaporthe phaseolorum (Cooke et Ell. ) Sacc. var. meridionalis F. A. Fernandez,簡禾爾 DPM)。這兩禾中大豆真菌病害目前嚴重影響大豆生產及貿易，具有檢疫重要性和經濟重要性。這兩種病原菌都是我國重點關注進境植物檢疫對象。DPC屬於子囊菌門、球殼目、間座殼科、間座殼屬。該病菌侵染植株後迅速發展形成莖杆環狀損傷，並可導致正在生長的植株死亡。發病嚴重的田塊有80%的植株受到侵染，造成嚴重的經濟損失。在美國、阿根廷、巴西、加拿大、巴拉圭、義大利、前南斯拉夫、克羅埃西亞等歐洲部分國家及地區有發生報導，是國外大豆生產上的重要病害。1973年在美國首次報導DPM。莖潰瘍病菌以菌絲和子囊殼在大豆植株殘體上越冬，並且抗逆性很強，病殘體在-18°C 15°C下可存活14個月。通過種子和混在大豆中的病殘體可進行遠距離傳播，種子帶菌是傳病因素之一。目前分布於美國、巴西、阿根廷、玻利維亞、巴拉圭等國，是國外大豆生產上的重要病害。分子生物學檢測方法如常規PCR，實時螢光PCR，基因晶片等在實際檢測過程中這些方法都需要陽性參考物質作為對照，以保證實驗結果的可靠性，並對實驗結果的分析及判定有重要意義。而陽性參考物質的質量與實驗結果有直接關係。在現階段對大豆北方莖潰瘍病菌和大豆南方莖潰瘍病菌進行研究和檢測的過程中所用的陽性參考物質通常是陽性菌的基因組DNA。該基因組DNA是從真菌中直接抽提得到，而抽提基因組DNA的過程較複雜，製備非常不方便。由於真菌保存條件較苛刻，並非所有實驗室都具有保存DPC和DPM的條件。製備得到的基因組DNA的穩定性也尚不能滿足長期及經常性使用的需要。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種製備簡便、特異性強、具有極好均勻性和穩定性的大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子。本發明的另一目的在於提供上述標準分子的製備方法。本發明的再一目的在於提供上述標準分子的檢測方法。
為實現上述目的，本發明採用了以下技術方案本發明公開了一種大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子，所述陽性標準分子為能夠自主複製的質粒分子，且所述質粒中含有大豆莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區的DNA 序列。所述大豆莖潰瘍病菌包括大豆北方莖潰瘍病菌(DPC)和大豆南方莖潰瘍病菌 (DPM)中的至少一種。所述質粒中含有大豆北方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區的DNA序列和大豆南方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區的DNA序列中的至少一種，優選同時含有。所述大豆北方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區的DNA序列含有kqlD No. 1所示的序列，所述大豆南方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區的DNA序列含有％(1 ID No. 2 所示的序列。所述質粒優選為T載體，在本發明的一個具體的實施方式中，所述質粒為 PMD18-T。本發明進一步公開了上述大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子的製備方法，所述方法包括設計PCR引物，並以大豆莖潰瘍病菌基因組DNA為模板擴增得到大豆莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區的DNA序列，並轉化質粒。優選的，所述質粒中同時含有大豆北方莖潰瘍病菌和大豆南方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區DNA序列，並且所述方法包括將大豆北方莖潰瘍病菌和大豆南方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區的DNA序列分別轉化質粒，再將得到的重組子經酶切及拼接得到所述陽性標準分子。所述PCR引物包括用於擴增大豆北方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區DNA序列的引物對1和用於擴增大豆南方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區DNA序列的引物對2中的至少一種，並且優選的，引物對1含有下述kq ID No. 3和kq ID No. 4所示的序列，Seq ID No. 3 5' -TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3『Seq ID No. 4 5' -GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3『引物對2含有下述kq ID No. 5和kq ID No. 6所示的序列，Seq ID No. 5 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3『Seq ID No. 6 5' -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3『。本發明還公開了上述大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子的檢測方法，所述方法包括，利用特異性檢測引物和探針，以所述陽性標準分子為模板進行實時螢光PCR反應，所述特異性檢測引物和探針包括以下兩組中的至少一組，並且所述探針5』端和3』端分別標記有螢光報告基團和螢光淬滅基團，a、針對大豆北方莖潰瘍病菌的特異性檢測引物DPC-F、DPC-R和探針DPC-P DPC-F 5' -GCTTGGTGTTGGGGCACT-3『 Seq ID No. 7DPC-R 5' -TACGCTCGGGGTCCTGG-3『 Seq ID No. 8DPC-P 5' -TGAAATTCATTGGCGAGCT-3『 Seq ID No. 9b、針對大豆南方莖潰瘍病菌的特異性檢測引物DPM-F、DPM-R和探針DPM-P
DPM-F 5' -CCAGAAACCCTTTGTGAACTC-3『 Seq ID No. 10DPM-R 5' -TGTTTTTTGCTCAGAGTTTCG-3『 Seq ID No. 11DPM-P 5' -ACAAGAGTTGGCTTGGC-3『 Seq ID No. 12由於採用了以上技術方案，使本發明具備的有益效果在於利用本發明的方法製備得到的大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子，具有可以長期穩定保存、高拷貝數、易獲得、純度高和製備方便等特點，並且製備簡便、特異性強、具有極好均勻性和穩定性，可以替代大豆莖潰瘍病菌的基因組DNA用於大豆莖潰瘍病菌的定性 PCR、定量PCR檢測及分析，解決了大豆莖潰瘍病菌檢測中標準分子缺乏的難題。該標準分子適合於口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等部門使用。
圖1為本發明構建的標準質粒分子pMD18-T-DPC-DPM的示意圖譜；圖2為以DPC-F/R/P引物探針對供試材料的實時螢光特異性測試結果圖；圖3為以DPM-F/R/P引物探針對供試材料的實時螢光特異性測試結果圖；圖4為以DPC-F/R/P引物探針對pMD18-T-DPC_DPM的實時螢光靈敏度測試結果圖；
圖5為以DPC-F/R/P引物探針對pMD18_T-DPC_DPM的實時螢光擴增標準曲線；圖6為以DPC-F/R/P引物探針對pMD18-T-DPC_DPM的實時螢光靈敏度測試結果圖；圖7為以DPC-F/R/P引物探針對pMD18_T-DPC_DPM的實時螢光擴增標準曲線。
具體實施例方式本發明的目的在於克服現有技術不足，研製製備簡便、特異性強、具有極好均勻性和穩定性的大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子，或者稱大豆莖潰瘍病菌的分子檢測標準分子，使其可以替代大豆莖潰瘍病菌的基因組DNA用於大豆莖潰瘍病菌的定性PCR、定量 PCR檢測及分析。根據大豆北方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區序列和大豆南方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區序列，設計PCR引物，經過PCR擴增獲得大豆北方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區序列和大豆南方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區序列。利用分子克隆技術將DNA片段克隆到可以自主複製的質粒載體上，獲得新的重組質粒分子。本發明的質粒優選用T載體，比如可以將上述擴增得到的DNA片段克隆到pMDIS-T載體上，獲得新的質粒分子pMD-T-DPC-DPM。本發明構建的標準質粒分子可代替大豆莖潰瘍病菌原有的陽性標準分子，用於定性和定量PCR檢測，解決大豆莖潰瘍病菌檢測中標準分子缺乏的難題。本發明的陽性標準分子，可根據具體使用情況僅包含DPC的核糖體內轉錄間隔區的DNA序列或者DPM的核糖體內轉錄間隔區的DNA序列，優選同時含有兩者。當僅包含上述一種DNA序列時，所製備的陽性標準分子也僅可作為該種類型大豆莖潰瘍病菌檢測時的陽性標準分子。當同時包含兩者時，所製備的陽性標準分子即可作為檢測DPC的陽性標準分子，也可作為檢測DPM的陽性標準分子。所述的大豆莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區序列，指的是大豆莖潰瘍病菌 internal transcribed spacer DNA序列，其在大豆莖潰瘍病菌基因組中高度保守，具有種間特異性、種內非特異性和高拷貝數的特點。本發明的標準質粒分子pMD18-T-DPC-DPM構建方法，包括如下步驟
①利用GenBank等資料庫進行生物信息學分析，獲得大豆莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區序列。②設計PCR引物。所述的PCR引物，指的是長度為28 士 IOnt的寡核普酸鏈，其與大豆莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區序列完全相同或者互補。③擴增大豆北方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區序列和大豆南方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區序列。所述的擴增，指的是利用設計的PCR引物，在Taq聚合酶作用下擴增大豆北方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區序列和大豆南方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區序列。④分別含有大豆北方莖潰瘍病菌和大豆南方莖潰瘍病菌核糖體內轉錄間隔區序列的質粒分子克隆。所述的分子克隆，指的是將上述得到的特異性DNA片段按照設計的限制性內切酶酶切位點連接到質粒載體PMD18-T上，獲得標準質粒分子pMD18-T-DPM及pMD18_T_DPC。⑤標準分子pMD18-T-DPC-DPM的構建根據預先設計的限制性內切酶酶切位點，利用核酸內切酶消化、連接酶連接等分子生物學技術將PMD18-T-DPM及pMD18_T_DPC進行酶切並將目標片段再連接，從而獲得標準質粒分子 PMD18-T-DPC-DPM。⑥標準質粒分子pMD18-T-DPC-DPM定性和定量PCR檢測方法驗證。所述的定性PCR檢測方法驗證，是指用於標準質粒分子pMDIS-T-DPC-DPM構建的種特異性片段只能在大豆北方莖潰瘍病菌和大豆南方莖潰瘍病菌基因組DNA中擴增獲得， 而不能在其他大豆莖潰瘍病菌近似種基因組中擴增得到。所述的定量PCR檢測方法驗證，是指檢測標準質粒分子pMDIS-T-DPC-DPM在進行定量PCR分析時的特異性、靈敏度、均勻性和重複性等特性，以鑑定該標準分子替代大豆莖潰瘍病菌陽性標準分子的能力，以及實際應用於定量PCR檢測大豆莖潰瘍病菌的測定有效性。下面通過具體實施例並結合附圖對本發明作進一步詳細說明。實施例1 標準分子的構建一、實驗試劑限制性內切酶)(bal，KpnI以及限制性內切酶緩衝液，pMD18_T載體，T4 DNA連接酶及其緩衝液，dNTPs, Taq DNA聚合酶及其緩衝液、DL2000Marker，Agarose Gel DNA Purification Kit 和 MiniBEST Plasmid Purification Kit 購自大連寶生物工程有限公司。DH5ci感受態細胞購自北京天根生物公司。TaqMan探針及引物由上海超世生物科技有限公司合成。其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。二、實驗儀器DY-8型核酸電泳儀(北京六一儀器有限公司)，Biometra Grident PCR儀， Syngene凝膠成像系統，其他儀器包括離心機，恆溫水浴鍋，培養箱，天平等。三、試驗方法和過程1、在GenBank中搜索大豆北方莖潰瘍病菌和大豆南方莖潰瘍病菌及其近似種核糖體內轉錄間隔區序列。
2、構建標準質粒分子pMD18-T-DPC-DPM的PCR引物序列設計根據獲得的大豆北方莖潰瘍病菌和大豆南方莖潰瘍病菌及其近似種核糖體內轉錄間隔區序列，利用軟體I^rimer 5.0設計兩對PCR引物，分別用於擴增大豆北方莖潰瘍病菌和大豆南方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區序列。具體的引物序列見表1。表1供試引物
權利要求
1.一種大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子，其特徵在於所述陽性標準分子為能夠自主複製的質粒分子，且所述質粒中含有大豆莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子，其特徵在於所述大豆莖潰瘍病菌包括大豆北方莖潰瘍病菌(DPC)和大豆南方莖潰瘍病菌(DPM)中的至少一種。
3.根據權利要求2所述的大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子，其特徵在於所述質粒中含有大豆北方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區的DNA序列和大豆南方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區的DNA序列中的至少一種。
4.根據權利要求3所述的大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子，其特徵在於所述大豆北方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區的DNA序列含有％(110 No. 1所示的序列，所述大豆南方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區的DNA序列含有％(1 ID No. 2所示的序列。
5.根據權利要求1 4任意一項所述的大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子，其特徵在於所述質粒為T載體。
6.根據權利要求5所述的大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子，其特徵在於所述質粒為 pMD18-T。
7.權利要求1 6任意一項所述的大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子的製備方法， 所述方法包括設計PCR引物，並以大豆莖潰瘍病菌基因組DNA為模板擴增得到大豆莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區的DNA序列，並轉化質粒。
8.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於所述質粒中同時含有大豆北方莖潰瘍病菌和大豆南方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區DNA序列，並且所述方法包括將大豆北方莖潰瘍病菌和大豆南方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區的DNA序列分別轉化質粒， 再將得到的重組子經酶切及拼接得到所述陽性標準分子。
9.根據權利要求7或8所述的製備方法，其特徵在於所述PCR引物包括用於擴增大豆北方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區DNA序列的引物對1和用於擴增大豆南方莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區DNA序列的引物對2中的至少一種，引物對1含有下述ID No. 3和kq ID No. 4所示的序列，Seq ID No. 3:5' -TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3『Seq ID No. 4:5' -GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3『引物對2含有下述^^ ID No. 5和^^ ID No. 6所示的序列，Seq ID No. 5:5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3『Seq ID No. 6 5' -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3『。
10.權利要求1 6任意一項所述的大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子的檢測方法， 所述方法包括，利用特異性檢測引物和探針，以所述陽性標準分子為模板進行實時螢光PCR 反應，所述特異性檢測引物和探針包括以下兩組中的至少一組，並且所述探針5』端和3』端分別標記有螢光報告基團和螢光淬滅基團，a、針對大豆北方莖潰瘍病菌的特異性檢測引物DPC-F、DPC-R和探針DPC-P DPC-F 5' -GCTTGGTGTTGGGGCACT-3『 Seq ID No. 7DPC-R 5' -TACGCTCGGGGTCCTGG-3『 Seq ID No. 8DPC-P 5' -TGAAATTCATTGGCGAGCT-3『 Seq ID No. 9b、針對大豆南方莖潰瘍病菌的特異性檢測引物DPM-F、DPM-R和探針DPM-P DPM--F5'-CCAGAAACCCTTTGTGAACTC--3'SeqIDNo.10DPM--R5'-TGTTTTTTGCTCAGAGTTTCG--3'SeqIDNo.11DPM--P5'-ACAAGAGTTGGCTTGGC-3『SeqIDNo.12。
全文摘要
本發明公開了一種大豆莖潰瘍病菌檢測用陽性標準分子，所述陽性標準分子為能夠自主複製的質粒分子，且所述質粒中含有大豆莖潰瘍病菌的核糖體內轉錄間隔區的DNA序列。本發明還公開了上述標準分子的製備方法和檢測方法。本發明中構建的陽性標準分子可以代替大豆北方莖潰瘍病菌和大豆南方莖潰瘍病菌的陽性DNA，該標準質粒分子適用於對大豆北方莖潰瘍病菌和大豆南方莖潰瘍病菌的定性PCR、定量PCR分析和檢測。該標準分子適合於口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等部門使用。
文檔編號C12Q1/04GK102373233SQ20101026013
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月23日 優先權日2010年8月23日
發明者向才玉, 王穎, 程穎慧, 章桂明, 繆建錕 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心