水稻染色質變構因子chr729在控制水稻發育中的應用的製作方法

2024-03-20 04:09:05 2

專利名稱：水稻染色質變構因子chr729在控制水稻發育中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物生物技術領域。具體涉及一個與細胞分裂相關的水稻染色質變構因子CHR729的分離克隆、功能驗證和應用。所述的基因與控制水稻發育有關。
背景技術：
生物體的生長需要細胞的分裂和細胞的生長來完成。而細胞的分裂扮演著尤為重要的角色，一旦其發生異常會對生物體的生長造成嚴重的影響，例如人類的大部分癌症都是由於細胞的分裂失控導致細胞不斷增殖的結果，因此生物體會有一套嚴格的控制細胞分裂的機制。細胞的分裂周期有G1，S，G2以及M這4個時期，主要由細胞周期蛋白和依賴於細胞周期蛋白的激酶來控制它們的完成，生物體在特定的時期會有一些檢驗點，例如在進入S期以前需檢驗DNA是否完整或者損傷，而S期以後需檢驗DNA是否複製完成，在進入 M期之前還要再檢驗一次DNA是否完整損傷，如果這些檢驗點中的某一個沒有通過，細胞周期都會停滯直到通過為止。從DNA的損傷到細胞周期的停滯這一系列的信號傳導在人類中研究的較為清楚，當DNA損傷以後一些細胞周期的抑制因子會被激活，它們通過抑制細胞周期蛋白或者依賴於細胞周期蛋白的激酶的活性來抑制細胞周期的進行。在植物中對於這一信號途徑有了一定的研究，與人類相比存在一些相似的地方， 但似乎也存在著植物特有的方式。研究發現許多含SNF2結構域的蛋白參與擬南芥DNA損傷的信號傳導，而這些中的許多都參與表觀遺傳調控，同時在人類中染色質變構因子如CHD5 以及CHD8也是細胞周期中的重要調控因子(Bagchi A等，CHD5 is a tumor suppressor at human lp36. Cell, 2007,128 :459-75 ；Fujita T 等，CHD5, a tumor suppressor gene deleted from lp36.3 in neuroblastomas. J Natl Cancerlnst,2008,100 :940-9 ； 及 Nishiyama M 等，CHD8 suppresses p53_mediated apoptosis through histone Hl recruitment during early embryo genesis. Nat Cell Biol, 2009,11 :172-82.),證明表觀遺傳調控可能在這一信號傳導過程中發揮重要的作用。真核生物的DNA與組蛋白結合以染色質的形式存在於核中，這種染色質的結構會阻礙轉錄因子以及轉錄酶與DNA的結合從而不利於基因的表達，因此必須改變這種染色質的結構暴露出DNA進行轉錄使基因得以表達，這種涉及到染色質結構改變的調控方式也被稱作表觀遺傳調控，它的分子機理現在還沒有完全揭示，但是目前發現了很多與染色質結構相關事件參與基因表達調控例如組蛋白修飾，DNA甲基化，組蛋白變體以及染色質重塑， 有人提出組蛋白修飾或者DNA甲基化可能作為一種密碼被其他的蛋白識別繼而調控基因的表達，但這種假設到現在還沒有被完全證實。含SNF2結構域的蛋白能夠通過水解ATP改變染色質的結構發生改變，很多此類蛋白除了含有SNF2結構域還含有現在研究發現可以識別並結合特定組蛋白修飾位點的結構域如Chromodomain和PHD結構域，例如人類CHDl 蛋白的Chromodomain可以識別三甲基化H3K4，而CHD3的PHD結構域可以與三甲基化的 H3K36結合，可能這些蛋白正是通過識別這些甲基化的信號來改變這個區域的染色質的結構從而調控基因的表達，這也部分支持了組蛋白密碼的假說(Flanagan J F等，Double
3chromodomains cooperate to recognize the methylated histone H3 tail. Nature, 2005,438 :1181-5 ；Shi X 等，ING2 PHD domain links histone H3 lysine4 methylation to active gene repression. Nature,2006,442 :96-9)。經檢索,在 ChromDB 資料庫(http://www. chromdb. org/index. html)中利用一個在擬南芥中被認為可能參與DNA損傷信號傳導的含SNF2結構域的蛋白CHR4在公共資料庫 (http://rice. plantbiology. msu. edu/)的序列進行對比搜索發現了一個水稻同源的蛋白 CHR729，但沒有全長cDNA的支持，僅有兩個片段分別對應於5』端和3』端，關於此基因在水稻中的功能還不清楚。

發明內容
本發明的目的是通過RNAi技術使得一個水稻的CHR7^基因在體內下降表達來研究該基因在水稻中的功能，並應用於水稻生長發育的調控。本發明通過以下技術方案實現本發明在水稻種找到了一個影響水稻細胞分裂的含SNF2結構域的基因CHR729， 並進行了全長cDNA驗證，該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示，序列全長為6780個bp。該基因的編碼區位於所述序列表SEQ ID NO 1所述序列的232-369位， 1552-1911位和6207-6620位鹼基處，共編碼2259個胺基酸。在此基因的翻譯區內設計一段該基因特異的片段，構建到用於一種抑制表達載體pDS1301(見圖1)然後轉化「中花11」， 得到轉基因水稻植株。轉基因陽性植株擁有植株變矮、葉片(劍葉和營養葉)變短變窄、抽穗期變晚等多種表型，表明CHR7^基因對水稻的正常發育起著重要的作用。具體操作步驟如下從 ChromDB 資料庫(http://www. chromdb. org/index. html)得到 CHR729 基因 (L0C_07g31450)的DNA序列，根據該序列設計引物對，擴增特異的片段區域(見附錄序列 1)。其中引物序列如下dsCHR7^-F5，一GGGACTAGTGGTACCACCTGCCTCTCCTGCAGTTA—3， 和 dsCHR729-R 5』 -—GGGGAGCTCGGATCCGACTCCTCGTCGCTGGATA-—3，。(2)構建抑制表達載體PDS1301 (見圖1)，獲得轉化載體pDS1301_CHR729 ；(3)利用農桿菌介導的轉基因方法(Hiei Y等，Efficient transformation ofrice (OryzasativaL. )mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. PlantJ. 1994，6 :271-282.))將所述的載體導入水稻受體中花 11 (來自中國農業科學院作物研究所)，獲得轉化植株；(4)藉助RT-PCR和Northern Blot方法分析鑑定陽性轉基因植株，並觀察統計轉基因植株表型；(5)利用石蠟切片技術觀察成熟葉片細胞數目在轉基因陽性植株中的變化；(6)通過匪S處理檢測在中花11中的CHR7^基因表達量的變化；(7)通過IOuM 6-BA處理中花11和轉基因陽性植株，檢測CHR7^基因及0sRR7基因在這兩個材料中表達量的變化；(8)藉助原核表達蛋白和Wfestern Blot進行體外組蛋白結合實驗鑑定CHR7^基因與組蛋白識別的位點。更詳細的技術發明細節由以下實施例給出，但並不是限制該發明的保護範圍。


序列表SEQ ID NO 1 是本發明克隆的水稻染色質變構因子CHR7^的核苷酸序列和對應的胺基酸序列。圖1 抑制表達載體pDS 1301示意圖。圖2 :CHR729基因在轉基因植株中的表達量檢測。圖中A是CHR7^基因在TO代 RNAi轉基因植株中的表達量檢測，以中花11為陰性對照；B是CHR7^基因在Tl代RNAi轉基因植株中表達量與表型的共分離檢測，編號為10-1，10-2，21-2，21-3代表有表型轉基因陽性植株，編號為中花11，10-13,21-12代表無表型轉基因陰性植株，以中花11為陰性對照。圖3:CHR729的RNAi轉基因植株的表型圖。左圖為中花11陰性對照，右圖為 CHR729轉基因陽性有效性植株；英文小寫字母a代表中花11的種子，b_d代表CHR7^轉基因陽性有效性三個家系的種子。圖4 轉基因植株葉片的石蠟切片以及電鏡掃描分析。中花11代表陰性對照； dsCHR729代表轉基因陽性植株。圖5 匪S處理對CHR7^表達的影響。上圖為發芽25天左右的中花11為材料， 200mM MMS的水培液中培養為實驗組，不含MMS水培液為對照，分別取培養1小時，4小時， 8小時和M小時材料地上部分檢測CHR729的RNA水平的相對表達量，actin為內參；下圖為發芽 25 天左右的中花 11 為材料，在 Oppm，25ppm, 50ppm, 75ppm, IOOppm, 150ppm及 200ppm 濃度的匪S水培液中培養M小時後，取材料地上部分檢測CHR7^基因的RNA水平的相對表達量，actin為內參。圖6 中花11及轉基因植株中0sRR7對6-BA應答的情況。Slll為陰性對照材料， 10-17-3為CHR729RNAi轉基因的T3代材料，發芽12天，同時用IOuM 6-BA水培養培養O小時和1小時，不含6-BA的培養液培養O小時和1小時為陰性對照，然後取材料地上部分檢測CHR7^和0sRR7基因在RNA水平的相對表達量，actin為內參。圖7 體外檢測CHR729基因的結構域與組蛋白特異修飾位點的結合。上圖為 CHR729基因的蛋白質結構域的預測的示意圖，PHD結構域從78位胺基酸到123位胺基酸， Chromo結構域從518位胺基酸到637位胺基酸，SNF2結構域從658位胺基酸到1164位胺基酸。下圖為體外結合的實驗，左側從上至下分別為Western Blot實驗用的一抗分別為H3 抗體，三甲基化H3K4抗體，三甲基化H3K9抗體，三甲基化H!3K27抗體及三甲基化H!3K36抗體；圖上標從左至右為實驗所用的蛋白，分別為Histone (小牛組蛋白)為陽性對照，原核表達純化的GST蛋白為陰性對照，融合GST標籤原核表達的PHD結構域和融合GST標籤原核表達的Chromo結構域為兩個實驗組。
具體實施例方式實施例1 CHR7^基因片段克隆、雙元Ti質粒載體的構建及轉化及轉基因植株的陽性檢測對本發明所需要的基因，通過RT-PCR方法(參見J.薩姆布魯克，EF弗裡奇， T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學出版社，2002版)進行擴增得到CHR7^特異的一段序列，具體步驟是根據公共資料庫(http://rice. plantbiology. msu. edu/)公布的CHDl基因的全長cDNA序列，通過在ChromDB資料庫 (http //www. chromdb. org/index. html)中比對尋找CHR7^特異的序列設計引物，PCR擴增RNAi抑制片段。擴增產物通過T/A克隆連接到pGEMT-vector (ftOmega)進行測序驗證。 用來克隆 CHR729 的 RNAi 抑制片段的引物為dsCHR7^_F5，-—GGGACTAGTGGTACCACCTGCCT CTCCTGCAGTTA-—3 』 和 dsCHR729_R5 』 -—GGGGAGCTCGGATCCGACTCCTCGTCGCTGGATA-—3 』。其擴增的DNA片段如附錄序列1所示。具體步驟如下1)將帶有CHR729的RNAi片段的T/A克隆用KpnI和BamHI酶切，回收目標條帶，與KpnI和BamHI酶切的表達載體質粒pDS1301 (山東農業大學山東省農業微生物重點實驗室儲昭輝教授贈送；該質粒的圖譜見圖1 ；文獻Chu等，Promoter mutations of an essential gene for pollen development result in disease resistance inrice.Genes Dev，2006，20 :1250-1255.)連接(所使用的內切酶均購自寶生物工程大連有限公司，使用方法及用量按照該公司提供的產品說明書；連接酶為上海英俊生物技術公司產品，用法及用量按照該公司產品說明書)；2)連接產物通過電轉化的方法(電轉化儀為印pendorf公司產品，所用電壓為 1800v，操作方法見儀器說明書)導入DH10B (購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司，即美國!Iomega公司)，在含有250ppm卡那黴素(購自羅氏生物公司產品)的LA (LA配方參見J.薩姆布魯克，EF弗裡奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學出版社，2002版)抗性培養基上塗皿培養；3)將LA抗性培養基上長出的單菌落在超淨工作檯接種於滅菌的IOml離心管，管內預先加入3ml含250ppm卡那黴素的LB抗性培養基，然後在37°C搖床上培養16-18小時。 按照(《分子克隆實驗指南》，J.薩姆布魯克和D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯，科學出版社， 2002)所述抽提質粒，用KpnI和BamHI酶切並電泳檢測，根據插入片段的大小獲得陽性的超表達雙元Ti質粒載體pDS1301-CHR729-l ；4)將帶CHR7^幹涉片段的TA克隆用SpeI和McI酶切，回收目標條帶，與 SpeI和SacI酶切的質粒pDS1301-CHR729_l連接，依據2),3)步得到抑制表達載體 PDS1301-CHR729-2 ；5)把新構建的抑制表達載體pDS1301-CHR7^_2通過電轉化的方法(參考文獻和使用的電壓參數如上所述)導入農桿菌EHA105(購自澳大利亞CAMBIA實驗室)菌株中。轉化後的菌株命名為TR-CHR729。6)將TR-CHR729向水稻受體品種「中花11」轉化，轉化方法參照Hiei等人報導 StJ Tj (Hiei Efficienttransformation of rice (Oryza sativa L. )mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of theT-DNA. Plant J,1994, 6:271-282.)進行。所獲得的TO代轉基因植株命名為ER-n，其中η = 1，2，3…代表轉基因的不同家系。7)為了檢測轉基因植株中目標基因的表達量，申請人採用Northern-blot的方法對轉基因TO植株進行了表達分析。實驗所用的總RNA來自分櫱期的水稻葉片，RNA抽提用試劑是hvitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見試劑盒說明書)；Northern轉膜上樣量為15-20yg，探針標記採用隨機引物標記的方法，所使用的同位素標記物為 α -32P-Dctp,膜在雜交管中先預雜交3個小時左右，然後加入同位素標記的探針，繼續雜交12個小時；雜交結束後，用2XSSC，0. 十二烷基硫酸鈉(SDQ常溫下將雜交膜漂洗10 分鐘，然後用同樣的洗膜液在65°C漂洗，每次兩分鐘，直到信號值合適為止；洗完膜以後將膜置於乾淨的濾紙晾乾，用保鮮膜包好，然後用磷屏(PhosphorimaghFUJI，日本)壓片4-6 小時最後用FUJIFILMFLA5100掃描讀取結果。在本實施例中，遺傳轉化(轉基因植株獲得)採用農桿菌介導的遺傳轉化方法 (文獻參見Hiei 等，Eff icienttransformation of rice (Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA. Plant J，1994， 6 :271-282)報導的主要步驟，培養基以及使用的試劑主要參照華中農業大學授權專利(專利號ZL200710053552.9，發明的名稱水稻廣親和基因S5的分離克隆及應用；專利
公開日
2008年6月18日；
發明者劉登念, 周道繡, 胡永峰 申請人:華中農業大學