含有複合菌劑的土壤調理劑的生產方法與流程

2024-04-04 10:10:05

本發明涉及一種含複合菌劑的土壤調理劑的生產方法。

背景技術：

海藻肥料以天然海藻為原料，經過特殊生化工藝處理，提取並保留海藻天然活性成分，精煉濃縮而形成的一種新型有機肥料。海藻肥料具有提高作物產量和品質，抵抗病蟲害及不良環境以及改良土壤保持水土的功效，其應用於農業生產有巨大的市場需求和良好的發展前景。但是，要保障海藻肥料的質量，就必須把握好海藻原料和提取工藝兩個關鍵環節。

首先，海藻肥料質量的優劣取決於所用的原料。目前，海藻肥生產企業所用的原料主要以褐藻為主，包括泡葉藻、昆布、海帶、馬尾藻等。其他藻類如墨角藻、滸苔、石蓴、卡帕藻等也有少數企業在用。國外海藻肥企業絕大多數使用褐藻為原料，其中尤以泡葉藻應用最為廣泛如Seasol、Maxicrop等知名品牌，實際作用效果也表明泡葉藻是優質的海藻原料。但是，我國沿海沒有泡葉藻分布，國內企業採用的原料種類繁雜，品質參差不一，造成海藻肥產品質量良莠不齊，甚至有些廠家打著「海藻肥」的幌子，直接勾兌褐藻酸，黃腐酸、氮磷鉀等冒充海藻肥，影響了海藻肥質量，擾亂了海藻肥市場。

其次，決定海藻肥質量的第二個因素是提取工藝。不同的提取工藝對海藻肥活性成分的種類和含量影響巨大。目前，海藻活性成分的提取方法主要有化學法、物理法以及生物法。化學法主要是利用酸、鹼及有機溶劑處理海藻細胞，使細胞消解或內源物質增溶，該方法操作簡單，容易實現，也是國內外絕大多數海藻肥生產企業採用的方法。但是，化學試劑對海藻細胞內的活性物質成分的破壞是相當大的，並且殘留的有機試劑對環境也是潛在的危害。物理法的原理是控制壓力，溫度等物理環境條件，利用機械力使海藻細胞破碎，內容物釋放。該方法雖然工藝清潔、環境友好，但是對於儀器設備的要求嚴苛，反應條件變化劇烈，成本較高，難以實現大規模生產。生物法包括酶法降解和微生物發酵兩種方法，其主要原理是破壞海藻細胞壁結構並降解大分子物質為植物容易吸收利用的小分子物質，該方法反應溫和，產物多元化，整個生產過程安全環保無汙染，是理想的海藻肥生產方法。

利用微生物發酵法生產海藻肥料的研究相對較少，僅有的幾例研究是選用多種微生物對海藻原料進行類似堆肥發酵或好氧發酵處理，存在發酵過程可控性差，發酵周期長，目標產物不明確等問題，難以滿足工業化生產要求的統一，穩定，可控的標準，產品的質量難以保障。

針對農業用微生物的評價指標主要包括菌劑的純度和單位質量中的菌劑數量。因此，作為現有技術的菌劑製備方法一般是：在微生物適宜生存的溫度和pH條件下進行一次發酵工藝，相當於溫室培養。

由於目前土壤板結酸化嚴重，外界氣溫變化無常，溫室培養的微生物菌劑直接投放到土壤中，因不能適應惡劣的土壤環境造成大量死亡，即使有少量存活因無法形成種群效應，也無法發揮微生物菌劑的效果。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是，提供一種含有複合菌劑的土壤調理劑的生產方法，第一、採用性能優良的用於降解褐藻酸的巨大芽孢桿菌和嗜糖芽孢桿菌降解海藻，並模擬土壤自然生態環境，使發酵後的複合菌在投入土壤後，能很快適應環境，確保存活率；第二、提供利用所述巨大芽孢桿菌和嗜糖芽孢桿菌製備含有海藻活性提取物土壤調理劑的生產方法，該方法發酵過程穩定可控，發酵周期短，產物功效顯著，適於規模化生產。

為了解決上述技術問題，本發明採用以下技術方案：

一種含有複合菌劑的土壤調理劑的生產方法，其特徵在於按照以下步驟進行：

將牡蠣殼粉、麥飯石粉、複合菌劑按照質量比10～80:10～80:1～60混勻後造粒，得到含有複合菌劑的土壤調理劑；

其中的複合菌劑按照以下步驟製備而成：

1)、製備海藻粉末：將烘乾後的海藻磨成粉末；

2)、製備產品A：海藻粉末與水按照質量比1～10:100裝入發酵罐中，在100～150℃條件下滅菌15～35min，得到產品A；

並製備種子液：將巨大芽孢桿菌和嗜糖芽孢桿菌分別接種至液體培養基培養20～30小時；

兩種菌與培養基之間的體積比均為1～10:100；

3)、製備產品B：將兩種種子液按照體力比1～5：1～5混合後作為混合種子液加入到產品A中得到產品B，其中混合種子液與產品A的質量比為1～10:100；

4)、製備產品C：在溫度為20℃～40℃，pH5～9的條件下對產品B進行發酵，發酵時間為6～10天，得到產品C；

5)、製備產品D：調整產品C的pH至5.0～6.0，溫度至3～10℃，保存3h～72h，得到產品D；

6)、製備產品E:調整產品D的溫度至20℃～40℃，pH至5～9，然後補充混合種子液，補充的混合種子液與產品D的質量比為1～10:100，保存3h～72h，得到產品E；

7)、製備產品F：調整產品E的pH至5.0～6.0，溫度至3～10℃，保存3h～72h，得到產品F；

8)、製備產品G：調整產品F的溫度至20℃～40℃，pH至5～9，然後補充混合種子液，補充的混合種子液與產品F的質量比為1～10:100，保存3h～72h，得到產品G；

9)、製備複合菌劑：將產品G風乾後得到複合菌劑。

所述液體培養基按照以下質量比配成：海藻酸鈉5份、硫酸銨5份、硫酸鎂1份、磷酸氫二鉀2份、硫酸亞鐵0.01份、瓊脂20份和蒸餾水1000份。

步驟2)所述海藻粉末和水的質量比為4:100；滅菌溫度115℃，滅菌時間25min；製備種子液時，巨大芽孢桿菌和嗜糖芽孢桿菌分別接種至液體培養基中，培養22小時，得到種子液1和種子液2，將兩種種子液按照一定的體積比混合後與培養基的體積比例均為5:100；步驟5)和步驟7)中，溫度為5℃，保存時間為12h。

步驟4)、步驟6)和步驟8)中，溫度為25℃，pH為6.5～7.0；步驟4)發酵時間為8天；步驟6)和步驟8)保存時間為12h；步驟6)中補充的混合種子液與產品D的質量比以及步驟8)中補充的混合種子液與產品F的質量比均為5:100。

步驟5)、步驟6)步驟7)和步驟8)中，調整溫度均為每小時調整3℃。

所述海藻是指鼠尾藻，銅藻和馬尾藻中的一種或任意比例的兩種以上。

所述的巨大芽孢桿菌是巨大芽孢桿菌YIC～BM1，保藏號為CGMCC No.12155；所述的巨大芽孢桿菌是巨大芽孢桿菌YIC～BM1，保藏號為CGMCC No.12156。

發明具有以下有益技術效果：

巨大芽孢桿菌和嗜糖芽孢桿菌具有降解褐藻酸的能力，一方面能夠降解褐藻酸生成小分子量的褐藻寡糖等易於植物吸收利用的營養成分；另一方面破壞海藻細胞壁結構促使海藻體內更多營養物質得以釋放。利用該菌株發酵處理銅藻、鼠尾藻等馬尾藻屬海藻原料，發酵一定天數後在發酵液中可檢測到分子量在4000Da以下、聚合度為2-20的褐藻寡糖，以此發酵液作為海藻肥母液，直接或者復配N、P、K，微量元素，胺基酸，有機質等有效成分用於農作物生長。肥效實驗表明，利用該方法獲得發酵液能夠明顯促進植物根系生長，改良土壤微環境，提高作物產量。

本發明還具有以下特點：

1、採用本發明得到的海洋來源的巨大芽孢桿菌YIC～BM1和嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3對海藻發酵，發酵過程穩定可控，發酵周期短，產物功效顯著，適於規模化生產。

2、本發明得到的複合菌具有水溶性好，易於植物吸收利用，同時作為一種重要的信號分子，能夠參與植物的生長調節和誘導抗病過程促進植物的生長，提高植物對不良環境及病蟲害的抵抗力。

3、本發明通過緩慢的溫度調節，使複合菌適應溫度的變化，避免溫度變化過快，複合菌不能適應而大量死亡。

4、本發明得到的複合菌在具有海藻提取物特徵外，還具有較強的環境適應性，在投入到酸化的土壤中及溫度變化無常的環境中，能很快適應環境存活，發揮微生物菌劑的作用。

具體實施方式

下面結合具體實例進一步說明本發明。

實施例1

將洗淨烘乾後的新鮮鼠尾藻磨成50～60目粉末；

海藻粉末與水按照質量比2:100裝入發酵罐中，在115℃條件下滅菌30min，得到產品A；並製備種子液：將嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3和巨大芽胞桿菌YIC～BM1分別接種至液體培養基培養20小時；所述嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3的保藏號為CGMCC No.12155,所述的巨大芽孢桿菌是巨大芽孢桿菌YIC～BM1，保藏號為CGMCC No.12156；所述液體培養基為：海藻酸鈉5g、硫酸銨5g、硫酸鎂1g、磷酸氫二鉀2g、硫酸亞鐵0.01g、瓊脂20g和蒸餾水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3和培養基的體積比例為2:100,巨大芽胞桿菌YIC～BM1和培養基的體積比為1:100。將兩種種子液按照體積比1:1混合作為混合種子液加入到產品A中，混合種子液與產品A的質量比為1:100，得到產品B；在溫度為20℃，pH5.5～6.0的條件下對產品B進行發酵，發酵時間為7天，得到產品C；調整產品C的pH至5.0～6.0，並以每小時20℃的溫度變化調整溫度至5℃，保存24h，得到產品D；以每小時20℃的溫度變化調整產品D的溫度至20℃，pH至5.5～6.0，然後補充混合種子液，補充的混合種子液與產品D的質量比為1:100，保存24h，得到產品E；調整產品E的pH至5.0～6.0，並以每小時20℃的溫度變化調整溫度至5℃，保存24h，得到產品F；

以每小時20℃的溫度變化調整產品F的溫度至20℃，pH至5.5～6.0，然後補充混合種子液，補充的混合種子液與產品F的質量比為1:100，保存24h，得到產品G；將產品G風乾後得到複合菌菌劑；將牡蠣殼粉、麥飯石粉、複合菌劑按照質量比80:10:10混勻後造粒，得到含有複合菌劑的土壤調理劑。

實施例2

將洗淨烘乾後的新鮮銅藻和新鮮馬尾藻按照質量比1:1復配，磨成50～60目粉末；

海藻粉末與水按照質量比4:100裝入發酵罐中，在115℃條件下滅菌25min，得到產品A；並製備種子液：將嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3和巨大芽胞桿菌YIC～BM1分別接種至液體培養基培養22小時；所述嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3的保藏號為CGMCC No.12155，所述的巨大芽孢桿菌是巨大芽孢桿菌YIC～BM1，保藏號為CGMCC No.12156；所述液體培養基為：海藻酸鈉5g、硫酸銨5g、硫酸鎂1g、磷酸氫二鉀2g、硫酸亞鐵0.01g、瓊脂20g和蒸餾水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3和培養基的體積比例為5:100，巨大芽胞桿菌YIC～BM1和培養基的體積比為2:100。將兩種種子液按照體積比1:1混合作為混合種子液加入到產品A中，混合種子液與產品A的質量比為5:100，得到產品B；在溫度為25℃，pH6.5～7.0的條件下對產品B進行發酵，發酵時間為8天，得到產品C；調整產品C的pH至5.0～6.0，並以每小時3℃的溫度變化調整溫度至5℃，保存12h，得到產品D；以每小時3℃的溫度變化調整產品D的溫度至25℃，pH至6.5～7.0，然後混合補充種子液，補充的混合種子液與產品D的質量比為5:100，保存12h，得到產品E；調整產品E的pH至5.0～6.0，並以每小時3℃的溫度變化調整溫度至5℃，保存12h，得到產品F；

以每小時3℃的溫度變化調整產品F的溫度至25℃，pH至6.5～7.0，然後補充混合種子液，補充的混合種子液與產品F的質量比為5:100，保存12h，得到產品G；將產品G風乾後得到含複合菌劑；將牡蠣殼粉、麥飯石粉、複合菌劑按照質量比80:10:10混勻後造粒，得到含有複合菌劑的土壤調理劑。

實施例3

將洗淨烘乾後的新鮮馬尾藻磨成50～60目粉末；

海藻粉末與水按照質量比6:100裝入發酵罐中，在125℃條件下滅菌35min，得到產品A；並製備種子液：將嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3和巨大芽胞桿菌YIC～BM1分別接種至液體培養基培養24小時；所述嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3的保藏號為CGMCC No.12155，所述的巨大芽孢桿菌是巨大芽孢桿菌YIC～BM1，保藏號為CGMCC No.12156；所述液體培養基為：海藻酸鈉5g、硫酸銨5g、硫酸鎂1g、磷酸氫二鉀2g、硫酸亞鐵0.01g、瓊脂20g和蒸餾水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3和培養基的體積比例為8:100，巨大芽胞桿菌YIC～BM1和培養基的體積比為2:100。將兩種種子液按照體積比2:3混合作為混合種子液加入到產品A中，混合種子液與產品A的質量比為4:100，得到產品B；在溫度為30℃，pH7～7.5的條件下對產品B進行發酵，發酵時間為9天，得到產品C；調整產品C的pH至5.0～6.0，並以每小時1℃的溫度變化調整溫度至5℃，保存18h，得到產品D；以每小時8℃的溫度變化調整產品D的溫度至30℃，pH至7～7.5，然後混合補充種子液，補充的混合種子液與產品D的質量比為4:100，保存18h，得到產品E；調整產品E的pH至5.0～6.0，並以每小時1℃的溫度變化調整溫度至5℃，保存18h，得到產品F；

以每小時8℃的溫度變化調整產品F的溫度至30℃，pH至7.0～7.5，然後補充混合種子液，補充的混合種子液與產品F的質量比為4:100，保存18h，得到產品G；將產品G風乾後得到複合菌劑；將牡蠣殼粉、麥飯石粉、複合菌劑按照質量比80:10:10混勻後造粒，得到含有複合菌劑的土壤調理劑。

實施例4

將洗淨烘乾後的新鮮馬尾藻磨成50～60目粉末；

海藻粉末與水按照質量比9:100裝入發酵罐中，在140℃條件下滅菌15min，得到產品A；並製備種子液：將嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3和巨大芽胞桿菌YIC～BM1分別接種至液體培養基培養20小時；所述嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3的保藏號為CGMCC No.12155,所述的巨大芽孢桿菌是巨大芽孢桿菌YIC～BM1，保藏號為CGMCC No.12156；所述液體培養基為：海藻酸鈉5g、硫酸銨5g、硫酸鎂1g、磷酸氫二鉀2g、硫酸亞鐵0.01g、瓊脂20g和蒸餾水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；巨大芽胞桿菌YIC～BM1和培養基的體積比為5:100,嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3和培養基的體積比例為5:100。將兩種種子液按照體積比1:1混合作為混合種子液加入到產品A中，混合種子液與產品A的質量比為8:100，得到產品B；在溫度為35℃，pH6.5～7.0的條件下對產品B進行發酵，發酵時間為9天得到產品C；調整產品C的pH至5.0～6.0，並以每小時3℃的溫度變化調整溫度至5℃，保存12h，得到產品D；以每小時3℃的溫度變化調整產品D的溫度至35℃，pH至6.5～7.0，然後補充混合種子液，混合補充的種子液與產品D的質量比為8:100，保存12h，得到產品E；調整產品E的pH至5.0～6.0，並以每小時3℃的溫度變化調整溫度至5℃，保存12h，得到產品F；

以每小時3℃的溫度變化調整產品F的溫度至35℃，pH至6.5～7.0，然後補充混合種子液，補充的混合種子液與產品F的質量比為8:100，保存12h，得到產品G；將產品G風乾後得到複合菌劑；將牡蠣殼粉、麥飯石粉、複合菌劑按照質量比80:10:10勻後造粒，得到含有複合菌劑的土壤調理劑。

對比例1

不調節發酵過程中的溫度和pH值，保持環境原有的溫度和物料本身的pH值，其他的條件及物料配比與實施例2一致，操作步驟同實施例2。

對比例2

不通過發酵，不添加菌劑，以海藻提取物替代微生物菌劑，將牡蠣殼粉、麥飯石粉、複合菌劑按照質量比80:10:10混勻後造粒，得到含有複合菌劑的土壤調理劑。

所述的海藻提取物為不通過發酵工藝，通過浸泡溶解的方式從海藻中提取的可溶性有機成分。

產品檢測：按照企業標準Q/370602SDF017-2015對產品各項指標進行檢測，檢測結果見表1。

表1：本發明實施例及對比例的質量檢測結果

註：有效活菌指的是本發明採用的複合菌。

以上結果表明，本發明生產的土壤調理劑各項指標均高於企業標準，而且經過發酵處理，調理劑中雜菌率明顯降低，本發明採用的發酵工藝可以大幅提高產品中的有效活菌數，在同類產品中優勢明顯。

將本發明的實施例和對比例相關土壤調理劑施於蘋果種植地塊，畝用量為100kg。種植期為1年，土壤性狀具體性能指標見表2。

表2：土壤改良後的各項性能指標

註：有效活菌指的是本發明採用的複合菌。

結果表明：本發明採用的複合菌種在土壤中存活且生長，土壤性能得到明顯改善，通氣孔隙度為14.2％-15.4％，土壤pH 6.6-6.8,土壤容重1.41-1.45g/cm3，重金屬含量有效降低。

施用本發明中實施例和對比例產品對蘋果作物的影響情況，與施用市場購買的菌肥類產品對比，肥效結果見表4。

本發明所述巨大芽孢桿菌YIC～BM1的保藏號為CGMCC No.12156；保藏單位名稱是：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址是：北京市朝陽區北辰西路1號院3號；保藏日期：2016年3月2日；拉丁文分類命名為：Bacillus megaterium。

所述巨大芽孢桿菌YIC～BM1的生物特性如下：

YIC～BM1菌株在纖維素培養基平板上生長48h後，菌落圓形，白色，表面平整。顯微鏡觀察菌株為革蘭氏陽性，杆狀，能運動，產芽孢。生長溫度範圍20～40℃，PH範圍6-10，NaCl濃度範圍0～20％，菌株最適生長溫度37℃，最適生長pH 7.5。觸酶，氧化酶，半乳糖苷酶陽性，吲哚，VP實驗陰性，不還原硝酸；能夠利用葡萄糖，甘露糖，乳糖，棉子糖，蔗糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇，山梨醇。根據其生理生化特徵，基因序列及系統發育樹信息，將該菌株鑑定為巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium。

本發明所述嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3的保藏號為CGMCC No.12155；保藏單位名稱是：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址是：北京市朝陽區北辰西路1號院3號；保藏日期：2016年3月2日；拉丁文分類命名為：Bacillus halosaccharovorans。

所述嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3的生物特性如下：

YIC～Alg3菌株在褐藻酸唯一碳源平板上生長48h後，菌落不規則，淡黃色，中間不透明，邊緣半透明，表面褶皺。顯微鏡觀察菌株為杆狀，在末端或近末端可產生芽孢，革蘭氏陽性，能運動，生長後期菌體易聚集成團。生長溫度範圍20～45℃，PH範圍6～9，NaCl濃度範圍0～15％，菌株最適生長溫度37℃，最適生長pH 7.5。觸酶，氧化酶，VP試驗陽性，能夠利用葡萄糖，甘露糖，甘露醇，果糖，乳糖，半乳糖，澱粉；不能利用山梨醇，纖維素。根據其生理生化特徵，基因序列及系統發育樹信息，將該菌株鑑定為嗜糖芽孢桿菌Bacillus halosaccharovorans。

註：+表示可以利用，～表示不能利用。