延長腦細胞壽命的深海魚提取物的製備方法與流程
2024-04-04 02:06:05 2
本發明涉及保健品及藥品領域，具體是一種延長腦細胞壽命的深海魚提取物的製備方法。
背景技術：
多肽從二十世紀初才開始受到關注，研究發現它區別於蛋白質區別於胺基酸，具有藥物的作用。到了上個世紀九十年代才有了長足發展，在不斷更新的技術指導下，多肽的應用範圍越來越廣，作用也越來越大，這才邁進了我們的生活，在我們生活中佔據的份額越來越大，多肽類藥物高效低毒特異性強具有區別於其他藥物的特有優勢，正不斷影響著我們的生活。而且多肽潛力巨大，是生物科學發展的又一大突破和發展方向。
天然存在的海洋活性多肽由於在生物體中含量低，而且提取困難，難以實現大量生產供給所需，化學人工合成多肽成本昂貴。所以，人們更多地把目光投向開發蛋白酶解產物獲得活性多肽這條途徑上來。由於海洋生物生存的環境與陸地生物完全不同，如高壓、低溫、高溫和高鹽等極端環境，為了適應這些極端的海洋生物環境，海洋生物蛋白質無論胺基酸的組成還是胺基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，同時，海洋生物蛋白資源無論在種類和數量上都遠遠大於陸地蛋白資源，並且未得到很好的開發。種類繁多的海洋蛋白胺基酸序列中，潛在著許多具有生物活性的胺基酸序列，用特異的蛋白酶水解，就釋放出有活性的肽段。海洋生物蛋白資源是21世紀人類重要的蛋白類食物及生物活性物質的重要來源。我國目前的海洋生物蛋白資源總量在世界各國名列前茅，但我國目前的蛋白類水產品中，除一部分直接食用外，大部分通過簡單的加工技術製成食品進入市場，加工技術落後，產品結構單一，產品的附加值低，使得產品在國際市場上的競爭力較差。因此，我國急需對海洋生物蛋白資源進行優化利用和高值化加工。
腦細胞是構成腦的多種細胞的通稱。腦細胞主要包括神經元和神經膠質細胞。神經元細胞高度分化，不可再生，科學研究顯示，人到40歲以後腦細胞數目會逐漸減少，一般人到死亡時腦細胞會消耗掉10%左右。大腦掌管語言、思維記憶及計算等活動，小腦掌握著人體的動作與協調能力，腦細胞的減少會導致人出現記憶力下降，智力減退等症狀。
現有技術如授權公告號為cn101503728b的中國發明專利，公開了一種從青佔魚魚骨中提取複合多肽液的方法。包括以下步驟：將青佔魚魚骨洗淨、絞碎，用去離子水浸泡；過濾除去去離子水，將魚骨按1∶5-1∶10的質量比例的加入水，按魚骨質量的1％-5％量按動物蛋白水解酶和中性蛋白酶的質量比為3∶1-1∶3的比例加入酶，調節ph在5.5-8.5，然後在45-70℃溫度下酶解；將上述酶解液90-100℃加熱，以使酶失活；用亞麻布過濾，濾液在2000-4000rpm離心10-15min，得到的上清液通過gpc凝膠淨化，再過濾除菌得到複合多肽液。上述製備方法製備的到的複合多肽純度不高，且在製備過程中損失量大，提取率不高。蛋白酶均採用陸地蛋白酶，不能對海洋蛋白進行很好的開發。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種製備方法簡單，重現性高的延長腦細胞壽命的深海魚提取物的製備方法，製備得到的深海魚提取物純度高，可有效延長人體腦細胞的壽命。
本發明針對背景技術中提到的問題，採取的技術方案為：延長腦細胞壽命的深海魚提取物的製備方法，包括分步酶解、微濾、二次超濾並納濾、大孔樹脂吸附洗脫和冷凍乾燥。得到的深海魚提取物可抑制內源性核酸內切酶的產生，延緩細胞染色體的dna降解，從而延緩神經元細胞中凋亡程序的表達，有效延長其壽命。分步酶解步驟為在深海魚魚糜中加入條斑紫菜蛋白酶和活性短肽酶解，調節ph後加入風味蛋白酶酶解，得到酶解液。深海魚蛋白上有大量條斑紫菜蛋白酶的酶切位點，酶解後可得到長短不一的肽鏈，再用風味蛋白酶酶解可得到能有效延長腦細胞壽命的複合多肽。採用其他蛋白酶分步酶解不能得到上述複合多肽。
深海魚魚糜中加入20~30倍體積水，條斑紫菜蛋白酶的加入量為5~8wt‰，酶解溫度25~35℃，ph為7.0~9.0，酶解時間為30~40min，酶解結束後滅酶。上述酶解條件下，條斑紫菜蛋白酶的酶解效率高又不會造成資源浪費。
風味蛋白酶加入量為1~3wt﹪，酶解ph為6.0~7.0，酶解溫度為52~60℃，酶解時間為15~25min，酶解結束後滅酶，過濾取濾液。酶解結束後滅酶。上述酶解條件下，風味蛋白酶的酶解效率高又不會造成資源浪費。
活性短肽的加入量為條斑紫菜蛋白酶質量的10~20﹪，胺基酸序列為scasvckarcracrrgcgsvfcrclrc。上述活性短肽可通過範德華力和靜電作用來改變條斑紫菜蛋白酶的三級結構，使條斑紫菜蛋白酶的酶解活力得到明顯提高。
微濾步驟為將濾液於20~30℃，0.14~0.27mpa條件下經0.2~0.4μm微濾膜微濾。為了防止大分子蛋白及其他大分子雜質汙染超濾膜，需將濾液進行微濾處理。
二次超濾並納濾步驟為先採用截留相對分子質量20~30kd的膜超濾，再採用截留相對分子質量1~3kd的膜超濾，最後將濾過液進行納濾除鹽。為了防止膜孔堵塞或膜損害，先採用大孔超濾膜進行超濾，再採用小孔超濾膜超濾，有效去除分子量大於1~3kd的雜質。納濾可較徹底的去除溶液中的無機鹽及分子量小於200da的雜質，對複合多肽進一步進行純化。
二次超濾的條件分別為，超濾溫度為20~30℃，操作壓力為0.14~0.25mpa，超濾時間為40~70min；超濾溫度為20~30℃，操作壓力為0.6~1mpa，超濾時間為1~2h。上述條件下，超濾過程中不會出現過厚的凝膠層，超濾速度也較為理想。
大孔樹脂吸附洗脫步驟為將納濾後的液體濃縮，上樣濃度為0.1~0.3g/ml，上樣流速為0.4~0.6ml/min，洗脫劑體積為7.7~7.9bv，洗脫劑為蒸餾水，洗脫流速為0.8~1.4ml/min。收集最後2/3的洗脫液並低溫濃縮。大孔樹脂對複合多肽進行吸附和解吸附，平衡吸附量可達14.23mg/g左右，靜態吸附率達到90.15%左右和靜態解吸率達到86.54%左右，可有效將複合多肽與其他雜質分開。
冷凍乾燥步驟為：預凍：-35~-45℃預凍3~5h；冷凍乾燥：-45~-35℃，3~5pa冷凍乾燥5~7h，-10~-5℃，10~20pa冷凍乾燥2~3h；升華乾燥：10~15℃，50~60pa升華乾燥3~4h；解析乾燥:7~14℃，3~5pa解析乾燥2~4h，得到延長腦細胞壽命的深海魚提取物。凍幹整個過程都在程序的控制下，操作簡單，工序簡潔，自動化程度高，減少了人力、物力。低溫下乾燥能更好地保留複合多肽的活性；低壓下乾燥，複合多肽不易氧化，療效更好；凍結時複合多肽形成「骨架」，乾燥後保存原形，為多孔疏鬆結構且顏色基本不變，產品外觀更加優良；復水性好，凍幹複合多肽能迅速吸水還原成凍幹前狀態，使用方便；脫水徹底，複合多肽中含水量低，一般在1%-3%，且有利於長途運輸和長期保存。
作為優選，深海魚為秋刀魚或馬面魚或海鱸或金槍魚或鯪魚或鱈魚。
與現有技術相比，本發明的優點在於：1）本發明製備方法簡單，每一步均有詳細數據，重現性強，適合大規模生產；2）深海魚蛋白上有大量條斑紫菜蛋白酶的酶切位點，酶解後可得到長短不一的肽鏈，再用風味蛋白酶酶解可得到能有效延長腦細胞壽命的深海魚提取物。得到的深海魚提取物可抑制內源性核酸內切酶的產生，延緩細胞染色體的dna降解，從而延緩神經元細胞中凋亡程序的表達，有效延長其壽命；3）斑紫菜蛋白酶酶解時添加了胺基酸序列為scasvckarcracrrgcgsvfcrclrc的活性短肽。上述活性短肽可通過範德華力和靜電作用來改變條斑紫菜蛋白酶的三級結構，使條斑紫菜蛋白酶的酶解活力得到明顯提高。
具體實施例
下面通過實施例對本發明方案作進一步說明：
實施例1：
延長腦細胞壽命的深海魚提取物的製備方法，包括分步酶解、微濾、二次超濾並納濾、大孔樹脂吸附洗脫和冷凍乾燥。得到的深海魚提取物可抑制內源性核酸內切酶的產生，延緩細胞染色體的dna降解，從而延緩神經元細胞中凋亡程序的表達，有效延長其壽命。分步酶解步驟為在秋刀魚魚糜中加入條斑紫菜蛋白酶和活性短肽酶解，調節ph後加入風味蛋白酶酶解，得到酶解液。秋刀魚蛋白上有大量條斑紫菜蛋白酶的酶切位點，酶解後可得到長短不一的肽鏈，再用風味蛋白酶酶解可得到能有效延長腦細胞壽命的複合多肽。採用其他蛋白酶分步酶解不能得到上述複合多肽。
秋刀魚魚糜中加入26倍體積水，條斑紫菜蛋白酶的加入量為7wt‰，酶解溫度30℃，ph為8.0，酶解時間為32min，酶解結束後滅酶。上述酶解條件下，條斑紫菜蛋白酶的酶解效率高又不會造成資源浪費。
風味蛋白酶加入量為2wt﹪，酶解ph為6.5，酶解溫度為55℃，酶解時間為18min，酶解結束後滅酶，過濾取濾液。酶解結束後滅酶。上述酶解條件下，風味蛋白酶的酶解效率高又不會造成資源浪費。
活性短肽的加入量為條斑紫菜蛋白酶質量的13﹪，胺基酸序列為scasvckarcracrrgcgsvfcrclrc。上述活性短肽可通過範德華力和靜電作用來改變條斑紫菜蛋白酶的三級結構，使條斑紫菜蛋白酶的酶解活力得到明顯提高。
微濾步驟為將濾液於25℃，0.2mpa條件下經0.3μm微濾膜微濾。為了防止大分子蛋白及其他大分子雜質汙染超濾膜，需將濾液進行微濾處理。
二次超濾並納濾步驟為先採用截留相對分子質量20kd的膜超濾，再採用截留相對分子質量2kd的膜超濾，最後將濾過液進行納濾除鹽。為了防止膜孔堵塞或膜損害，先採用大孔超濾膜進行超濾，再採用小孔超濾膜超濾，有效去除分子量大於2kd的雜質。納濾可較徹底的去除溶液中的無機鹽及分子量小於200da的雜質，對複合多肽進一步進行純化。
二次超濾的條件分別為，超濾溫度為25℃，操作壓力為0.21mpa，超濾時間為60min；超濾溫度為25℃，操作壓力為0.8mpa，超濾時間為1h。上述條件下，超濾過程中不會出現過厚的凝膠層，超濾速度也較為理想。
大孔樹脂吸附洗脫步驟為將納濾後的液體濃縮，上樣濃度為0.2g/ml，上樣流速為0.5ml/min，洗脫劑體積為7.8bv，洗脫劑為蒸餾水，洗脫流速為1ml/min。收集最後2/3的洗脫液並低溫濃縮。大孔樹脂對複合多肽進行吸附和解吸附，平衡吸附量可達14.54mg/g，靜態吸附率達到90.21%和靜態解吸率達到86.55%，可有效將複合多肽與其他雜質分開。
冷凍乾燥步驟為：預凍：-40℃預凍5h；冷凍乾燥：-40℃，4pa冷凍乾燥6h，-7℃，16pa冷凍乾燥2.6h；升華乾燥：13℃，57pa升華乾燥3h；解析乾燥:10℃，4pa解析乾燥3h，得到延長腦細胞壽命的秋刀魚提取物。凍幹整個過程都在程序的控制下，操作簡單，工序簡潔，自動化程度高，減少了人力、物力。低溫下乾燥能更好地保留複合多肽的活性；低壓下乾燥，複合多肽不易氧化，療效更好；凍結時複合多肽形成「骨架」，乾燥後保存原形，為多孔疏鬆結構且顏色基本不變，產品外觀更加優良；復水性好，凍幹複合多肽能迅速吸水還原成凍幹前狀態，使用方便；脫水徹底，複合多肽中含水量低，一般在1%-3%，且有利於長途運輸和長期保存。
實施例2：
延長腦細胞壽命的深海魚提取物的製備方法，包括以下步驟：
1）分步酶解：在鱈魚魚糜中加入25倍體積水，攪拌均勻後加入6wt‰條斑紫菜蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶質量10%的活性短肽酶解。活性短肽的胺基酸序列為scasvckarcracrrgcgsvfcrclrc。酶解溫度30℃，ph為8.0，酶解時間為32min，酶解結束後沸水浴3min滅酶。調節ph後加入3wt﹪風味蛋白酶酶解。酶解ph為6.5，酶解溫度為55℃，酶解時間為18min，酶解結束後沸水浴3min滅酶，得到酶解液；
2）微濾：將濾液於25℃，0.2mpa條件下經0.3μm微濾膜微濾。待濾液微濾至加入量80%時，向截留液中加入適量水，攪拌，繼續微濾，待微濾液收集至體積等於濾液加入量時停止微濾；
3）二次超濾並納濾：先採用截留相對分子質量20kd的膜超濾，超濾溫度為25℃，操作壓力為0.21mpa，超濾時間為60min。再採用截留相對分子質量2kd的膜超濾，超濾溫度為25℃，操作壓力為0.8mpa，超濾時間為1h，最後將濾過液進行納濾除鹽；
4）大孔樹脂吸附洗脫：將hpd100型非極性大孔樹脂置於燒杯中，用95%乙醇浸泡24h，使其充分膨脹，抽濾後加入95%乙醇洗滌大孔樹脂至洗滌液加適量蒸餾水無白色渾濁現象，再用蒸餾水洗淨乙醇，真空抽濾備用。將納濾後的液體濃縮，上樣濃度為0.2g/ml，上樣流速為0.5ml/min，洗脫劑體積為7.8bv，洗脫劑為蒸餾水，洗脫流速為1ml/min。收集最後2/3的洗脫液並低溫濃縮；
5）冷凍乾燥：預凍：-40℃預凍5h；冷凍乾燥：-40℃，4pa冷凍乾燥6h，-7℃，16pa冷凍乾燥2.6h；升華乾燥：13℃，57pa升華乾燥3h；解析乾燥:10℃，4pa解析乾燥3h，得到延長腦細胞壽命的鱈魚提取物。得到的鱈魚提取物可抑制內源性核酸內切酶的產生，延緩細胞染色體的dna降解，從而延緩神經元細胞中凋亡程序的表達，有效延長其壽命。
實施例3：
延長腦細胞壽命的深海魚提取物的製備方法，包括以下步驟：
1）分步酶解：在鱈魚魚糜中加入27倍體積水，攪拌均勻後加入7wt‰條斑紫菜蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶質量15%的活性短肽酶解。活性短肽的胺基酸序列為scasvckarcracrrgcgsvfcrclrc。酶解溫度30℃，ph為8.0，酶解時間為32min，酶解結束後沸水浴3min滅酶。調節ph後加入3wt﹪風味蛋白酶酶解。酶解ph為6.5，酶解溫度為55℃，酶解時間為18min，酶解結束後沸水浴3min滅酶，得到酶解液；
2）微濾：將濾液於25℃，0.218mpa條件下經0.3μm微濾膜微濾。待濾液微濾至加入量80%時，向截留液中加入適量水，攪拌，繼續微濾，待微濾液收集至體積等於濾液加入量時停止微濾；
3）二次超濾並納濾：先採用截留相對分子質量20kd的膜超濾，超濾溫度為25℃，操作壓力為0.18mpa，超濾時間為50min。再採用截留相對分子質量1kd的膜超濾，超濾溫度為25℃，操作壓力為0.8mpa，超濾時間為1.8h，最後將濾過液進行納濾除鹽；
4）大孔樹脂吸附洗脫：將hpd100型非極性大孔樹脂置於燒杯中，用95%乙醇浸泡24h，使其充分膨脹，抽濾後加入95%乙醇洗滌大孔樹脂至洗滌液加適量蒸餾水無白色渾濁現象，再用蒸餾水洗淨乙醇，真空抽濾備用。將納濾後的液體濃縮，上樣濃度為0.2g/ml，上樣流速為0.5ml/min，洗脫劑體積為7.9bv，洗脫劑為蒸餾水，洗脫流速為1ml/min。收集最後2/3的洗脫液並低溫濃縮；
5）冷凍乾燥：預凍：-40℃預凍5h；冷凍乾燥：-40℃，4pa冷凍乾燥6h，-7℃，16pa冷凍乾燥2.6h；升華乾燥：13℃，57pa升華乾燥3h；解析乾燥:10℃，4pa解析乾燥3h，得到延長腦細胞壽命的鱈魚提取物。得到的鱈魚提取物可抑制內源性核酸內切酶的產生，延緩細胞染色體的dna降解，從而延緩神經元細胞中凋亡程序的表達，有效延長其壽命。
本發明的操作步驟中的常規操作為本領域技術人員所熟知，在此不進行贅述。
以上所述的實施例對本發明的技術方案進行了詳細說明，應理解的是以上所述僅為本發明的具體實施例，並不用於限制本發明，凡在本發明的原則範圍內所做的任何修改、補充或類似方式替代等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
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延長腦細胞壽命的深海魚提取物的製備方法
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