肝硬化微生物標誌物及應用的製作方法

2024-04-04 06:26:05

肝硬化微生物標誌物及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了肝硬化微生物標誌物及應用。微生物標誌物，選自肝硬化患者組中富集的一種微生物VeillonellaatypicaACS-134-V-Col7a或健康組富集的兩種微生物BacteroidesuniformisATCC8492、Clostridiales中的一種或多種。治療肝硬化的藥物，所述藥物促進或者增加所述的選自健康組富集兩種微生物BacteroidesuniformisATCC8492、Clostridiales中的一種或兩種，和/或抑制或清除所述的選自肝硬化患者組中富集的微生物VeillonellaatypicaACS-134-V-Col7a。針對腸道菌群中的微生物標誌物的相對豐度進行檢測，通過所得到的相對豐度值與預定的cutoff值進行比較。有益微生物組合或者功能性食品，含有選自所述的健康組富集的兩種微生物BacteroidesuniformisATCC8492、Clostridiales中的一種或兩種。檢測肝硬化、監測治療進程，或者生產、篩選藥物的試劑盒，用於檢測所述的微生物標誌物。
【專利說明】肝硬化微生物標誌物及應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程和生物醫藥領域，具體涉及肝硬化的微生物標誌物及其應 用。

【背景技術】
[0002] 肝硬化（Liver cirrhosis)是臨床常見的慢性進行性肝病，由一種或多種病因長 期或反覆作用形成的瀰漫性肝損害。肝硬化是許多肝臟疾病的晚期病變，是由病毒性肝炎、 酒精中毒、營養障礙、膽汁淤積、血吸蟲病、循環障礙等各種原因所致，其特點是肝細胞變性 和壞死。早期肝硬化通過及時防治可以逆轉或不再進展，而晚期將不可逆轉，嚴重影響患者 的生活質量，甚至危及生命。
[0003] 在中國最常見的病因是病毒性肝炎，主要是乙型病毒性肝炎，其次為C型肝炎。而 自發性腹膜炎、肝腹水、肝腎症候群、肝性腦病、食道靜脈曲張、出血、原發性肝癌等這些肝 硬化併發症的危害也是有目共睹的。面對現代如此多的治療手段，卻有很大一部分肝硬化 患者依舊痛苦不堪，每日仍遭受著肉體上的折磨、心理上的恐懼以及精神上的摧殘。
[0004] 肝硬化患者由於門脈高壓，肝臟功能障礙致膽汁分泌異常，解毒能力下降，宿主 抵抗力降低等因素，導致腸道屏蔽功能破壞，微生物環境發生改變，腸道菌群失調。然而， 與肝硬化進程相關的腸道微生物的系統發育及功能成分的變化還不清楚。儘管有些研究 (Garcia et al2004，Wiest et al2012, Bass et al2010)表明腸道微生物的改變在末期肝 硬化併發症中起重要作用（如自發細菌腹膜炎及肝性腦病），以及誘導早期肝臟疾病及促 進肝損傷作用（如酒精性肝病及非酒精性脂肪肝病），腸道菌群與人肝臟病理之間的明確 關聯仍未知。有研究（Yi JH et all999，Paik YH et al2003)表明可能是由於患者腸道細 菌過度繁殖並產生內毒素，抑制腸上皮細胞蛋白質合成，小腸微絨毛出現形態學的改變， 腸細胞質膜異常，細胞支架組織結構發生改變，腸刷狀緣載體位置或細胞骨架上載體錨定 點改變，導致胺基酸和碳水化合物在通過空腸刷狀緣薄膜的運輸過程缺陷，然而其具體機 制有待於進一步的研究。
[0005] 肝硬化及酒精性肝病患者通過16S rRNA測序研究揭示了一個腸道微生物中的類 似實質性的改變（Chen Y et al2011，Yan A W. et al2011)。腸道微生物中系統發育機制怎 樣發生改變尚不清晰。


【發明內容】

[0006] 本發明旨在提供更多肝硬化患者腸道菌群修飾的知識，提供有針對性的微生物標 志物，為早期發現疾病提供一種非侵入性方法。合理有效地應用微生物標誌物，扶持腸道 有益菌（如雙歧桿菌）的生長，抑制腸道潛在致病菌（如腸桿菌科細菌）等，可以阻止腸 道屏障的缺損，改善並恢復腸道微生態結構，對於降低血內毒素水平，減輕肝硬化的臨床 症狀具有重要意義。
[0007] 本發明的目的是提供肝硬化微生物標誌物及應用。
[0008] -種微生物標誌物，選自肝硬化患者組中富集的微生物Veillonella atypica ACS-134-V_Col7a 或健康組富集的兩種微生物 Bacteroides uniformis ATCC8492、 Clostridiales中的一種或多種。富集是指通過失蹤基因找到顯著差異基因，並且同源性大 於95%的基因進行的聚類。
[0009] 所述的微生物標誌物，同時具有選自肝硬化患者組中富集的微生物，以及選自健 康組富集的兩種微生物中的一種或兩種。
[0010] 治療肝硬化的藥物，所述藥物促進或者增加所述的選自健康組富集兩種微生物 Bacteroides uniformis ATCC8492、Clostridiales 中的一種或兩種，和 / 或抑制或清除所 述的選自肝硬化患者組中富集的微生物Veillonella atypica ACS-134-V_Col7a。
[0011] 生產或篩選藥物的方法，所述藥物促進或者增加所述的選自健康組富集兩種微生 物 Bacteroides uniformis ATCC8492、Clostridiales 中的一種或兩種，和 / 或抑制或清除 所述的選自肝硬化患者組中富集的微生物Veillonella atypica ACS-134-V-Col7a。
[0012] 所述的藥物治療或幹預前，檢測對象腸道菌群中是否富集有所述的微生物標誌 物。
[0013] 所述的檢測步驟包括：
[0014] a、從對象糞便中提取DNA樣本；
[0015] b、針對DNA樣本構建測序文庫；
[0016] c、對測序文庫進行高通量測序，獲得測序結果；
[0017] d、根據測序結果，確定所述對象的腸道菌群中是否存在所述的微生物標誌物。
[0018] 所述的步驟d中進一步包括：針對腸道菌群中的微生物標誌物的相對豐度進行檢 測，通過所得到的相對豐度值與預定的cutoff值進行比較。
[0019] 步驟c中，根據測序結果得到基因聚類方法，提出一種宏基因物種（MGS)的方法。
[0020] 有益微生物組合或者功能性食品，含有選自所述的健康組富集的兩種微生物 Bacteroides uniformis ATCC8492、Clostridiales 中的一種或兩種。
[0021] 檢測肝硬化、監測治療進程，或者生產、篩選藥物的試劑盒，用於檢測所述的微生 物標誌物。
[0022] 本發明的有益效果：提供了診斷或治療肝硬化患者，或者易感肝硬化人群的微生 物標誌物，可以有效監測肝硬化的易感人群（包括家族遺傳和外來因素引起）或者發現早 期患者，以及監控肝硬化的治療效果；將該微生物標誌物用於治療肝硬化的藥物，或者生產 或篩選治療肝硬化的藥物方法；提供了利用微生物標誌物的有益微生物組合或者功能性食 品；提供了利用微生物標誌物的試劑盒等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為實驗分析流程示意圖；
[0024] 圖2a、圖2b為宏基因組物種分類學示意圖；
[0025] 2a中中國肝硬化患者及健康人群富集的MGS。一個MGS中的基因，如果通過b 1 astN 與已知的基因組資料庫對比後，若對比上兩條序列的覆蓋度>90%，覆蓋部分的相似度 >95%，那麼就把這個就把這個MGS分類給所比對上的基因組。未達到閥值的MGS，歸類到最 低分類水平，即至少80%的基因與最佳BlastP分類一致；本標準適用於所有更高水平的分 類。
[0026] 2b中58個樣本的分類歸類與丹麥人腸道基因富集相關聯。

【具體實施方式】
[0027] 下面將結合附圖和實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人 員將理解，下列附圖和實施例僅用於說明本發明，而不是對本發明的範圍的限定。根據附圖 和優選實施方案的下列詳細描述，本發明的各種目的和有利方面對於本領域技術人員來說 將變得顯然。在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技 術人員所通常理解的含義。並且，本文中所使用的各種實驗室操作步驟均為相應領域內廣 泛使用的常規步驟。
[0028] 實施例中，我們從98個肝硬化患者、83個健康對照的糞便樣品開展整個腸道菌群 微生物的關聯分析研究描述糞便微生物群落及功能成分特徵。總的來說，我們獲得約860Gb 高質量的測序數據，構建了肝硬化參照基因集。這個基因集包含269萬個基因，36. 1%是之 前未公布的。定量宏基因組分析顯示在大量的病人及健康對照組中，75, 245個基因呈現顯 著差異（fdr〈0. 0001)。一大部分的基因可以歸類為66個代表細菌物種的基因簇，其中肝硬 化患者組中主要富集的是1個MGS(metagenomic species,表3)，健康組中主要富集的是2 個MGS (表2)。實施例的第一階段為發現階段：98個肝硬化患者及83個健康對照組的腸道 微生物成分及功能改變階段；第二階段為驗證階段：25個肝硬化患者及31個健康對照組驗 證第一階段結果的準確性。
[0029] 實施例1 :樣本收集和DNA提取
[0030] 肝硬化患者來自杭州浙江大學第一附屬醫院，匹配健康對照組是志願者，實驗共 採集了 181例糞便樣品，98個中國肝硬化患者的糞便樣品及83個健康中國人的糞便樣品， 其中每個個體的新鮮糞便樣品分成200mg/份，共5份，立即-80°C冰箱冷凍保存。
[0031] 98個中國肝硬化患者的糞便樣品及83個健康中國人的糞便樣品中提取總DNA。苯 酚三氯甲烷處理提取DNA方法提取DNA。
[0032] 實施例2 :構建文庫及測序
[0033] DNA建庫按儀器製造商（Illumina)的操作指南進行。對文庫進行PE2*100bp測 序。Illumina HiSeq2000(Illumina，San Diego，CA)平臺對 181 個樣品的文庫進行測序。 每個樣本平均產生4. 74Gb (sd. ±2. 04Gb)高質量測序結果，總計858Gb測序數據量。
[0034] 參照圖1的實驗流程，鑑定肝硬化的相關微生物標誌物，其中省略的步驟或者細 節為本領域技術人員所熟知，幾個重要步驟介紹如下面幾個實施例所述。
[0035] 實施例3 :生物標誌物的鑑定
[0036] 3. 1測序數據的基本處理
[0037] 獲得第一期的181個樣品的測序數據以後，對其進行過濾，質控按以下標準進行： a)移除大於3個N鹼基的reads ;b)去除低質量（Q20)的N50reads ;c)移除超過10個低 質量（Q2)的鹼基或指定尾部N鹼基數。丟失成對reads的序列被認為是單條reads用於 組裝。
[0038] 3. 2獲得一套肝硬化微生物組基因集
[0039] 宏基因組生物標誌物主體是基因和相對應的功能，因此需要對測序序列進行組裝 和基因預測，去冗餘，構建非冗餘參考基因集。用SOAPdenovo軟體將所有樣品reads組裝成 contigs (組裝片段）。將樣本的未組裝reads合併進行從新（de novo)組裝。終由總reads 數的61. 68%產生440萬contigs (最小片段長度為500bp)。這些contigs總長11. 1Gb, N50長度範圍為1，673?48, 822bp，平均長度為8, 644bp。
[0040] 為了預測181個樣本的每個樣本微生物基因，我們採用MetaHIT人類腸道基因 組研究中的方法。MetaGene程序從預測到13, 371，697個長度大於100bp的開放閱讀框 (ORFs)。預測的 ORFs 總長為 9, 495, 923, 532bp，佔 contigs 總長度的 90. 28%。在 ORFs 中， 1,047,855(54.6% )是完整的基因，869, 808 (45.4% )是不完整的。通過去除多餘ORFs來 建立非冗餘"LC基因集"，定義為配對後超過95 %與90 %配對的短ORFs -致。最終的非冗 餘肝硬化腸道基因集包含2, 668, 468個ORFs，平均長度750bp，42 %的reads可比對到基因 庫。
[0041] 將我們的LC基因集與3個其他腸道微生物基因集對比，MetaHIT，HMP和T2D。比 對時所有基因預測使用相同的標準。MetaHIT庫包含3, 452, 726個基因，HMP含4, 768, 112 個基因，了20含2，148,029個基因。四個基因集的有674，131共有基因。^：、]^七3!111\腿?、 T2D 基因集分別包含 794, 647、1，429, 517、2, 620, 096、623, 570 個 unique 基因。
[0042] 來自LC、T2D、MetaHIT基因庫的基因與非冗餘基因集合併，隨後進行分析。不包 含HMP腸道基因集，因為它包含sanger、454或Illuminal6S序列，除了整個宏基因組數據， 它由對照組健康人群產生，而非患者。庫含5, 382, 817個基因，其中797, 690個為其他三個 基因庫共有。LC基因集中的基因有63. 9%存在於其他一個或兩個基因集中，37. 1%是獨特 (unique)基因。中國人基因在LC基因集和T2D基因集中存在極大的差異。
[0043] 3. 3生物豐度分析
[0044] S0APalign2. 21 用於匹配針對冗餘基因組的 paired-end clean reads，參 數為-r2-m200 -xl000。Reads與冗餘基因組比對，可能被分為兩部分：a)Unique reads (U) :reads只與一個基因組比對；這些基因被定義為unique reads。b)Multiple reads (Μ):如果這些基因組來著同一物種，reads與一個以上的基因組比對；我們將這些 reads定義為unique reads。如果來著不同物種，我們定義為multiple reads。
[0045] 對於物種S，如果豐度為Ab (S)，可能與U特有reads和Μ共享reads相關，評估方 式如下：
[0046] Ab ⑶=Ab ⑶ +Ab (M)
[0047] Ab (U) = U/1
[0048]

【權利要求】
1. 一種微生物標誌物，其特徵在於，選自微生物Veillonella atypica ACS-134-V_Col7a、Bacteroides uniformis ATCC 8492、Clostridiales 中的一種或多種。
2. 根據權利要求1所述的微生物標誌物，其特徵在於，同時具有Veillonella atypica ACS-134-V_Col7a 和選自微生物 Bacteroides uniformis ATCC 8492、Clostridiales 的一 種或兩種。
3. -種治療肝硬化的藥物，其特徵在於，所述藥物促進或者增加 Bacteroides uniformis ATCC 8492、Clostridiales中的一種或兩種，和/或抑制或清除微生物 Veillonella atypica ACS-134_V-Col7a〇
4. 一種生產或篩選藥物的方法，其特徵在於，所述藥物促進或者增加 Bacteroides uniformis ATCC 8492、Clostridiales中的一種或兩種，和/或抑制或清除微生物 Veillonella atypica ACS-134_V-Col7a〇
5. 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的藥物治療或幹預前，檢測對象腸道 菌群中是否富集有如權利要求1或2中所述的微生物標誌物。
6. 根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述的檢測步驟包括： a、 從對象糞便中提取DNA樣本； b、 針對DNA樣本構建測序文庫； c、 對測序文庫進行高通量測序，獲得測序結果； d、 根據測序結果，確定所述對象的腸道菌群中是否存在所述的微生物標誌物。
7. 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述的步驟d中進一步包括：針對腸道 菌群中的微生物標誌物的相對豐度進行檢測，通過所得到的相對豐度值與預定的cutoff 值進行比較。
8. 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述的步驟c中，根據測序結果得到基因 聚類方法，提出一種宏基因物種（MGS)的方法。
9. 一種有益微生物組合或者功能性食品，其特徵在於，含有選自微生物Bacteroides uniformis ATCC 8492、Clostridiales 中的一種或兩種。
10. -種檢測肝硬化、監測治療進程，或者生產、篩選藥物的試劑盒，其特徵在於，用於 檢測如權利要求1中所述的微生物標誌物。
【文檔編號】C12Q1/68GK104195146SQ201410334287
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月15日 優先權日:2014年7月15日
【發明者】李蘭娟, 秦楠 申請人:浙江大學