擴展青黴fp2菌株及其應用的製作方法

2024-03-02 21:47:15

擴展青黴fp2菌株及其應用的製作方法
【專利摘要】一種擴展青黴菌株，命名為擴展青黴FP2，學名為Penicillium expansum FP2，保藏編號為CCTCC NO：M2014040。採用本發明篩選的擴展青黴FP2菌株用於製備棒麴黴素，在製備棒麴黴素的發酵步驟中，由於採用了蘋果培養基，所製備的粗提取液中棒麴黴素含量是PDA液體培養基製備量的300倍，產品的成本是sigma公司同類產品的1/380，大大降低了產品的成本。CCTCC NO：M20140402014.02.19
【專利說明】擴展青黴FP2菌株及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於微生物【技術領域】，具體涉及到擴展青黴的一種菌株。

【背景技術】
[0002] 黴菌能產生豐富多樣的具有各種生物活性的次級代謝產物，一些黴菌在基質上 生長時也會產生有毒的次級代謝產物--真菌毒素，這些毒素能引起人和動物發生各種疾 病。棒麴黴素（Patulin，PAT)，又稱展青黴素，是一種具有較強毒性的真菌代謝產物，晶體 無色稜形，分子式為C 7H604，分子量為154,化學名稱為4-羥基4-氫-呋喃（3, 2-碳）駢吡 喃-2(6-氫）酮[4_117(11'(?7-4-!1-;1!\11'0(3,2(3)口50^11-2(6!{)-0116]。在許多因黴菌腐敗的水 果，如蘋果、杏子、藍莓、櫻桃、葡萄、梨、桃子和李子及其製品中都有發現，以蘋果發黴最易 積累該種毒素。
[0003] 大量的研究表明，棒麴黴素具有基因毒性和細胞毒性，能導致哺乳動物細胞的DNA 損傷[Zhou SM等，2010]，染色體畸變和微核形成[Alves I等，2000 ;Melo FT等，2012]，並 具有致癌性，致畸性，免疫毒性和生殖毒性[Puel 0等，2010]，在動物活體內，會損害腎臟、 肝臟和腸等器官組織[Saxena N等，2011;Mohan HM等，2012]。因而它成為判斷食品質量 安全的一個重要指標，受到世界各國及國際組織的極大關注，例如歐盟在2004年就頒布了 限制含棒麴黴素食品進口的法令。
[0004] 隨著棒麴黴素汙染食品的問題日趨嚴重，對於其毒性、檢測方法和控制技術的研 究越來越廣泛。無論是基礎研究還是檢測和控制研究，都需要大量的毒素樣品。而市售的 棒麴黴素標準品價格昂貴，如：sigma公司98%以上純度的棒麴黴素 P1639-5MG(5mg)的價 格是1946.88元人民幣沖1639-101^(1011^)的價格是3601.26元人民幣。這大大增加了科 學研究工作的成本，一定程度上限制了研究工作。在食品【技術領域】，當前急需解決的一個技 術問題是提供一種生產棒麴黴素成本低、產量大、產品純度高的菌株。


【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的一個技術問題在於提供高產棒麴黴素的擴展青黴FP2菌株。
[0006] 本發明所要解決的另一個技術問題在於為擴展青黴FP2菌株提供一種新用途。
[0007] 解決上述技術問題所採用的技術方案是：命名為擴展青黴FP2菌株（Penicillium expansum FP2)，於2014年2月19日保藏於武漢武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏 編號為 CCTCC NO :M2014040。
[0008] 擴展青黴FP2菌株的ITS-5. 8S rDNA序列為：
[0009] ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt accgagtgag ggccctttgg gtccaacctc 60 ccacccgtgt ttatttacct cgttgcttcg gcgggcccgc cttaactggc cgccgggggg 120 ctcacgcccc cgggcccgcg cccgccgaag acacccccga actctgcctg aagattgtcg 180 tctgagtgaa aatataaatt atttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttccggcatc 240 gatgaagaac gcagcgaaat gcgatacgta atgtgaattg caaattcagt gaatcatcga 300 gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat 360 tgctgccctc aagcccggct tgtgtgttgg gccccgtcct ccgattccgg gggacgggcc 420 cgaaaggcag cggcggcacc gcgtccggtc ctcgagcgta tggggctttg tcacccgctc 480 tgtaggcccg gccggcgctt gccgatcaac ccaaattttt atccaggtga cctcggatca 540 ggtagggata cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg agga 584
[0010] 擴展青黴FP2菌株的菌落及細胞形態：
[0011] 按照常規操作，接種擴展青黴FP2菌株在PDA培養基上，25°C培養7天，菌落直徑 為30mm，有放射狀溝紋，絨毛狀，邊緣不規則，暗綠色後變橙褐色，邊緣白色。分生孢子梗自 表生菌絲生出，單生，簇生或孢梗束狀生，分生孢子梗莖200?300 μ mX 3 μ m，頂端呈帚狀 分枝，多為兩層輪生；分生孢子橢圓形，光滑，無色，單胞，3?3. 5μηιΧ 2. 5?3μηι，形成不 規則鏈狀。
[0012] 擴展青黴FP2菌株的篩選方法如下：
[0013] 1、分離純化
[0014] 無菌接種針蘸取不同腐爛蘋果上的黴點，分別劃線接種於TOA固體培養基平板 上，28°C培養。待長出的菌落有明顯孢子後，無菌接種針蘸取孢子分別劃線於PDA固體培養 基平板，28°C培養5天，挑取單菌落邊緣菌絲分別於PDA斜面上28°C培養7天，加入10mL無 菌水，無菌接種針蘸取孢子懸液於PDA固體培養基平板上劃線，純化，28°C培養7天，分別挑 取單菌落於PDA斜面4°C冰箱保藏。
[0015] 2、篩選
[0016] 每100g去皮蘋果塊裝入250mL三角瓶中，加 8層紗布塞，121°C滅菌20分鐘，製成 無菌蘋果培養基；
[0017] 將分離得到的12株黴菌分別用PDA斜面28°C活化7天後，各加入無菌水製備成 濃度為10 7cfu/mL的孢子懸液，分別取lmL孢子懸液接種於100g無菌蘋果培養基中，28°C培 養箱中避光培養8天，分別取出培養物，研磨，各加入100mL乙酸乙酯，180r/min避光振蕩抽 提1小時，靜置5?10分鐘分層，上層有機相用無水硫酸鈉過濾，下層培養物再次用100mL 乙酸乙酯抽提2次，合併3次乙酸乙酯抽提液，用無水硫酸鈉過濾後，40°C旋轉蒸發至乾燥， 用15mLpH為4. 0的冰醋酸水溶液溶出，-20°C保存，每株黴菌平行2組，用0. 22 μ m水系濾膜 過濾冰醋酸水溶液溶出物，按照中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準SN/T2008-2007 《進出口果汁中棒麴黴毒素的檢測方法高效液相色譜法》進行檢測，相同條件下比較棒麴黴 素的出峰面積，峰面積最大的樣品棒麴黴素含量最多。從而篩選出產棒麴黴素最多的菌株， 命名為FP2菌株，鑑定，送保藏中心保藏。
[0018] 上述檢測方法中使用色譜柱為：Diamonsil?C18柱，250mmX4. 6mm(內徑），粒 徑 5 μ m〇
[0019] 採用擴展青黴FP2菌株製備棒麴黴素的方法如下：
[0020] 1、發酵
[0021] 每個250mL三角瓶中裝入100g去皮蘋果塊作為培養基，加8層紗布塞，121°C滅菌 20分鐘。將擴展青黴FP2菌株接種PDA試管斜面，28°C活化7天，每支試管斜面加入無菌 水製備成濃度為107cfu/mL孢子懸液，每個裝100g蘋果培養基的三角瓶中接入lmL濃度為 10 7cfu/mL的孢子懸液，28°C避光培養10天，獲得培養物。
[0022] 2、分離
[0023] 取培養物，分別研磨成糊狀，每100g加入乙酸乙酯lOOmL，150?200r/min避光振 蕩抽提1小時，靜置5?10分鐘分層，收集上層乙酸乙酯抽提液，下層培養物中加入乙酸乙 酯100mL/100g，150?200r/min避光振蕩抽提2小時，靜置5?10分鐘分層，收集乙酸乙 酯抽提液，下層培養物中再加入乙酸乙酯l〇〇mL/100g，150?200r/min避光振蕩抽提1小 時，靜置5?10分鐘分層，合併三次乙酸乙酯抽提液，用無水硫酸鈉過濾，40°C旋轉蒸發至 乾燥，用pH為4. 0的冰醋酸水溶液定溶至50mL，用0. 22 μ m水系濾膜過濾，得到棒麴黴素的 粗提取液。
[0024] 取棒麴黴素的粗提取液500yL，稀釋100倍，按照中華人民共和國出入境檢驗檢 疫行業標準SN/T2008-2007《進出口果汁中棒麴黴毒素的檢測方法高效液相色譜法》檢測 其中棒麴黴素含量。
[0025] 使用的色譜柱為：Diain〇nsil(E)C18柱，250mmX4. 6mm(內徑），粒徑5 μ m。棒麴黴 素標準品，購於Sigma公司，準確吸取2mL pH為4. 0的冰醋酸水溶液，充分溶解10mg棒麴黴 素標準品，吸取其中lmL的棒麴黴素溶液，稀釋為30mg/L、60mg/L、90mg/L、120mg/L、150mg/ L的標準液，以棒麴黴素的出峰面積X為橫坐標，棒麴黴素含量Y為縱坐標，繪製標準曲線， 得到標準曲線回歸方程：
[0026] Y = 0· 4789X+0. 2114(R2 為 0· 9994)
[0027] 根據繪出的標準曲線和測定出的棒麴黴素峰面積計算棒麴黴素的含量。
[0028] 3、純化
[0029] -70°C，100Pa冷凍乾燥棒麴黴素粗提取液至幹，用乙酸乙酯充分溶解，40°C旋轉蒸 發乙酸乙酯至10?15mL，200?300目矽膠柱層析純化，用丙酮與二氯甲烷體積比為1:30 的洗脫劑洗脫，溼法裝柱，幹法上樣，用薄層層析法檢測每管洗脫液中含有棒麴黴素的情 況；將含有棒麴黴素的洗脫液合併，40°C避光旋轉蒸發至幹，溶於10?15mL的石油醚與乙 酸乙酯體積比為1:1的溶劑中；再次200?300目矽膠柱層析，用石油醚與乙酸乙酯體積比 為1:1的洗脫劑洗脫，溼法裝柱，幹法上樣，用薄層層析法檢測每管洗脫液中含棒麴黴素的 情況；將只含有棒麴黴素的溶液合併，避光40°C旋轉蒸乾，溶於5?10mL的乙酸乙酯中，靜 止放置，得到棒麴黴素產物。
[0030] 上述薄層層析法的條件為：採用矽膠GF254層析板，乙酸乙酯與石油醚體積比1:2 為展開劑，展層3次，在254nm的紫外燈下，對比觀察樣品與從Sigma公司購買棒麴黴素標 準品的R f值。
[0031] 4、鑑定
[0032] 採用核磁共振分析儀，按儀器的使用方法對產物進行分析鑑定。用質譜分析儀，以 ESI電離方式對產物進行分析，確定產物的分子量。
[0033] 米用本發明篩選的擴展青黴FP2囷株用於製備棒麴黴素，在製備棒麴黴素的發酵 步驟中，由於採用了蘋果培養基，所製備的粗提取液中棒麴黴素含量是PDA液體培養基制 備量的300倍，產品的成本是sigma公司同類產品的1/380,大大降低了產品的成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1是擴展青黴FP2菌株在PDA培養基上的菌落形態照片。
[0035] 圖2是擴展青黴FP2菌株在顯微鏡下放大400倍的菌絲及分生孢子照片。
[0036] 圖3是擴展青黴FP2菌株基於ITS-5. 8S rDNA序列的鄰接法系統發育樹。
[0037] 圖4是棒麴黴素標準品的高效液相色譜圖。
[0038] 圖5是採用蘋果培養基發酵擴展青黴FP2菌株製備的棒麴黴素粗提取液稀釋100 倍的高效液相色譜圖。
[0039] 圖6是用擴展青黴FP2菌株製備的棒麴黴素溶於pH為4. 0的冰醋酸水溶液的高 效液相色譜圖。
[0040] 圖7是由擴展青黴FP2菌株製備的棒麴黴素的1H-NMR譜圖。
[0041] 圖8是由擴展青黴FP2菌株製備的棒麴黴素的13C_NMR譜圖。
[0042] 圖9是Sigma公司公布的棒麴黴素核磁譜圖。
[0043] 圖10是由擴展青黴FP2菌株製備的棒麴黴素的質譜（ESI)分析圖。

【具體實施方式】
[0044] 下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限於這些實施例。
[0045] 實施例1
[0046] 命名為擴展青黴FP2的菌株，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M2014040。
[0047] 擴展青黴FP2菌株的ITS-5. 8S rDNA序列為：
[0048] ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt accgagtgag ggccctttgg gtccaacctc 60 ccacccgtgt ttatttacct cgttgcttcg gcgggcccgc cttaactggc cgccgggggg 120 ctcacgcccc cgggcccgcg cccgccgaag acacccccga actctgcctg aagattgtcg 180 tctgagtgaa. aatataaatt atttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttccggcatc 240 gatgaagaac gcagcgaaat gcgatacgta atgtgaattg caaattcagt gaatcatcga 300 gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat 360 tgctgccctc aagcccggct tgtgtgttgg gccccgtcct ccgattccgg gggacgggcc 420 cgaaaggcag cggcggcacc gcgtccggtc ctcgagcgta tggggctttg tcacccgctc 480 tgtaggcccg gccggcgctt gccgatcaac ccaaattttt atccaggtga cctcggatca 540 ggtagggata cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg agga 584
[0049] 上述擴展青黴FP2菌株的篩選方法如下：
[0050] 1、分離純化
[0051] 無菌接種針分別蘸取3個不同腐爛蘋果上的黴點，分別劃線接種於6個PDA固體 培養基平板上，28°C培養。待長出的菌落有明顯孢子後，用無菌接種針蘸取孢子分別劃線於 PDA固體培養基平板，28°C培養5天。挑取單菌落邊緣菌絲分別於12個PDA斜面上28°C培 養7天，加入10mL無菌水，用無菌接種針蘸取孢子懸液於12個PDA固體培養基平板上劃線， 純化。28°C培養7天，分別挑取單菌落於PDA斜面4°C冰箱保藏。
[0052] 2、篩選
[0053] 每100g去皮蘋果塊裝入250mL三角瓶中，加8層紗布塞，121°C滅菌20分鐘，製成 無菌蘋果培養基。
[0054] 將分離得到的12株黴菌分別用PDA斜面28°C活化7天，各加入無菌水製備成濃 度為10 7cfu/mL的孢子懸液，分別取lmL孢子懸液接種於100g無菌蘋果培養基中，28°C培 養箱中避光培養8天，分別取出培養物，研磨，加入100mL乙酸乙酯，150?200r/min避光 振蕩抽提1小時，靜置5?10分鐘分層，上層有機相用無水硫酸鈉過濾，下層培養物再次 用100mL乙酸乙酯抽提2次，合併3次乙酸乙酯抽提液，用無水硫酸鈉過濾後，40°C旋轉蒸 發至乾燥，用15mL pH為4.0的冰醋酸水溶液溶出，-20°C保存。每株黴菌平行2組。用 0. 22 μ m水系濾膜過濾冰醋酸水溶液溶出物，按照中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標 準SN/T2008-2007《進出口果汁中棒麴黴毒素的檢測方法高效液相色譜法》進行檢測，相 同條件下比較棒麴黴素的出峰面積，峰面積最大的樣品棒麴黴素含量最多。從而篩選出產 棒麴黴素最多的菌株，命名為FP2菌株。
[0055] 上述檢測方法中使用色譜柱為：Diamonsil?C18柱,250mmX4. 6mm(內徑），粒 徑 5 μ m〇
[0056] 對採用本實施例篩選的擴展青黴FP2菌株進行了形態學鑑定以及分子生物學分 類鑑定，各種試驗情況如下：
[0057] 1、形態學鑑定
[0058] 按照常規操作，擴展青黴FP2在PDA培養基上25°C培養7天，菌落直徑為30mm，有 放射狀溝紋，絨毛狀，邊緣不規則，暗綠色後變橙褐色，邊緣白色，菌落形態照片見圖1。分生 孢子梗自表生菌絲生出，單生，簇生或孢梗束狀生，見圖2箭頭A所示；分生孢子梗莖200? 300 μ mX 3 μ m，頂端呈帚狀分枝，多為兩層輪生，見圖2箭頭B所示；分生孢子呈橢圓形，光 滑，無色，單胞3?3. 5μπιΧ2. 5?3μπι，形成不規則鏈狀，見圖2箭頭C所示（圖2中標 尺為20 μ m)。
[0059] 2、分子生物學分類鑑定
[0060] 採用ITS-5. 8S rDNA序列進行分類鑑定：採用CTAB法提取基因組DNA，20 μ L的 PCR反應體系，具體見表1，其中引物ITS1的鹼基序列為5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，引 物 ITS4 的鹼基序列為 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。
[0061] 表1 PCR反應體系
[0062]

【權利要求】
1. 一種擴展青黴菌株，命名為擴展青黴FP2,學名為Penicillium expansum FP2,保藏 編號為CCTCC NO :M2014040,擴展青黴FP2菌株的ITS-5. 8S rDNA序列為： ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt accgagtgag ggccctttgg gtccaacctc 60 ccacccgtgt ttatttacct cgttgcttcg gcgggcccgc cttaactggc cgccgggggg 120 ctcacgcccc cgggcccgcg cccgccgaag acacccccga actctgcctg aagattgtcg 180 tctgagtgaa aatataaatt atttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttccggcatc 240 gatgaagaac gcagcgaaat gcgatacgta atgtgaattg caaattcagt gaatcatcga 300 gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat 360 tgctgccctc aagcccggct tgtgtgttgg gccccgtcct ccgattccgg gggacgggcc 420 cgaaaggcag cggcggcacc gcgtccggtc ctcgagcgta tggggctttg tcacccgctc 480 tgtaggcccg gccggcgctt gccgatcaac ccaaattttt atccaggtga cctcggatca 540 ggtagggata cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg agga 584〇
2. 權利要求1所述的擴展青黴FP2菌株在製備棒麴黴素中的用途。
【文檔編號】C12N1/14GK104250619SQ201410408759
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年8月19日 優先權日:2014年8月19日
【發明者】張曉瑞, 郭玉蓉, 馬瑜, 柴永海 申請人:陝西師範大學