發酵法製取穀氨酸脫氫酶的工藝的製作方法
2024-03-02 19:27:15
專利名稱：發酵法製取穀氨酸脫氫酶的工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別是涉及到一種穀氨酸脫氫酶的發酵製備方法。
背景技術：
穀氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase)是穀氨酸生物合成過程中的關鍵酶，它廣泛分布於細菌、酵母、植物和哺乳動物組織中，是連接碳、氮代謝的重要酶類，催化穀氨酸脫氨生成a-酮戊ニ酸和氨，氨基被用於許多其他胺基酸的合成中。目前，穀氨酸脫氫酶已應用到醫療診斷中，也是製備尿素氮試劑盒(速率法)的必 需酶之一。從1960年開始，國內外對其他細菌來源的穀氨酸脫氫酶已開始進行分離和研究。但對穀氨酸生產菌中穀氨酸脫氫酶的報導較少，穀氨酸棒桿菌中的穀氨酸脫氫酶的提取純化相關報導很少，國內尚未實現菌株發酵製備穀氨酸脫氫酶的規模化生產，致使國內研製尿素氮試劑盒所用的穀氨酸脫氫酶大多從國外進ロ，因此試劑盒的成本較高，為降低其成本必須解決穀氨酸脫氫酶的製備問題，因而對穀氨酸脫氫酶的菌株發酵製備エ藝進行深入的研究，將為指導エ業生產提供重要的依據。
發明內容
本發明的目的是提出發酵法製取穀氨酸脫氫酶的一種エ藝，本エ藝可以有效提穀氨酸脫氫酶的產量和產品純度，提高產率，降低生產成本。發酵法製取穀氨酸脫氫酶的一種エ藝方法，其特徵在於，包括如下步驟(I)穀氨酸棒桿菌CQ920的發酵穀氨酸棒桿菌CQ920接種於普通肉湯培養基上，32°C培養36h進行活化，活化I 2次；將3-4塊0. 5-1. Ocm2活化後的菌株接入滅菌冷卻後的種子培養基內，32°C，180rpm培養10-12h ;培養獲得的種子培養液以8%的接種量轉入滅菌冷卻後的發酵培養基內，控制發酵溫度及通風，發酵過程中流加10%的尿素控制pH值為7. 5左右，當殘糖濃度降至一定值時開始加入50%的葡萄糖溶液，流加糖總時間為IOh左右。(2)穀氨酸脫氫酶粗酶液的製備菌株發酵液離心，用0. 2%的KCl洗滌數次，取定量溼菌體，按比例加入pH 7. 5的25mm的Tris-HCl緩衝液，菌體懸液在4°C用超聲波細胞破碎儀處理2次，每次20min，離心去沉澱，獲得穀氨酸脫氫酶粗提液。(3)離子交換層析穀氨酸脫氫酶粗提液上樣於25mm Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的DEAE-纖維素柱，用含0. 2-0. 6mm NaCl的25mm Tris-HCl (pH 7. 5)梯度洗脫，分布收集，合併活性部分。⑷疏水層析離子交換層析液用PEG6000濃縮後，上樣於用含Im硫酸銨的25mm Tris-HCl (pH
7.5)平衡的疏水柱HiPr印，用含Im硫酸銨的25mm Tris-HCl (pH 7. 5)和含50%こニ醇的25mm Tris-HCl (pH 7. 5)梯度洗脫，分步收集，合併活性部分。
(5)凝膠過濾層析疏水層析收集液用截留分子量為12000U的透析袋透析4h，用PEG6000濃縮後上樣於用含0. 2m NaCl的25mm Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的凝膠過濾柱SuperdexG-200,用相同的緩衝液洗脫，分步收集，合併活性高的部分。(6)超濾將凝膠過濾層析收集液用截留分子量10000U的超濾器於5000r/min，4°C離心5~6ho(7)成品取離心後上部超濾液，冷凍乾燥，獲得穀氨酸脫氫酶成品。
本發明提供的上述以發酵法製取穀氨酸脫氫酶的エ藝，其特點在於(I)誘變篩選獲得高產穀氨酸脫氫酶菌株，菌株發酵性能穩定，發酵液內穀氨酸脫氫酶含量高，酶活性高，為後期發酵エ藝的優化及產物的提取奠定了基礎；(2)菌株發酵培養基內加入了稀土元素，有效提高了穀氨酸脫氫酶的活性，優化後菌株發酵酶活達到110U/mL，為國內已報導中最高水平；(3)採用柱層析進行穀氨酸脫氫酶的純化，可有效提高終產品的比酶活，同時降低雜質對產物的影響，有效實現終產品的穩定性和高效性；(4)利用液體發酵製備穀氨酸脫氫酶，與傳統提取法相比，具有周期短、產量大、成本低等優點，製備獲得的穀氨酸脫氫酶的比酶活高於260U/mg。
附圖I為發酵法製取穀氨酸脫氫酶エ藝流程圖，經菌株發酵製備獲得的穀氨酸脫氫酶成品比酶活高於260U/mg。
具體實施例方式提出以下實例來具體說明本發明，但本發明的內容並不局限於此。實例I穀氨酸棒桿菌CQ920接種於普通肉湯培養基上，32°C培養36h活化2次；將3塊0. 5-1. Ocm2活化後的菌株接入滅菌冷卻後的種子培養基內(尿素0.5% (単獨滅菌)，葡萄H 2.5%,玉米漿3 %，硫酸鎂0.4%,磷酸氫ニ鉀0.1%，硫酸鐵2 X 10_6，硫酸錳2 X 10_6，pH值7. 0-7. 2)，32°C，180rpm培養IOh ;培養獲得的種子培養液以8%的接種量轉入滅菌冷卻後的發酵培養基內(尿素0.8% (単獨滅菌)，葡萄糖5%，玉米漿0.8%，硫酸鎂0.4%，磷酸氫ニ鉀 0. I %，硫酸鐵 2 X 10_6，硫酸錳 2 X 10_6，LaCl3 0. 72mmol/L, CeCl3 0. 071mmol/L,NdCl3 0. 007mmol/L, pH值調節至7. 0-7. 2)，發酵溫度前期控制為34 °C，中期為36°C，後期為37°C，通風控制為前期200r/min，中期250r/min，後期230r/min，發酵過程中流加10%的尿素控制PH值為7. 5左右，當殘糖濃度降至一定值時開始加入50%的葡萄糖溶液，流加糖總時間為IOh左右，發酵18h後停止。菌株發酵液離心，用0. 2%的KCl洗滌2次，取30g溼菌體，加入150ml pH 7. 5的25mm的Tris-HCl緩衝液，菌體懸液在4°C用超聲波細胞破碎儀處理2次，每次20min，離心去沉澱，獲得穀氨酸脫氫酶粗提液，穀氨酸脫氫酶的酶活為110U/mL。穀氨酸脫氫酶粗提液上樣於25mm Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的DEAE-纖維素柱，用含 0. 2-0. 6mm NaCl 的 25mm Tris-HCl (pH 7. 5)梯度洗脫，流速 2. 5mL/min,分步收集，合併活性部分；離子交換層析液用PEG6000濃縮至5mL左右，上樣於用含Im硫酸銨的25mmTris-HCKpH 7.5)平衡的疏水柱HiPr印，用含Im硫酸銨的25mm Tris-HCl (pH 7.5)和含50%こニ醇的25mm Tris-HCl (pH 7.5)梯度洗脫，流速2. 5mL/min，分步收集，合併活性部分；疏水層析收集液用截留分子量為12000U的透析袋透析4h，用PEG6000濃縮至2mL左右，上樣於用含0. 2m NaCl的25_ Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的凝膠過濾柱Superdex G-200，用相同的緩衝液洗脫，流速0. 5mL/min,分步收集，合併活性高的部分；將凝膠過濾層析收集液用截留分子量10000U的超濾器於5000r/min，4°C離心5_6h，取上部超濾液，冷凍乾燥，獲得穀氨酸脫氫酶成品，比酶活為260. 8U/mg。實例2穀氨酸棒桿菌CQ920接種於普通肉湯培養基上，32°C培養36h活化I次；將4塊0. 5-1. Ocm2活化後的菌株接入滅菌冷卻後的種子培養基內(尿素0.8% (単獨滅菌)，葡萄糖3 %，玉米漿2.5%,硫酸鎂0.4%,磷酸氫ニ鉀0.1%，硫酸鐵2 X 10_6，硫酸錳2 X 10_6，pH 值7. 0-7. 2)，32°C，180rpm培養12h ;培養獲得的種子培養液以8%的接種量轉入滅菌冷卻後的發酵培養基內(尿素0.8% (単獨滅菌)，葡萄糖5%，玉米漿0.8%，硫酸鎂0.4%，磷酸氫ニ鉀 0. I %，硫酸鐵 2 X 10_6，硫酸錳 2 X 10_6，LaCl3 0. 72mmol/L, CeCl3 0. 071mmol/L,NdCl3 0. 007mmol/L, pH值調節至7. 0-7. 2)，發酵溫度前期控制為33°C，中期為35°C，後期為37°C，通風控制為前期200r/min，中期250r/min，後期230r/min，發酵過程中流加10%的尿素控制PH值為7. 5左右，當殘糖濃度降至一定值時開始加入50%的葡萄糖溶液，流加糖總時間為IOh左右，發酵18h後停止。菌株發酵液離心，用0. 2%的KCl洗滌3次，取30g溼菌體，加入200ml pH 7. 5的25mm的Tris-HCl緩衝液，菌體懸液在4°C用超聲波細胞破碎儀處理2次，每次20min，離心去沉澱，獲得穀氨酸脫氫酶粗提液，穀氨酸脫氫酶的酶活為112U/mL。穀氨酸脫氫酶粗提液上樣於25mm Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的DEAE-纖維素柱，用含 0. 2-0. 6mm NaCl 的 25mm Tris-HCl (pH 7. 5)梯度洗脫，流速 2. 5mL/min,分步收集，合併活性部分；離子交換層析液用PEG6000濃縮至5mL左右，上樣於用含Im硫酸銨的25mmTris-HCKpH 7.5)平衡的疏水柱HiPr印，用含Im硫酸銨的25mm Tris-HCl (pH 7.5)和含50%こニ醇的25mm Tris-HCl (pH 7.5)梯度洗脫，流速2. 5mL/min，分步收集，合併活性部分；疏水層析收集液用截留分子量為12000U的透析袋透析4h，用PEG6000濃縮至2mL左右，上樣於用含0. 2m NaCl的25_ Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的凝膠過濾柱Superdex G-200，用相同的緩衝液洗脫，流速0. 5mL/min,分步收集，合併活性高的部分；將凝膠過濾層析收集液用截留分子量10000U的超濾器於5000r/min，4°C離心5_6h，取上部超濾液，冷凍乾燥，獲得穀氨酸脫氫酶成品，比酶活為262. 2U/mg0實例3穀氨酸棒桿菌CQ920接種於普通肉湯培養基上，32°C培養36h活化2次；將4塊
0.5-1. Ocm2活化後的菌株接入滅菌冷卻後的種子培養基內(尿素0.5%-0.8% (単獨滅菌)，葡萄糖2.8%，玉米漿3 %，硫酸鎂0.4%，磷酸氫ニ鉀0.1%，硫酸鐵2 X 10_6，硫酸錳2X 10_6，pH值7. 0-7. 2),32°C,180rpm培養12h ;培養獲得的種子培養液以8 %的接種量轉入滅菌冷卻後的發酵培養基內(尿素0.8% (単獨滅菌)，葡萄糖5%，玉米漿0.8%，硫酸鎂 0.4%，磷酸氫ニ鉀 0. 1%，硫酸鐵 2X10_6，硫酸錳 2X10_6，LaCl3 0. 72mmol/L, CeCl3
0.071mmol/L, NdCl3 0. 007mmol/L, pH值調節至7. 0-7. 2)，發酵溫度前期控制為32°C，中期為34°C，後期為37°C，通風控制為前期200r/min，中期250r/min，後期230r/min，發酵過程中流加10%的尿素控制pH值為7. 5左右，當殘糖濃度降至一定值時開始加入50%的葡萄糖溶液，流加糖總時間為IOh左右，發酵18h後停止。
菌株發酵液離心，用0. 2%的KCl洗滌3次，取30g溼菌體，加入150ml pH 7. 5的25mm的Tris-HCl緩衝液，菌體懸液在4°C用超聲波細胞破碎儀處理2次，每次20min，離心去沉澱，獲得穀氨酸脫氫酶粗提液，穀氨酸脫氫酶的酶活為112. 6U/mL。穀氨酸脫氫酶粗提液上樣於25mm Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的DEAE-纖維素柱，用含 0. 2-0. 6mm NaCl 的 25mm Tris-HCl (pH 7. 5)梯度洗脫，流速 2. 5mL/min,分步收集，合併活性部分；離子交換層析液用PEG6000濃縮至5mL左右，上樣於用含Im硫酸銨的25mmTris-HCKpH 7.5)平衡的疏水柱HiPr印，用含Im硫酸銨的25mm Tris-HCl (pH 7.5)和含50%こニ醇的25mm Tris-HCl (pH 7.5)梯度洗脫，流速2. 5mL/min，分步收集，合併活性部分；疏水層析收集液用截留分子量為12000U的透析袋透析4h，用PEG6000濃縮至2mL左右，上樣於用含0. 2m NaCl的25_ Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的凝膠過濾柱Superdex G-200，用相同的緩衝液洗脫，流速0. 5mL/min,分步收集，合併活性高的部分；將凝膠過濾層析收集液用截留分子量10000U的超濾器於5000r/min，4°C離心5_6h，取上部超濾液，冷凍乾燥，獲得穀氨酸脫氫酶成品，比酶活為261. 5U/mg。實施例四穀氨酸棒桿菌CQ920接種於普通肉湯培養基上，32°C培養36h活化2次；將4塊
0.5-1. Ocm2活化後的菌株接入滅菌冷卻後的種子培養基內(尿素0.5% (単獨滅菌)，葡萄糖3 %，玉米漿3 %，硫酸鎂0.4%，磷酸氫ニ鉀0.1%，硫酸鐵2 X 10_6，硫酸錳2 X 10_6，pH值7. 0-7. 2)，32°C，180rpm培養12h ;培養獲得的種子培養液以8%的接種量轉入滅菌冷卻後的發酵培養基內(尿素0.8% (単獨滅菌)，葡萄糖5%，玉米漿0.8%，硫酸鎂0.4%，磷酸氫ニ鉀 0. I %，硫酸鐵 2 X 10_6，硫酸錳 2 X 10_6，LaCl3 0. 72mmol/L, CeCl3 0. 071mmol/L,NdCl3 0. 007mmol/L, pH值調節至7. 0-7. 2)，發酵溫度前期控制為32°C，中期為36°C，後期為37°C，通風控制為前期200r/min，中期250r/min，後期230r/min，發酵過程中流加10%的尿素控制PH值為7. 5左右，當殘糖濃度降至一定值時開始加入50%的葡萄糖溶液，流加糖總時間為IOh左右。菌株發酵液離心，用0. 2%的KCl洗滌3次，取30g溼菌體，加入240ml pH 7. 5的25mm的Tris-HCl緩衝液，菌體懸液在4°C用超聲波細胞破碎儀處理2次，每次20min，離心去沉澱，獲得穀氨酸脫氫酶粗提液，穀氨酸脫氫酶的酶活為112. 5U/mL，發酵18h後停止。穀氨酸脫氫酶粗提液上樣於25mm Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的DEAE-纖維素柱，用含 0. 2-0. 6mm NaCl 的 25mm Tris-HCl (pH 7. 5)梯度洗脫，流速 2. 5mL/min,分步收集，合併活性部分；離子交換層析液用PEG6000濃縮至5mL左右，上樣於用含Im硫酸銨的25mmTris-HCKpH 7.5)平衡的疏水柱HiPr印，用含Im硫酸銨的25mm Tris-HCl (pH 7.5)和含50%こニ醇的25mm Tris-HCl (pH 7.5)梯度洗脫，流速2. 5mL/min，分步收集，合併活性部分；疏水層析收集液用截留分子量為12000U的透析袋透析4h，用PEG6000濃縮至2mL左右，上樣於用含0. 2m NaCl的25_ Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的凝膠過濾柱Superdex G-200，用相同的緩衝液洗脫，流速0. 5mL/min,分步收集，合併活性高的部分；將凝膠過濾層析收集液用截留分子量10000U的超濾器於5000r/min，4°C離心5_6h，取上部超濾液，冷凍乾燥，獲得穀氨酸脫氫酶成品，比酶活為26 0. 9U/mg。
權利要求
1.一種發酵法製取穀氨酸脫氫酶的エ藝，其特徵在於，包括如下步驟 (1)發酵穀氨酸棒桿菌CQ920接種於普通肉湯培養基上，32°C培養36h進行活化，活化I 2次；將3-4塊0. 5-1. Ocm2活化後的菌株接入滅菌冷卻後的種子培養基內，32°C，180rpm培養10-12h ;培養獲得的種子培養液以8%的接種量轉入滅菌冷卻後的發酵培養基內，控制發酵溫度及通風，發酵過程中流加10%的尿素控制pH值為7. 5左右，當殘糖濃度降至一定值時開始加入50%的葡萄糖溶液，流加糖總時間為IOh左右； (2)粗酶液的製備菌株發酵液離心，用0.2%的KCl洗滌數次，取定量溼菌體，按比例加入pH 7. 5 25mm的Tris-HCl緩衝液，菌體懸液在4°C用超聲波細胞破碎儀處理2次，每次20min，離心去沉澱，獲得穀氨酸脫氫酶粗提液； (3)離子交換層析離子交換層析エ藝為穀氨酸脫氫酶粗提液上樣於25mmTris-HCKpH 7. 5)平衡的DEAE-纖維素柱，用含0. 2-0. 6mm NaCl 的 25mmTris_HCl (pH 7. 5)梯度洗脫，分步收集，合併活性部分； (4)疏水層析離子交換層析液用PEG6000濃縮後，上樣於用含Im硫酸銨的25mmTris-HCKpH 7.5)平衡的疏水柱HiPr印，用含Im硫酸銨的25mm Tris-HCl (pH 7.5)和含50%こニ醇的25mm Tris-HCl (pH 7. 5)梯度洗脫，分步收集，合併活性部分； (5)凝膠過濾層析疏水層析收集液用截留分子量為12000U的透析袋透析4h，用PEG6000濃縮後上樣於用含0. 2m NaCl的25mm Tris-HCl (pH 7. 5)平衡的凝膠過濾柱Superdex G-200,用相同的緩衝液洗脫,分步收集,合併活性高的部分； (6)超濾將凝膠過濾層析收集液用截留分子量10000U的超濾器於5000r/min，4°C離心 5_6h ； (J)成品取離心後上部超濾液，冷凍乾燥，獲得穀氨酸脫氫酶成品。
2.根據權利要求I所述的發酵法製取穀氨酸脫氫酶的エ藝，其特徵在於，步驟(I)所述的種子培養基尿素0. 5 % -0. 8 % (単獨滅菌)，葡萄糖2^-3%,玉米漿2.5^-3%,硫酸HO. 4%,磷酸氫ニ鉀0.1%，硫酸鐵2 X 10'硫酸錳2 X 10' pH值7. 0-7. 2 ;發酵培養基尿素0.5% -0.8% (單獨滅菌)，葡萄糖2% -3%，玉米漿0.5-% 0.8%，硫酸鎂0.4%，磷酸氫ニ鉀 0. I %，硫酸鐵 2 X 10_6，硫酸錳 2 X 10_6，LaCl3 0. 72mmol/L, CeCl3 0. 071mmol/L,NdCl3 0. 007mmol/L, pH 值調節至 7. 0-7. 2。
3.根據權利要求I所述的發酵法製取穀氨酸脫氫酶的エ藝，其特徵在於，步驟(I)所述的發酵溫度前期控制為30-35°C，中期為32-37°C，後期為35-38°C ;通風控制為前期150-200r/min,中期 200_250r/min，後期 180_230r/min。
4.根據權利要求I所述的發酵法製取穀氨酸脫氫酶的エ藝，其特徵在於，步驟(2)所述的穀氨酸脫氫酶製備過程中菌體洗滌次數為2-3次，溼菌體及緩衝液的比例為1:5-1: 8(m/v)。
5.根據權利要求I所述的發酵法製取穀氨酸脫氫酶的エ藝，其特徵在於，步驟(3)、(4)、(5)、(6)所述的純化各步操作均加入0. 02%疊氯化鈉以防止雜菌汙染。
6.根據權利要求I所述的發酵法製取穀氨酸脫氫酶的エ藝，其特徵在於，製備獲得的穀氨酸脫氫酶的比酶活高於260U/mg。
全文摘要
本發明公開了一種高產菌株發酵製取穀氨酸脫氫酶的方法，其製備方法如下經過穀氨酸棒桿菌發酵、製備粗酶液、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析、超濾、濃縮乾燥後，獲得穀氨酸脫氫酶成品，其比酶活高於260U/mg，酶活回收率高於14％，純化倍數約75倍。本發明採用上述方法製備穀氨酸脫氫酶，設備簡單，方法易行，操作安全，適合工業化生產。
文檔編號C12N9/06GK102787106SQ20111044971
公開日2012年11月21日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者高聚霞 申請人:西藏金稞集團有限責任公司