左旋二酮還原酶的製作方法
2024-03-02 14:57:15
專利名稱：左旋二酮還原酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型酶，即左旋二酮(levodione)還原酶，涉及一種用於生產該酶的方法，以及使用該酶從(6R)-2，2，6-三甲基環己烷-1，4-二酮(下文稱為左旋二酮)生產(4R，6R)-4-羥基-2，2，6-三甲基環己酮(下文稱為放線醇(actinol)的方法。放線醇是生產玉米黃質的重要中間體。
在歐洲專利申請98115564.1(1998年8月19日提交)和隨後的歐洲申請99115723.1(1999年8月16日提交並要求在先申請的優先權)中，公開了一種製造放線醇的方法，該方法包括使左旋二酮與一種微生物接觸，該微生物選自纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、動性球菌屬(Planococcus)和節桿菌屬(Arthrobacter)，並能使左旋二酮選擇性地非對稱還原為放線醇，然後從反應混合物中回收形成的放線醇。人們發現水生棒桿菌(Corynebacterium aquaticum)AKU611(FERM BP-6448)是用於這種用途的最好的微生物菌株之一。
微生物菌株水生棒桿菌AKU611的分類學特性如下1)可生長的溫度15-40℃2)最適生長溫度30℃3)專性好氧性及革蘭氏陰性微生物4)孢子形成無5)在培養過程中可以觀察到多態性和傳統的棒狀-球狀(rod-cocus)周期。
6)運動性無而且，通過Biolog System(Biolog公司，3447 Investment Blvd.，Suite 3，Hayward，California 94545，美國自然(Nature)，339，157-158，1989年5月11日)基於多種碳源的同化對菌株水生棒桿菌AKU611的鑑定如下將該菌株的細胞接種到96-孔微滴定板上，在28℃下培養24小時。每孔包含在BUGM+B培養基(Biolog通用生長培養基+血液；Biolog公司)中的96種碳源中的一種。
在培養後，該菌株表現出了下列的碳源同化作用碳源 碳源A1 -A2 -A3 -A4 -A5 -A6 -A7 -A8 +A9 +A10 -A11 -A12 +B1 -B2 +B3 -B4 -B5 +B6 -B7 +B8 -B9 +B10 +B11 +B12 -C1 -C2 -C3 -C4 +C5 +C6 +C7 -C8 +C9 -C10 -C11 -C12 -D1 -D2 -D3 +D4 -D5 +D6 -D7 -D8 +D9 -D10 -D11 +D12 +E1 -E2 -E3 +E4 -E5 -E6 -E7 -E8 -E9 -E10 -E11 -E12 -F1 -F2 -F3 -F4 -F5 -F6 +F7 -F8 -F9 -F10 -F11 -F12 -G1 -G2 -G3 -G4 -
G5 - G6 -G7 - G8 -G9 - G10 -G11 - G12 -H1 - H2 -H3 - H4 -H5 - H6 -H7 - H8 -H9 - H10 -H11 - H12 -A1水 A2α-環糊精A3β-環糊精 A4糊精A5糖原A6菊粉A7甘露聚糖A8Tween40A9Tween80 A10N-乙醯-D-葡糖胺A11N-乙醯-D-甘露糖胺A12扁桃苷 B1L-阿拉伯糖B2D-阿糖醇B3熊果苷B4纖維二糖B5D-果糖B6L-巖藻糖B7D-半乳糖B8D-半乳糖醛酸B9龍膽二糖B10D-葡糖酸 B11α-D-葡萄糖B12m-肌醇 C1α-D-乳糖C2乳果糖 C3麥芽糖C4麥芽三糖(maltotriitrose)C5D-甘露糖醇C6D-甘露糖C7D-松三糖C8D-蜜二糖C9α-甲基-D-半乳糖苷C10α-甲基-D-半乳糖苷 C113-甲基-葡萄糖C12α-甲基-D-葡糖苷 D1β-甲基-D-葡糖苷D2α-甲基-D-甘露糖苷 D3顎糖(palatinose)D4D-阿洛酮糖 D5D-棉子糖D6L-鼠李糖D7D-核糖D8水楊苷 D9景天庚酮糖D10D-山梨醇 D11水蘇糖D12蔗糖 E1D-璐格糖E2D-海藻糖E3土冉糖E4木糖醇 E5D-木糖E6乙酸E7α-羥丁酸E8β-羥丁酸 E9γ-羥丁酸E10對羥基苯乙酸E11α-酮戊二酸E12α-酮戊酸F1乳醯胺 F2D-乳酸甲酯F3L-乳酸 F4D-蘋果酸F5L-蘋果酸F6丙酮酸甲酯F7丁二酸單甲酯F8丙酸F9丙酮酸 F10琥珀醯胺酸F11琥珀酸 F12N-乙醯-L-穀氨酸G1丙氨醯胺G2D-丙氨酸G3L-丙氨酸G4L-丙氨醯甘氨酸G5L-天冬醯胺 G6L-穀氨酸G7甘氨醯-L-穀氨酸 G8L-pyloglutamic acidG9L-絲氨酸G10腐胺(putrscine)G112，3-丁二醇G12甘油H1腺苷H22′-脫氧-腺苷H3肌苷H4胸苷H5尿苷H6腺苷-5′-單磷酸H7胸苷-5′-單磷酸H8尿苷-5′-單磷酸H9果糖-6-磷酸 H10葡萄糖-1-磷酸H11葡萄糖-6-磷酸 H12DL-α-甘油磷酸本發明的一個目的是提供新的左旋二酮還原酶，該左旋二酮還原酶可作用於左旋二酮產生放線醇。左旋二酮還原酶具有下列理化性質a)分子量142,000-155,000±10,000(由四個分子量為36,000±5,000的相同亞基組成)b)輔因子煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)c)底物特異性對左旋二酮具有活性d)最適溫度在pH 7.0時為15-20℃e)最適pH7.5f)激活劑K+、Cs+、Rb+、Na+和NH4+本發明的另一個目的是提供一種生產如上所述的新左旋二酮還原酶的方法，該方法包括通過在液體營養培養基中、好氧條件下培養屬於棒桿菌屬的微生物，其中該微生物能產生具有上述理化性質的左旋二酮還原酶；破壞所述微生物的細胞；從所述微生物破壞的細胞之無細胞提取物中分離並純化左旋二酮還原酶。本發明的另一個目的是提供一種使用左旋二酮還原酶從左旋二酮生產放線醇的方法，該方法包括使左旋二酮與(i)如上所述的左旋二酮還原酶在還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)存在下接觸，或(ii)與所述的微生物的無細胞提取物接觸，然後分別在(i)和(ii)的情況下從反應混合物中分離形成的放線醇。
根據下面所述的實施例製備的左旋二酮還原酶的純化樣品的理化性質如下1)酶活性本發明的新左旋二酮還原酶在輔因子存在下根據下式催化左旋二酮還原成放線醇
在此還原系統中，煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽(NADPH)的還原形式不能用作電子供體。
標準的酶測定進行如下總體積為500μl的基本反應混合物(由100μl1M的磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)、20μl在0.2mM KOH中的8mM NADH、10-40μl的酶溶液並加水至500μl組成)在37℃下溫育1分鐘。然後加入2μl0.5M的左旋二酮溶液以達到2mM的最終濃度，將整個溶液在37℃下溫育1分鐘。用在340nm下NADH吸光度的降低來測定酶活性。一單位的酶活性定義為每分鐘催化1μmol NADH氧化的酶的量。
NAD、NADH和NADPH可從日本東京Oriental Yeast，3-6-10 Azusawa，Itabashi-ku獲得。
蛋白質濃度通過使用Bio-Rad蛋白質測定試劑盒(Bio-Rad試驗室，2000Alfred Nobel Drive，Hercules，CA 94547，美國)測定。
2)分子量所述酶的分子量(MW)使用凝膠過濾HPLC柱Cosmosil 5Diol-300(nacalai tesqueNishi-iru，Karasuma，Nijodohri，Nakagyouku，Kyoto-fu，日本)測定。與下列分子量標記蛋白質相比較，計算出全酶的表觀分子量為142,000-155,000±10,000LMW+HMW凝膠過濾校準試劑盒，Amersham Pharmacia Biotech(SE-75184 Uppsala，瑞典)；鐵蛋白(MW440,000)；醛縮酶(MW 158,000)；牛血清白蛋白(MW 67,000)；卵清蛋白(MW 43,000)以及核糖核酸酶A(MW 13,700)。與下列分子量標記蛋白質相比較，SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)得出了分子量為36,000±5,000的單條帶LMW電泳校準試劑盒，Amersham PharmaciaBiotech；牛血清白蛋白(MW 67,000)；卵清蛋白(MW 43,000)；碳酸酐酶(MW 30,000)；大豆胰蛋白酶抑制劑(MW 20,100)以及α-乳清蛋白(MW14,400)。這表明該酶是由四個亞基組成的。全酶的分子量的值(142,000-155,000±10,000)和每個亞基分子量的值(36,000±5,000)使用各自所允許的方法(即凝膠過濾柱方法和SDS-PAGE方法)精確地測定。
3)輔因子研究了所述的酶將左旋二酮轉變為放線醇所需的輔因子。結果是確立NADH可以作為這種還原反應的輔因子，但是NADPH不能。
4)底物特異性除了使用每種底物溶液(在反應混合物中的最終濃度為2mM)替換左旋二酮外，使用與1)中所述的相同酶測定方法測定所述酶的底物特異性。結果表明左旋二酮是該酶表現出活性的唯一底物。
表1
5)最適溫度在2至45℃的溫度下測定酶活性。酶活性的最適溫度是15-20℃。
表2
6)最適pH除了使用多種pH和緩衝液以及向反應混合物中添加40μl 2.5M KCl溶液外，使用如1)中所述的相同酶測定方法測定酶活性和反應混合物pH值之間的關係。測得酶反應的最適pH為7.5。
表3<
7)金屬離子的影響除了使用100μl 1M Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)替代100μl 1M磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)，以及向反應混合物中添加多種金屬離子以達到100mM至3M的金屬離子最終濃度外，使用如1)中所述的相同酶測定方法測定金屬離子對酶活性的影響。結果表明在3M RbCl和1.8M CsCl存在下酶活性增加了大約250倍。
表4-1
表4-2
8)溫度穩定性將酶溶液在不同溫度下處理10分鐘，然後使用如1)中所述的相同酶測定方法測定剩餘的酶活性。測得該酶在高達35℃時穩定，隨著溫度的提高逐漸失活，在55℃時完全失活。
表
餘的酶活性。測得該酶在8.0至8.5的pH範圍內最穩定。
使用左旋二酮和放線醇作為底物測定該酶的Km和Vmax值。基本的酶測定方法與1)中所述的方法相同，但是底物和酶濃度不同。左旋二酮作為底物時的Km和Vmax值分別為8.5mM和101.26單位/mg。而放線醇作為底物時的Km和Vmax值分別為1.36mM和15.91單位/mg。
Km和Vmax值在已知的米氏方程的基礎上計算。Km是達到酶反應的Vmax的50％時的底物濃度。該值是該酶對所用底物的催化活性的有用指示值。
11)純化過程原則上左旋二酮還原酶的純化可以由下列已知的純化方法的任意組合完成如使用沉澱劑(如硫酸銨、聚乙二醇等)、離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾層析、凝膠電泳和鹽析與透析等進行分級分離。
如上所述，本發明所提供的左旋二酮還原酶可以通過如下方法製備在液體營養培養基中、有氧條件下培養適當的微生物，破壞所述微生物的細胞，並從所破壞微生物的細胞之無細胞提取物中分離並純化左旋二酮還原酶。
用於本發明的微生物是屬於可以產生上文定義的左旋二酮還原酶的棒桿菌屬的微生物。所述微生物的功能等同物、傳代培養物、突變體、變種也可用於本發明。
優選的菌株是水生棒桿菌。在本發明中使用的最優選的特定菌株是水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)，該菌株的一個樣品已根據布達佩斯條約於1998年8月4日保藏在日本工業科技局的國立生命科學和人類技術研究所中。
而且，歐洲專利申請98115564.1(1998年8月19日提交)和隨後的歐洲申請99115723.1(1999年8月16日提交並要求在先申請的優先權)公開了該菌株的某些特性。
該微生物可以在含有下列物質的營養培養基上培養糖(如葡萄糖和蔗糖)、醇(如乙醇和甘油)、脂肪酸(如油酸和硬脂酸)及其酯或油(如油菜籽油和大豆油)作為碳源；硫酸銨、硝酸鈉、蛋白腖、胺基酸、玉米漿、麩糠、酵母提取物等作為氮源；硫酸鎂、氯化納、碳酸鈣、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等作為無機鹽來源；麥芽提取物、肉膏提取物等作為其它營養源。培養可以在好氧條件下進行，通常在3至9的培養基pH、10至40℃的培養溫度下進行1-7天。
在培養後從所述微生物中分離和純化左旋二酮還原酶的實施方案如下(1)通過離心或過濾從液體培養液中收穫細胞。
(2)用水、生理鹽水或適當pH的緩衝液洗滌所收穫的細胞。
(3)將洗滌後的細胞懸浮在緩衝液中，通過勻漿器、超聲波機、弗氏壓碎器破壞或用溶菌酶等處理以形成破壞細胞的溶液。
(4)從所破壞細胞的無細胞提取物中分離並純化左旋二酮還原酶。
本發明所提供的左旋二酮還原酶可用作從左旋二酮生產放線醇的催化劑。
左旋二酮還原酶催化的左旋二酮還原為放線醇的反應可以方便地在NADH存在時、大約6.0至大約9.0的pH值下在溶劑中進行。作為溶劑，任何可將pH保持在大約6.0至大約9.0的緩衝液(如Tris-HCl緩衝液、磷酸鹽緩衝液、Bis-tris緩衝液、HEPES緩衝液等)都是適合的。
進行該反應的優選的溫度範圍是大約2至大約30℃。當pH和溫度分別在大約7.0至8.0和10至25℃的範圍中時，反應通常產生最好的結果。
在溶劑中左旋二酮的濃度依賴於其它反應條件，但通常是1mM至2M，優選的是10mM至100mM。
存在於反應混合物中的左旋二酮還原酶和NADH的適當量依賴於其它反應條件，但通常是在每種情況下獨立地為底物量的大約10-4至10-6。當從NAD到NADH的再生系統與上述反應系統偶聯時，反應進行得更有效。
在該反應中，左旋二酮還原酶也可以以用適當載體固定化的狀態使用。可以使用在本領域公知的任何固定化酶的方式。例如，可以將酶直接結合到具有一個或多個官能團的膜、顆粒劑或樹脂類等物質上，也可以通過具有一個或多個官能團的橋連化合物(如戊二醛)將酶連接到樹脂上。在如《微生物酶和生物技術》第二版(Elsevier Applied Science 1990；W.M.Fogarty和C.T.Kelly，編)的369-394頁中描述了這樣的酶固定化方式。
下列實施例進一步說明了本發明。
實施例1左旋二酮還原酶的製備所有操作均在4℃下進行，除非特別指出，所有緩衝液是包含0.1mM二硫蘇糖醇的10mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)。(1)水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6488)的培養將瓊脂板上的水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6488)的一個菌落接種入試管中含D-葡萄糖(1％)、KH2PO4(0.3％)、MgSO4·7H2O(0.02％)、蛋白腖(1.5％)、NaCl(0.2％)和酵母提取物(0.1％)的5ml培養基(pH 7.0)中，並在30℃下培養20小時。將培養物接種入2升坂口氏燒瓶中的500ml與上述培養基相同的培養基中，並在30℃下培養20小時。將250ml的種子培養物接種入發酵罐MSJ-U3W(Marubishi Bioengineering，2-20-15，Higashikanda，Chiyoda-ku，東京，日本)中20升相同培養基中。在20升/分的通風速率和300轉/分的攪動下在30℃培養20小時。將這樣獲得的培養物於4℃下以8,000轉/分離心20分鐘。總共獲得了133.8g的溼細胞。(2)無細胞提取物的製備將溼細胞(30g)懸浮在90ml的緩衝液中，使用Kubota Insonator 201超聲波器(Kubota，3-29-9 Hongo，Bunkyo-ku，東京，日本)在190W下超聲波處理1小時。超聲波處理後，將樣品以16,000轉/分離心20分鐘。結果得到了80ml包含2,444mg蛋白質的無細胞提取物。(3)硫酸銨沉澱向上一步驟中獲得的無細胞提取物(80ml)中添加硫酸銨直至飽和濃度的60％。然後通過離心收集形成的沉澱，將其溶解在15ml緩衝液中，對5升緩衝液透析四次。在該溶液中總酶活性為38.8單位。(4)二乙基氨基乙基(下文稱為DEAE)-Sephacel柱層析將上述製備的透析樣品加入已用緩衝液平衡的DEAE-Sephacel柱(直徑2.8cm，高度18cm；Amersham Pharmacia Biotech)中。在用相同緩衝液清洗柱後，用600ml線性梯度的NaCl(0-0.8M)洗脫所述酶。收集活性級分並通過超濾(超濾器YM-10，Amicon濃縮器(Amicon公司，Beverly，MA 01915，美國))濃縮至10ml。(5)烷基Superose柱層析向上一步製備的樣品添加(NH4)2SO4至2M的最終濃度，過濾混合物。用含2M(NH4)2SO4的緩衝液平衡烷基Superose 10/10柱(直徑1cm，高度10cm；Amersham Pharmacia Biotech)，然後加入上述樣品。用150ml線性梯度的緩衝液[2-0MO(NH4)2SO4]洗脫所述酶。收集活性級分並對5升緩衝液透析四次。(6)MONO Q HR5/5柱層析將上一步的透析樣品添加進已用緩衝液平衡的MONO Q HR5/5柱(直徑5mm，高度5cm；Amersham Pharmacia Biotech)中。用21ml線性梯度的NaCl(0-0.8M)洗脫所述酶。由於該層析之前透析過程中酶的失活，酶的比活性並沒有增加。但酶在SDS-PAGE分析中為一條均一帶。
該酶的純化步驟的概要如表7所示。
表7
(7)反應產物的鑑別將包含50mg NADH、833μl 1M磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)、2ml得自DEAE-Sephacel柱層析純化步驟的酶樣品以及550μl蒸餾水的反應混合物(3.33ml)在30℃下溫育。以6分鐘的時間間隔五次向該反應混合物中添加10μl 0.5M左旋二酮溶液。將反應混合物再溫育5分鐘，然後用1ml乙酸乙酯提取。用氣相色譜[柱HR-20M(Shinwa，50 Keisho-Machi，Fushimi-ku，Kyoto-shi，東京，日本)，0.25mm直徑×30m，柱溫160℃(恆定)，注射器溫度250℃，載氣He(大約1ml/分鐘)]分析提取物。結果表明與放線醇的標準樣品相比，可以確定該產品是放線醇。當用NADPH替換NADH時，僅檢測到痕量的放線醇。
權利要求
1.一種左旋二酮還原酶，該酶具有下列理化性質a)分子量142,000-155,000±10,000，由四個分子量為36,000±5,000的相同亞基組成b)輔因子煙醯胺腺嘌呤二核苷酸，即NAD/NADHc)底物特異性對左旋二酮具有活性d)最適溫度在pH7.0時為15-20℃e)最適pH7.5f)激活劑K+、Cs+、Rb+、Na+和NH4+
2.根據權利要求1的左旋二酮還原酶，該酶源於屬於棒桿菌屬的微生物，該微生物能產生具有權利要求1所定義的理化性質的左旋二酮還原酶。
3.根據權利要求2的左旋二酮還原酶，其中所述的微生物是水生棒桿菌AKU611，保藏號FERM BP-6448，或其功能等同物、傳代培養物、突變體、變種。
4.一種生產左旋二酮還原酶的方法，該酶具有下列理化性質a)分子量142,000-155,000±10,000，其由四個分子量為36,000±5,000的相同亞基組成b)輔因子煙醯胺腺嘌呤二核苷酸，即NAD/NADHc)底物特異性對左旋二酮具有活性d)最適溫度在pH7.0時為15-20℃e)最適pH7.5f)激活劑K+、Cs+、Rb+、Na+和NH4+該方法包括在液體營養培養基中、好氧條件下培養屬於棒桿菌屬的、能產生具有上述理化性質的左旋二酮還原酶的微生物，破壞所述微生物的細胞，從所破壞的微生物細胞的無細胞提取物中分離並純化左旋二酮還原酶。
5.根據權利要求4的方法，其中所述的微生物是水生棒桿菌AKU611，保藏號FERM BP-6448，或其功能等同物、傳代培養物、突變體、變種。
6.一種從左旋二酮生產放線醇的方法，該方法包括將左旋二酮(i)在還原形式的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸存在下與具有下列理化性質的左旋二酮還原酶接觸a)分子量142,000-155,000±10,000，其由四個分子量為36,000±5,000的相同亞基組成b)輔因子煙醯胺腺嘌呤二核苷酸，即NAD/NADHc)底物特異性對左旋二酮具有活性d)最適溫度在pH 7.0時為15-20℃e)最適pH7.5f)激活劑K+、Cs+、Rb+、Na+和NH4+或者與(ii)所述微生物的無細胞提取物接觸，然後在每種情況下從反應混合物中分離形成的放線醇。
7.根據權利要求6的方法，其中所述的微生物是水生棒桿菌AKU611，保藏號FERM BP-6448，或其功能等同物、傳代培養物、突變體、變種。
全文摘要
本發明提供了一種具有下列理化性質的左旋二酮還原酶:分子量:142,000—155,000±10,000,由四個分子量為36,000±5,000的相同亞基組成。輔因子:煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH);底物特異性;對左旋二酮具有活性;最適溫度:在pH7.0時為15—20℃;最適pH:7.5;激活劑:K
文檔編號C12P41/00GK1269406SQ00101828
公開日2000年10月11日 申請日期2000年2月1日 優先權日1999年2月1日
發明者S·中森, S·清水, M·和田 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司