一種菸草鎘轉運基因NtHMA2及其克隆方法與應用的製作方法

2024-03-02 16:28:15

一種菸草鎘轉運基因NtHMA2及其克隆方法與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了菸草鎘轉運基因NtHMA2及其克隆方法與應用，菸草鎘轉運基因NtHMA2核苷酸序列如SEQID：No.1所示，編碼的胺基酸序列如SEQID：No.2所示。本發明還公開了菸草鎘轉運基因NtHMA2的克隆方法，具體步驟包括：A、確定NtHMA2基因序列；B、提取菸草RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA；C、根據NtHMA2基因序列設計合成特異性引物，以cDNA作為模板，進行PCR擴增；D、回收和純化PCR產物；E、純化產物與載體連接，轉化感受態細胞；F、篩選陽性克隆，對陽性克隆PCR擴增、測序。通過調控菸草鎘轉運基因NtHMA2的表達，可降低鎘從菸草根部轉運到葉片的轉運率，從而降低菸葉的鉻含量，為生產綠色優質菸葉提供了基因資源。
【專利說明】一種菸草鎘轉運基因NtHMA2及其克隆方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於遺傳工程【技術領域】，具體涉及菸草鎘轉運基因NtHMA2及其克隆方法與應用。
【背景技術】
[0002]菸草0Vicoiia/?a iaAacw?)是重要的經濟作物,是爺科一年生草本植物。菸草屬大約有60多種。重金屬鎘是菸草生長的非必須元素，但容易被吸收，並且通過食物鏈對人體產生危害。鎘隨水灌溉和汙泥進入土壤中，被土壤吸附的鎘一般在(Tl5cm的表層土壤中積累。土壤中過量的鎘，不僅能在菸草體內殘留，而且也會對菸草的生長發育起明顯的危害作用，破壞葉綠體結構，降低葉綠素含量，葉片發黃，光合過程的減弱，生長緩慢，植株矮小，根系受到抑制，生長受阻，產量下降。鎘汙染對菸草種子出苗、菸草光合特性、菸草體內礦質元素含量、菸草組織結構、菸草酶活性、菸草生長量和菸葉品質均有較大影響。
[0003]Cd2+的吸收主要是通過一些對Cd2+具有低親和性的多底物金屬離子轉運蛋白或通道蛋白進入植物細胞內。例如，小麥的LCTI蛋白在釀酒酵母中表達能夠介導Cd2+流入細胞內，並使酵母細胞對Cd2+高度敏感，這種Cd2+高度敏感性可能是由於LCTI蛋白對Cd2+吸收所造成的。另外，金屬轉運蛋白的Nramp家族也具有能夠將Cd2+轉運至植物細胞內的功能。釀酒酵母Nramp家族成員SMFl和SMF2蛋白不但能夠轉運Mn2+而且能夠轉運Cu2+、Co2+和Cd2+。目前研究表明 ，鎘元素從地下部向地上部的轉運是藉助於膜轉運蛋白進行的，例如Pib型ATPase亞家族成員HMA。HMA蛋白家族可以根據轉運功能分為兩類，即Cu/Ag轉運泵和Zn/Cd/Co/Pb轉運泵。擬南芥AtHMA2蛋白屬於Zn/Cd/Co/Pb轉運泵。
[0004]國際上一些知名菸草公司和研究機構正採用生物技術和基因工程技術對菸草品種進行改良，以提高菸草對鎘的抗性，減少菸草對土壤鎘的吸收和轉運。目前，我國也提出了無公害優質煙的開發計劃，為菸草重金屬危害的研究提供了新的契機。隨著菸草鎘汙染研究的深入，必將使我國菸草鎘汙染控制邁上了新的臺階，為我國菸葉的健康和可持續發展奠定基礎。因此，開發一種利用生物技術手段降低菸草鎘轉運率(葉片鎘含量/根鎘含量)的候選基因，通過基因操作減少菸葉鎘含量是非常必要的。

【發明內容】

[0005]本發明的第一目的在於提供一種菸草鎘轉運基因NtHMA2 ;本發明的第二目的在於提供所述菸草鎘轉運基因NtHMA2的克隆方法；本發明的第三目的在於提供所述菸草鎘轉運基因NtHMA2的應用。
[0006]本發明的第一目的是這樣實現的，所述的菸草鎘轉運基因NtHMA2核苷酸序列為SEQ ID:N0.1 所示。
[0007]本發明的第二目的是這樣實現的，所述菸草鎘轉運基因NtHMA2的克隆方法包括以下步驟:
A、確定NtHMA2基因序列；B、提取菸草RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA；
C、根據NtHMA2基因序列設計合成特異性引物，以cDNA作為模板，進行PCR擴增；
D、回收和純化PCR產物；
E、純化產物與載體連接，轉化感受態細胞；
F、篩選陽性克隆，對陽性克隆PCR擴增、測序。
[0008]本發明的第三目的是這樣實現的，所述的菸草鎘轉運基因NtHMA2用於降低鎘從菸草根部轉運到菸葉的轉運率。
[0009]本發明利用RACE技術從菸草中得到一個菸草鎘轉運基因NtHMA2，具體步驟為:利用同源基因擬南芥At HMA2序列搜索NCBI菸草EST資料庫，得到菸草NtHMA2的EST序列(NCBI號:FG135138.1);利用此序列比對菸草基因組資料庫(行業內部資料庫)，獲得一個基因序列(Nsyl0129220)，根據此序列設計RACE引物，RACE利用試劑盒Clontech SmartRACE cDNA Amplification Kit進行，反應參考試劑盒說明書；3』端擴增到600bp左右的片段，5』端擴增到500bp左右的片段；目標片段回收後進行測序，並與核心序列拼接獲得NtHMA2全長cDNA序列，設計基因特異引物進行PCR反應，得到目的產物；對目的產物測序，得到NtHMA2基因序列；利用農桿菌介導的遺傳轉化方法獲得NtHMA2基因的過表達和RNAi植株，對NtHMA2進行功能驗證，結果表明NtHMA2基因具有將鎘從菸草根部轉運到葉片的功能。NtHMA2基因的發現 ，為通過調控基因的表達，控制菸葉重金屬鎘含量，為生產綠色優質菸葉提供了基因資源。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為利用引物對NtHMA2F/NtHMA2R擴增財.之基因結果，擴增產物4242bp ；
圖2為pBI121-NtHMA2載體PCR鑑定，所用引物對為NtHMA2F/NtHMA2R，擴增產物為
4242bp ；
圖3為pBI121-NtHMA2載體酶切鑑定，利用BamHI和SacI雙酶切，可以獲得4000bp左右的目的條帶；
圖4為基因RNAi載體片段PCR擴增結果，所用引物對為HMARNAiF/HMARNAiR，擴增產物為369bp ；
圖5為RNAi載體pBI121-pQL1-NtHMA2的酶切驗證，XbalI和SacI雙酶切後可以將1500bp左右的反向重複單元切下；
圖6為NtHMA2 RNAi菸草植株鎘轉移率，Vector Control為轉空載體對照，其餘為轉基因植株；
圖7為過表達菸草植株鎘轉移率，Vector Control為轉空載體對照，其餘為轉基因植株。
【具體實施方式】
[0011]下面結合附圖對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基於本發明教導所作的任何變換或替換，均屬於本發明的保護範圍。
[0012]本發明所述的菸草鎘轉運基因NtHMA2核苷酸序列為SEQ ID:N0.1所示，編碼的胺基酸序列為SEQ ID:N0.2所不。[0013]所述的菸草鎘轉運基因NtHMA2來源於林菸草。
[0014]本發明所述所述的菸草鎘轉運基因NtHMA2的克隆方法，包括以下步驟:
A、確定NtHMA2基因序列；
B、提取菸草RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA；
C、根據NtHMA2基因序列設計合成特異性引物，以cDNA作為模板，進行PCR擴增；
D、回收和純化PCR產物；
E、純化產物與載體連接，轉化感受態細胞；
F、篩選陽性克隆，對陽性克隆PCR擴增、測序。
[0015]所述的步驟A包括如下步驟:(1)利用同源基因擬南芥At HMA2序列搜索NCBI菸草EST資料庫，得到菸草NtHMA2的EST序列(NCBI號:FG135138.1) ; (2)利用此序列比對菸草基因組資料庫(行業內部資料庫)，獲得一個基因序列(Nsyl0129220)，根據此序列設計RACE 引物;(3)RACE 利用試劑盒 Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit 進行，反應參考試劑盒說明書；3'端擴增到50(T700bp左右的片段，5'端擴增到40(T600bp左右的片段；(4)目標片段回收後進行測序，並與核心序列拼接獲得NtHMA2全長cDNA序列，設計基因特異引物進行PCR反應，得到目的產物；對目的產物測序，得到NtHMA2基因序列；其中，步驟(2)所述的RACE基因特異引物為:
3' RACE 基因特異引物:5' -AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA-3'；
5' RACE 基因特異引物:5' -CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA-3'
所述步驟C的特異性引物為:
正向引物 NtHMA2F: 5' -TCTTCTCCTCCTCCTTAGAGAAG-3'；
反向引物 NtHMA2R: 5' -CTACTCTATGACAATTTCTGATA-3'。
[0016]所述菸草鎘轉運基因NtHMA2的應用，主要通過調控該基因的表達，降低鎘從菸草根部轉運到菸葉的轉運率，從而降低菸葉中重金屬鎘的含量。
[0017]所述的降低鎘從菸草根部轉運到菸葉的轉運率的方法包括如下步驟:
A、構建RNAi載體；
B、農桿菌轉化；
C、RNAi載體導入菸草；
D、培養轉基因植株。
[0018]本發明的工作原理為利用RACE技術從菸草中得到一個菸草鎘轉運基因NtHMA2序列，具體步驟為:利用同源基因擬南芥At HMA2序列搜索NCBI菸草EST資料庫，得到菸草NtHMA2的EST序列(NCBI號:FG135138.1);利用此序列比對菸草基因組資料庫(行業內部資料庫)，獲得一個基因序列(Nsyl0129220)，根據此序列設計RACE引物，RACE利用試劑盒Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit進行，反應參考試劑盒說明書；3'端擴增至Ijeoobp左右的片段，5'端擴增到500bp左右的片段；目標片段回收後進行測序，並與核心序列拼接獲得NtHMA2全長CDNA序列，設計基因特異引物進行PCR反應，得到目的產物；對目的產物測序，得到NtHMA2基因序列，再對基因NtHMA2進行克隆，構建重組載體，利用農桿菌介導的遺傳轉化方法獲得NtHMA2基因的過表達和RNAi植株，對NtHMA2進行功能驗證，結果表明NtHMA2基因具有將鎘從菸草根部轉運到葉片的功能。理論上，可通過調控NtHMA2基因的表達，控制菸葉重金屬鎘含量，為生產綠色優質菸葉提供了基因資源。[0019]與現有技術相比，本發明具有以下優點和效果:
1、基因的克隆，為降低菸葉鎘含量分子育種提供新的基因資源，該基因資源的開發利用有利於生產低鎘含量菸草和實現綠色優質菸葉的開發。
[0020]2、通過農桿菌介導的遺傳轉化方法獲得該基因過表達和抑制表達的轉基因植株，經生物學功能驗證，表明本發明克隆的基因具有將鎘從菸草根部轉運到葉片的功倉泛。
[0021]實施例1——基因的分離克隆
利用同源基因擬南芥At HMA2序列搜索NCBI菸草EST資料庫，得到菸草NtHMA2的EST序列，具體步驟為:利用同源基因擬南芥At HMA2序列搜索NCBI菸草EST資料庫，得到菸草NtHMA2的EST序列(NCBI號:FG135138.1);利用此序列比對菸草基因組資料庫(行業內部資料庫)，獲得一個基因序列(Nsyl0129220)，根據此序列設計RACE引物，RACE利用試劑盒Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit進行，反應參考試劑盒說明書；3'端擴增至Ijeoobp左右的片段，5'端擴增到500bp左右的片段；目標片段回收後進行測序，並與核心序列拼接獲得NtHMA2全長CDNA序列，設計基因特異引物進行PCR反應，得到目的產物；對目的產物測序，得到NtHMA2基因序列；其中，RACE特異性引物為:
3' RACE 基因特異引物:5' -AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA-3'；
5' RACE 基因特異引物:5' -CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA-3' 測序得到新基因NtHMA2，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示，其中131~4342 bp為該基因的編碼區，包含4212bp的開放閱讀框；編碼1404個胺基酸，如序列表SEQIDN0.2所示。
[0022]提取林菸草根部RNA,抽提使用Trizol試劑盒(Invitrogen,按該試劑盒提供的說明書操作)。
[0023]取2 yg RNA進行反轉錄，利用 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA)試劑盒進行基因組DNA去除並反轉錄(按試劑盒操作手冊操作)。
[0024]將反轉錄得到的第一鏈cDNA作為模板，用於PCR擴增NtHMA2基因全長，並設計特性行引物如下:
正向引物:NtHMA2F:5' -TCTTCTCCTCCTCCTTAGAGAAG-3'；
反向引物:NtHMA2R: 5' -CTACTCTATGACAATTTCTGATA-3'。
[0025]PCR 反應體系為 50μ L，包括:200ng cDNA，I XPhusion HF 反應緩衝液，IOmMdNTP, 2U 的 Phusion? High-Fidelity DNA Polymerase,上述引物各 I μ M。PCR 反應在MastercycIer? pro (Eppendorf,德國)擴增儀上進行，反應程序為:98°C, 30 秒；98°C, 10秒，60°C，20秒，72°C，2分鐘，40個循環;72°C延伸7分鐘。
[0026]產物經1% (g/mL)的瓊脂糖凝膠電泳分離，擴增結果產生一條單一 PCR條帶，見圖1。用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN,德國)回收擴增條帶,提取步驟參照試劑盒使用說明。回收純化的DNA與Τ0Ρ0載體(Invitrogen ZERO Blunt T0P0 RCR Cloning kit)連接，按說明書操作。連接產物利用熱激法轉化大腸桿菌DH5，在含有50mg/L卡那黴素的LB固體平板中篩選陽性克隆，挑取5個克隆測序(大連寶生物工程有限公司)。
[0027]測序結果表明NtHMA2基因的全長為4489bp，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示，通過測序、比對確定是本發明需要的目的基因， 申請人:將該基因命名為NtHMA2。NtHMA2基因包括4212bp的開放閱讀框；編碼1404個胺基酸。推導的NtHMA2基因的胺基酸序列與擬南芥AtHMA2具有73%的相似性。
[0028]實施例2——植物轉化載體構建
(I)過表達載體構建
根據pBI121載體序列酶切位點，利用Primer Premier5.0軟體設計出構建NtHMA2基因過表達的引物對，其序列如下所示:
Forward primer:5/ -GGGTGGATCCTCTTCTCCTCCTCCTTAGAGAAG-3;
Reverse primer:5/ -TAATGAGCTCCTACTCTATGACAATTTCTGATA-3;
下劃線所示為酶切位點。
[0029]以基因陽性克隆DNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增體系激擴增程序同實例I。雙酶切體系:反應總體積為40 μ L，含PCR純化後的產物10 μ L，10ΧΝΕΒ Bufferl.14 μ L7BamHI和SacI各2 μ L，滅菌雙蒸水22 μ L。37°C酶切過夜後純化。pBI121載體的雙酶切體系:反應總體積為40μ L，含純化的pBI121質粒DNA IOyL, 10ΧΝΕΒ Bufferl.1 4μ L,BamHI和SacI各2 μ L，滅菌雙蒸水22 μ L。37°C酶切過夜後純化。
[0030]連接反應體系中NtHMA2基因與pBI121載體的摩爾比為5:1，反應總體積為
10μ L，其中:10Χ連接Buffer I μ L, T4 DNA連接酶I μ L，NtHMA2基因雙酶切片段6 μ L，pBI 121載體雙酶切片 段2 μ L。16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌菌種DH5a。
[0031]在含有卡那黴素(50mg/L)的LB固體培養基上篩選陽性克隆，抽提質粒後進行PCR(圖2)及酶切鑑定(圖3)。構建的載體命名為pBI121-NtHMA2。
[0032](2)抑制表達(RNAi)載體構建
以PQLi載體為中間載體，PBI121為表達載體構建LJ?基因的RNAi載體，構建引物
為:
HMARNAiF:CATTCTAGAGAGCTCGGATCC GAATCAAGCAAGATTAGAAGCA
HMARNAiR: TCAACTAGTGATATCCTCGAGAGTGATGACATAGCAGCAGT
HMARNAiF中下劃線分別為Xbal，SacI, BamHI酶切位點；HMARNAiR中下劃線分別為SpeI，EcoRV酶切位點。
[0033]以基因陽性克隆DNA為模板進行PCR擴增(結果見圖4)。PCR擴增體系激擴增程序同實例I。NtHMA2基因RNAi正向片段與pQLi載體連接:利用BamHI和EcoRV分別雙酶切純化的PCR產物和pQLi載體，反應體系同過表達載體的構建。酶切後回進行回收純化並進行連接。連接反應體系中RNAi正向片段和pQLi的摩爾比為5:1，反應程序同過表達載體構建部分。連接產物轉化大腸桿菌菌種DH5 α後提取質粒進行酶切鑑定。NtHMA2基因RNAi反向片段與連接有正向片段的pQLi載體連接=SacI和SpeI分別雙酶切RNAi反向片段與連接有正向片段的PQLi載體，酶切後回收純化並進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5a細胞，轉化子抽提後進行酶切驗證。構建的中間載體命名為pQL1-HMA2。
[0034]利用XbaI和SacI分別雙酶切pBI121和pQLi_HMA2載體，回收pBI121大片段和pQL1-HMA2載體酶切後1000bp左右的片段，進行連接。連接後轉化大腸桿菌DH5 α，抽提質粒進行酶切驗證(圖5)，程序同上。構建的載體命名為pBI121-pQL1-NtHMA2。
[0035]實施例3——菸草的遺傳轉化
(I)表達載體轉化農桿菌
利用凍融法(參照薩姆布魯克，拉塞爾著，黃培堂等譯，《分子克隆實驗指南》第三版，科學出版社,2002年)將重組載體pBI121-NtHMA2和pBI121-pQLi_NtHMA2轉入農桿菌軍中GV3101。
[0036]從-80°C冰箱中取出3管農桿菌感受態細胞，冰上溶解，分別加入重組表達載體pBI121-NtHMA2、pBI121_pQLi_NtHMA2 和 pBI121 空載體。
[0037] 將以上混合物放入液氮速凍I分鐘，轉入37°C水浴5分鐘。
[0038]相混合物中加入ImL LB培養基，28°C，220rpm培養3~4小時。
[0039]培養物塗布於含有卡那黴素(50mg/L)和利福平(25mg/L)的LB固體培養基上，28°C倒置培養2~3天。可見含有目的載體的克隆。
[0040](2)菸草轉化
挑取含有目標載體的農桿菌在含有卡那黴素和利福平的LB平板上劃線，28 °C培養2~3天。
[0041]刮取劃線菌斑接菌於含有卡那黴素和利福平的MS培養基中，28°C，220rpm震蕩培養，菌液濃度達到OD=0.5~0.8時進行侵染。
[0042]將菌體收集到離心管中，6，OOOrpm離心分鐘富集菌體，棄上清，再用約20ml液體
MS培養基重懸菌體。
[0043]將葉片置於500mL廣口瓶中，加入適量70%乙醇，漂洗lmin。；倒掉乙醇，加入
0.1% HgCl2溶液(稱取升汞0.1克，用少許酒精溶解，再加水至100毫升)，置搖床上室溫振蕩15~30分鐘；倒掉溶液，用無菌水衝洗6遍；將葉片取出，用滅菌吸水紙洗去表面液體，取無菌葉片用剪刀切成IcmX Icm的小片，將切成小片的植物葉片放入無菌MS液體培養基懸浮的菌液中，靜置15~20min。
[0044]取出材料，用無菌濾紙吸去多餘菌液，於共培養培養基中(MS+6-BA 1.0mg/L +NAA 0.lmg/L )，25°C暗培養兩天。
[0045]把材料轉入分化培養基中(MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.lmg/L+Kan 200mg/L + Carb(羧苄青黴素鈉)500mg/L),切口接觸培養基，於溫室中分化培養，每2-3周將其轉移到新的培養基中。切口處逐漸長出愈傷組織，最後分化出芽。
[0046]將長至3~5cm的芽切下，轉入生根培養基(MS)誘導生根。
[0047]生根後的轉基因植株由生根培養基中取出，用自來水淨培養基，移植於滅菌的營養土中。
[0048]轉基因植株經NPTII基因特異引物PCR驗證擴增，鑑定轉基因陽性植株。
[0049]實施例4——轉基因植株鎘吸收試驗
轉基因植株移栽到一次性花盆後，置於育苗池中，育苗池內IOcm左右含的水(含4ppm氯化鎘)。
[0050]生長30天後，取轉基因植株葉片和根，60°C烘乾，測定鎘含量，計算轉基因植株鎘轉移率(葉片鎘含量/根鎘含量)，結果見圖6、圖7。RNAi植株NtHMA RNAi_6、NtHMARNA1-4KNtHMA RNA1-43鎘轉移率比空載體對照Vector Control降低50%以上。NtHMA2過表達植株 NtHMA20E-5、NtHMA20E_6、NtHMA20E-19 鎘轉移率比空載體對照 Vector Control提高2倍以上，尤其NtHMA20E-19比對照提高5倍以上。上述結果表明，NtHMA2基因負責菸草鎘從根部向葉片的運輸。通過對該基因的遺傳操作，可以降低菸草葉片鎘含量。
【權利要求】
1.一種菸草鎘轉運基因NtHMA2，其特徵在於所述的菸草鎘轉運基因NtHMA2核苷酸序列如SEQ ID:N0.1所示。
2.根據權利要求1所述的菸草鎘轉運基因NtHMA2，其特徵在於所述基因編碼的胺基酸序列如SEQ ID:N0.2所示。
3.一種權利要求1所述的菸草鎘轉運基因NtHMA2的克隆方法，其特徵在於包括以下步驟: A、確定NtHMA2基因序列； B、提取菸草RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA； C、根據NtHMA2基因序列設計合成特異性引物，以cDNA作為模板，進行PCR擴增； D、回收和純化PCR產物； E、純化產物與載體連接，轉化感受態細胞； F、篩選陽性克隆，對陽性克隆PCR擴增、測序。
4.根據權利要求3所述的菸草鎘轉運基因NtHMA2的克隆方法，其特徵在於所述的步驟A包括如下步驟: (1)利用同源基因擬南芥AtHMA2序列搜索NCBI菸草EST資料庫，得到菸草NtHMA2的EST序列；利用此序列比對菸草基因組資料庫，獲得一個基因序列(Nsyl0129220)，根據此序列設計 RACE 引物,RACE 利用試劑盒 Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit 進行，反應參考試劑盒說明書，3'端擴增到50(T700bp的片段，5'端擴增到40(T600bp的片段； (2)目標片段回收後進行測序，並與核心序列拼接獲得NtHMA2全長cDNA序列，設計基因特異引物進行PCR反應，得到目的產物； (3)對目的產物測序，得到NtHMA2基因序列。
5.根據權利要求4所述的菸草鎘轉運基因NtHMA2的克隆方法，其特徵在於步驟(1)所述的特異性引物為: 3' RACE 基因特異引物:5' -AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA-3'； 5' RACE 基因特異引物:5' -CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA-3'。
6.根據權利要求3所述的菸草鎘轉運基因NtHMA2的克隆方法，其特徵在於步驟C所述的特異性引物為: 正向引物 NtHMA2F: 5' -TCTTCTCCTCCTCCTTAGAGAAG-3'； 反向引物 NtHMA2R: 5' -CTACTCTATGACAATTTCTGATA-3'。
7.—種權利要求1所述的菸草鎘轉運基因NtHMA2的應用，其特徵在於用於降低鎘從菸草根部轉運到菸葉的轉運率。
8.根據權利要求7所述的菸草鎘轉運基因NtHMA2的應用，其特徵在於所述的降低鎘從菸草根部轉運到菸葉的轉運率的方法包括如下步驟: A、構建RNAi載體； B、農桿菌轉化； C、RNAi載體導入菸草； D、培養轉基因植株。
9.根據權利要求8所述的菸草鎘轉運基因NtHMA2的應用，其特徵在於步驟A中所述的^0VMWN-11?-SIad Ss ?ν§
【文檔編號】C07K14/415GK103981194SQ201410254594
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月10日 優先權日:2014年6月10日
【發明者】李文正, 王丙武, 高玉龍, 宋中邦, 曾建敏, 張家瑞, 孔光輝, 李永平 申請人:雲南省菸草農業科學研究院