一種誘導菌劑及應用其緩解反芻動物瘤胃酸中毒的方法與流程

2024-02-28 15:31:15 2

本發明屬於應用微生物技術領域，具體涉及一種m.elsdeniilc1誘導菌劑及應用其緩解反芻動物瘤胃酸中毒的方法。

背景技術：

現代集約化反芻動物養殖過程中，為了追求高生產性能，通常過量使用穀物飼料作為反芻動物的飼糧。富含大量穀物的飼糧飼餵反芻動物一定程度上顯著地提高了其生產性能，但由於反芻動物瘤胃生理的特殊性，過量的穀物飼糧容易導致瘤胃微生物發酵失衡，具體表現為：乳酸等有機酸的大量產生與瘤胃微生物及瘤胃上皮的吸收失衡，有機酸在瘤胃中累積，引起瘤胃ph值降低，誘導酸中毒的發生。反芻動物瘤胃酸中毒能夠誘發蹄葉炎、瘤胃上皮脫落、拉稀等臨床症狀，如不能夠及時的發現並有針對性地治療，將會直接影響反芻動物的生產、繁殖及使用周期，造成直接經濟損失。

現有緩解瘤胃酸中毒的方法主要分為緩衝法鹽和微生物菌劑法。緩衝鹽法主要指的是通過飼餵小蘇打等弱鹼性類緩衝鹽，從而達到提高瘤胃ph的目的，短期內具有明顯的效果，但是並不能從本質上緩解酸中毒，因為並沒有起到減少有機酸的量或改變瘤胃有機酸組成模式的作用；微生物菌劑法主要指飼餵埃氏巨型球菌（megasphaeraelsdenii）等乳酸利用菌，從而達到調節瘤胃發酵模式，減少瘤胃乳酸累積，提高瘤胃ph，最終緩解瘤胃酸中毒的目的。但目前問題在於，目前市場上菌劑因為適應性差等原因造成使用效果不佳。為此開發高適應性m.elsdenii菌劑以緩解瘤胃酸中毒十分必要。

技術實現要素：

本發明的目的是通過對m.elsdeniilc1菌株進行低營養富集誘導，提高其適應性及乳酸分解能力，達到利用其緩解高澱粉飼糧誘導瘤胃酸中毒的目的，具體為一種高適應性m.elsdenii誘導及應用其緩解瘤胃酸中毒的方法。

本發明涉及的涉及菌株為atcc標準菌株，菌株號為：atcc25940，獲取網址為：https://www.atcc.org/products/all/25940.aspx

實現本發明目的的技術方案是：

一種m.elsdeniilc1誘導菌劑，所述菌劑的製備過程為：在厭氧工作站進行種子培養後，取出種子培養液，向高營養誘導培養基中直接接種種子培養液進行高營養富集誘導，後接種至中營養誘導培養基進行中營養富集誘導，最後接種至低營養誘導培養基進行低營養富集誘導，得到m.elsdeniilc1誘導菌劑；誘導過程中誘導罐密閉且無需通入其他氣體，以乳酸為發酵底物，進行底物不同乳酸濃度的梯度誘導，誘導全過程保持厭氧。

進一步地，所述種子培養過程為：取出凍存的m.elsdeniilc1菌株種子細菌液，以1%的接種量接種種子培養基，36~39℃厭氧培養，所述培養時間為8到10小時，待到種子培養基渾濁度od值為0.38~0.42時，取出種子培養液接種到新的種子培養基中繼續培養，所述培養時間為8到10小時，再次待到培養液渾濁度od值為0.38~0.42時，取出種子培養液進行高營養富集誘導。

更進一步地，所述種子培養基是以水為溶質，向其中加入質量比為1.0%胰蛋白腖，0.5%酵母提取物，0.5%牛肉提取物，0.5%葡萄糖，0.05%半胱氨酸鹽酸鹽，0.4%na2hpo4，5.0%無菌脫纖維馬血，0.002%d,l-乳酸，0.0005%刃天青。將配置的種子培養基液高溫105到110℃滅菌除氧後密封冷卻，調節ph為6.8到7.0。

進一步地，所述高營養誘導培養基是以水為溶質，向其中加入質量比為0.1%胰蛋白腖，0.1%酵母提取物，0.06%半胱氨酸鹽酸，0.09%k2hpo4，0.09%kh2po4，0.18%nacl，0.024%cacl·2h2o，0.083%mgso4·7h2o，0.18%(nh3)2so4，3.0%胎牛血清，0.3%葡萄糖及0.36%d,l-乳酸。將配置的發酵產酸培養基液在105到110℃高溫滅菌10分鐘除氧後密封冷卻，調節ph為6.7到7.0。

進一步地，所述中營養誘導培養基是以水為溶質，向其中加入質量比為0.1%胰蛋白腖，0.1%酵母提取物，0.06%半胱氨酸鹽酸，0.09%k2hpo4，0.09%kh2po4，0.18%nacl，0.024%cacl·2h2o，0.083%mgso4·7h2o，0.18%(nh3)2so4及0.18%d,l-乳酸。將配置的發酵產酸培養基液在105到110℃高溫滅菌10分鐘除氧後密封冷卻，調節ph為6.7到7.0。

進一步地，所述低營養誘導培養基是以水為溶質，向其中加入質量比為0.1%胰蛋白腖，0.1%酵母提取物，0.06%半胱氨酸鹽酸，0.09%k2hpo4，0.09%kh2po4，0.18%nacl，0.024%cacl·2h2o，0.083%mgso4·7h2o，0.18%(nh3)2so4及0.09%d,l-乳酸。將配置的發酵產酸培養基液在105到110℃高溫滅菌10分鐘除氧後密封冷卻，調節ph為6.7到7.0。

進一步地，所述高營養富集誘導是將種子培養液以0.3%到1%的量接種到高營養誘導培養基，誘導水浴溫度控制為37℃到39℃，無需通入特殊氣體，設置培養液攪拌速度為100到200rpm，誘導生長18到24小時後取菌液接種至一新高營養誘導培養基，如此往復3到4次後，取出誘導菌液進行中營養富集誘導。

進一步地，所述中營養富集誘導是將高營養誘導菌液以0.5%到1%的量接種到中營養誘導培養基，誘導水浴溫度控制為37℃到39℃，無需通入特殊氣體，設置培養液攪拌速度為100到200rpm，誘導生長20到26小時後取菌液接種至一新中營養誘導培養基，如此往復3到4次後，取出誘導菌液進行低營養富集誘導。

進一步地，所述低營養富集誘導是將中營養誘導菌液以1%到2%的量接種到低營養誘導培養基，誘導水浴溫度控制為37℃到39℃，無需通入特殊氣體，設置培養液攪拌速度為100到200rpm，誘導生長24到30小時後取菌液接種至一新中營養誘導培養基，如此往復5到7次後，得到m.elsdeniilc1誘導菌劑。

本發明還提供一種應用上述m.elsdeniilc1誘導菌劑緩解瘤胃酸中毒的方法。

具體包括以下步驟：

取出m.elsdeniilc1誘導菌劑進行瘤胃灌注，選擇8隻成年幹奶期薩能奶山羊，採用自身對照試驗設計，設置對照期、酸中毒誘導期及m.elsdenii菌液灌注期共3期試驗。於每日08:00和20:00對時飼喂。對照期飼餵含20%破碎玉米及80%燕麥草的tmr飼糧。誘導期飼餵含50%破碎玉米及50%燕麥草的tmr飼糧。灌注期飼糧同誘導期，並於飼餵前通過瘤胃瘻管灌注200ml低營養富集菌液（灌注過程15s內完成）。對照期連續飼餵9d後於第10天採集樣品。誘導期設置為10天。其中，前3天飼糧破碎玉米比例從20%提升至50%，隨後連續飼餵7天，於第7天採集樣品。灌注期設置為10天並於第10天採集樣品。採樣時間設置為08:00起（第一次採樣為飼餵前）每隔1.5h通過瘤胃瘻管採集瘤胃腹囊瘤胃液5ml用以測定ph，每隔3.0h通過瘤胃瘻管採集瘤胃腹囊瘤胃液20ml用以測定瘤胃液相關指標。

本發明的有益效果在於提供了一種利用m.elsdeniilc1菌株誘導產生高適應性及乳酸分解能力，從而緩解瘤胃酸中毒的方法。從菌株的種子培養到誘導全程保持厭氧，步驟簡單，操作方便，誘導過程中不需要進行特殊氣體的補充，以乳酸為唯一碳源，節約了生產成本並能夠獲得較高適應性及乳酸分解能力的m.elsdeniilc1菌株，瘤胃灌注酸中毒反芻動物，緩解瘤胃酸中毒，具有重大的生產實踐應用價值及經濟效益。

附圖說明

圖1瘤胃灌注低營養富集m.elsdenii菌液對瘤胃液ph變化的影響（●對照期，■sara期，▲灌菌期）。

圖2瘤胃灌注低營養富集m.elsdenii菌液對瘤胃液乳酸濃度的影響（●對照期，■sara期，▲灌菌期）。

圖3瘤胃灌注低營養富集m.elsdenii菌液對瘤胃液lps濃度的影響（●對照期，■sara期，▲灌菌期）。

具體實施方式

本實施例說明利用m.elsdeniilc1菌株進行低營養誘導富集，瘤胃瘻管灌注高澱粉飼糧飼餵下的酸中毒山羊。

實施例1：製備種子培養基

種子培養基：以水為溶質，向其中加入質量比為1.0%胰蛋白腖，0.5%酵母提取物，0.5%牛肉提取物，0.5%葡萄糖，0.05%半胱氨酸鹽酸鹽，0.4%na2hpo4，5.0%無菌脫纖維馬血，0.002%d,l-乳酸，0.0005%刃天青。將配置的種子培養基液高溫110℃滅菌除氧後密封冷卻，調節ph為7.0。

實施例2：製備高營養富集誘導培養基

高營養富集誘導培養基：以水為溶質，向其中加入質量比為0.1%胰蛋白腖，0.1%酵母提取物，0.06%半胱氨酸鹽酸，0.09%k2hpo4，0.09%kh2po4，0.18%nacl，0.024%cacl·2h2o，0.083%mgso4·7h2o，0.18%(nh3)2so4，3.0%胎牛血清，0.3%葡萄糖及0.36%d,l-乳酸。將配置的發酵產酸培養基液在110℃高溫滅菌10分鐘除氧後密封冷卻，調節ph為7.0。

實施例3：製備中營養富集誘導培養基

中營養富集誘導培養基：以水為溶質，向其中加入質量比為0.1%胰蛋白腖，0.1%酵母提取物，0.06%半胱氨酸鹽酸，0.09%k2hpo4，0.09%kh2po4，0.18%nacl，0.024%cacl·2h2o，0.083%mgso4·7h2o，0.18%(nh3)2so4及0.18%d,l-乳酸。將配置的發酵產酸培養基液在110℃高溫滅菌10分鐘除氧後密封冷卻，調節ph為7.0。

實施例4：製備低營養富集誘導培養基

低營養富集誘導培養基：以水為溶質，向其中加入質量比為0.1%胰蛋白腖，0.1%酵母提取物，0.06%半胱氨酸鹽酸，0.09%k2hpo4，0.09%kh2po4，0.18%nacl，0.024%cacl·2h2o，0.083%mgso4·7h2o，0.18%(nh3)2so4及0.09%d,l-乳酸。將配置的發酵產酸培養基在110℃高溫滅菌10分鐘除氧後密封冷卻，調節ph為7.0。

實施例5：

一種m.elsdeniilc1誘導菌劑，所述菌劑的製備過程為：

1）種子培養：培養過程為將凍存的的m.elsdeniilc1菌株接種到種子培養基中，36℃培養8小時後，待到種子培養基渾濁度od達到0.38時，移取1ml接種到10ml新的種子培養基中，繼續培養10小時，待到種子培養基渾濁度od達到0.42時，取出種子培養液進行誘導富集。

2）誘導富集步驟為：首先向高營養培養基中接種1%上述種子培養液（處於對數生長期，od為0.42）。培養15h後吸取2ml培養液接種於一新高營養培養基中（實施例2培養基），如此反覆3次；取最後一次高營養富集菌液2ml接種於一中營養培養基（實施例3培養基）中，培養20h後吸取2ml培養液接種於一新中營養培養基中，如此反覆3次；取最後一次中營養富集菌液2ml接種於一低營養培養基（實施例4的培養基）中，培養24h後吸取2ml培養液接種於一新低營養培養基中，如此反覆5次並將最後一次菌液保留，得到m.elsdeniilc1誘導菌劑，用於瘤胃灌注。整個富集培養過程在恆溫震蕩搖床中進行，溫度設置為37℃，震蕩轉速為160rpm/min。

實施例6

灌注試驗設計：選擇8隻成年幹奶期薩能奶山羊，採用自身對照試驗設計，設置對照期、酸中毒誘導期及m.elsdenii菌液灌注期共3期試驗。於每日08:00和20:00對時飼喂。對照期飼餵含20%破碎玉米及80%燕麥草的tmr飼糧。誘導期飼餵含50%破碎玉米及50%燕麥草的tmr飼糧。灌注期飼糧同誘導期，並於飼餵前通過瘤胃瘻管灌注200ml低營養富集菌液（灌注過程15s內完成）。對照期連續飼餵9d後於第10天採集樣品。誘導期設置為10天。其中，前3天飼糧破碎玉米比例從20%提升至50%，隨後連續飼餵7天，於第7天採集樣品。灌注期設置為10天並於第10天採集樣品。採樣時間設置為08:00起（第一次採樣為飼餵前）每隔1.5h通過瘤胃瘻管採集瘤胃腹囊瘤胃液5ml用以測定ph，每隔3.0h通過瘤胃瘻管採集瘤胃腹囊瘤胃液20ml用以測定瘤胃液相關指標（採集過程30s內完成）。

指標測定方法及結果：利用ph計（sevenexcellence，inlabroutinepro-ismmeter，mettler-toledo，瑞士）測定瘤胃液ph值，根據各時間點ph變化繪製ph變化曲線。結果表明，相較高澱粉飼糧誘導的酸中毒組，灌注低營養富集誘導m.elsdenii菌液顯著提高了瘤胃液ph（圖1）。

取1ml瘤胃液，10000rpm/min室溫離心5min後吸取上清液，濃鹽酸滴定ph至2.5，後用0.22um水相濾膜過濾，保留濾過液用以測定有機酸。通過高效液相色譜（hplc，lc-15c，shimadzu，日本）測定瘤胃液有機酸含量。選用有機酸色譜柱（pn.062902，thermo，美國），檢測選擇紫外檢測器（uv210nm），柱箱溫度設置為30℃，流動相（100mm/lna2so4，甲磺酸校正ph至2.65）流速為0.6ml/min。結果表明，相較高澱粉飼糧誘導的酸中毒組，灌注低營養富集誘導m.elsdenii菌液顯著降低了瘤胃液乳酸濃度（圖2）。

取1ml瘤胃液隨即室溫10000rpm/min離心5min，收集上清液，後用去內毒素水梯度稀釋樣品10000倍，用於測定瘤胃液內毒素（lps）含量。測定選用顯色基質鱟試劑盒（pn.ce80545，廈門鱟試劑），測定步驟參照說明書進行。結果表明，相較高澱粉飼糧誘導的酸中毒組，灌注低營養富集誘導m.elsdenii菌液顯著降低瘤胃液游離lps濃度（圖3）。