麻瘋樹籽粕毒蛋白的製備方法

2024-02-28 12:53:15

專利名稱：麻瘋樹籽粕毒蛋白的製備方法
技術領域：
本發明涉及蛋白分離和純化領域，具體涉及一種製備麻瘋樹籽粕毒蛋白的方法。
背景技術：
腫瘤是嚴重危害人類健康的惡性疾病，我國每年死於腫瘤疾病的患者有100多萬人，目前，已成為我國城市人口死亡的首要因素。抗腫瘤藥物市場是僅次於心血管和中樞神經系統藥物市場的全 球第三大藥物市場，目前發展迅速，2007年全球銷售額為400億美元， 2010年預期將增至600億美元，年增長率逾10 %，在中國更是以17 %的速度增長，而我國抗腫瘤藥物市場的增速一直高於醫藥行業的增速，預計未來我國抗腫瘤行業複合增長率將為 26%。儘管抗腫瘤藥物的市場需求大，然而，大多數化療藥屬合成化合物，靶向性和殺傷性差，篩選周期的長、耗資巨大、成功率極低、開發難度增加。同時，人們經受多次藥害之後，力口深了對化學合成藥物毒副作用的認識，更加崇尚回歸自然的抗腫瘤藥物。可見，高選擇性、 高效、低毒的新型抗腫瘤藥物的研發麵臨歷史性的重大機遇。生物毒素是自然進化的產物，其毒性遠較非生物毒素強。其結構和種類多樣，往往具有特異活性和高選擇性。目前，生物毒素已成為抗腫瘤重要新藥來源，如紫杉醇、長春鹼等植物毒素表現出良好的抗腫瘤活性。麻瘋樹(Jatropha curcas L.)也叫小桐子、膏桐，是我國南方山區民間應用的一種木本油料樹種，其種子含油量豐富，達到種子重量的52%，種仁的60%。種子油的理化特性與柴油接近，是製備生物柴油的理想原料。據了解，「十一五」期間，我國規劃生物柴油原料林基地建設規模83. 91萬公頃，原料林全部進入結實期後，將形成年產生物柴油125萬多噸的原料供應能力。目前，已有一些頗具實力的企業和國外大型能源企業，進入麻瘋樹生物柴油這一領域，在各地籌建起有相當規模的生物柴油生產企業，預計未來全國麻瘋樹種植面積至少可達3000萬畝以上，到 2017年將生產出麻瘋樹粕160Mt (核仁完全脫脂後粗蛋白含量達53 % 63 %，其中含90 % 的真蛋白)。麻瘋樹籽粕毒蛋白curcin是一種核糖體失活蛋白(RIPs)，已有研究報導，麻瘋樹籽粕毒蛋白curcin也是一種生物毒素，其佔麻瘋樹籽粕總蛋白的1. 5% 3%左右。把瘋樹籽粕毒蛋白curcin作為導向藥物製備免疫毒素並將它應用到腫瘤治療方面，將是麻瘋樹籽粕毒蛋白curcin研究的熱點。因此，隨著對麻瘋樹籽粕毒蛋白curcin抗腫瘤活性研究的不斷深入，麻瘋樹籽粕毒蛋白curcin將成為人類向腫瘤挑戰的有力武器之一，具有無限的發展前景。但是，目前製備麻瘋樹籽粕毒蛋白curcin主要在實驗室的微量、耗時及費用高的提取階段，不能滿足大規模的工業化生產要求。

發明內容
本發明的目的在於提供一種製備麻瘋樹籽粕毒蛋白的方法，能夠對麻瘋樹籽粕資源進行精深加工和綜合利用開發，其規模大、耗時短、成本低。本發明提供一種製備麻瘋樹籽粕毒蛋白的方法，包括如下步驟(1)將曬乾的麻瘋樹籽進行粉碎，獲得粉碎的麻瘋樹籽粕，其粉碎粒徑為 100 μ m 600 μ m。(2)將粉碎的麻瘋樹籽粕擠壓膨化預處理後，用正己烷進行脫脂，獲得脫脂麻瘋樹籽粕。(3)採用複合植物水解酶對脫脂麻瘋樹籽粕進行酶解，獲得的產物採用高溫澱粉酶進行酶解，然後離心取得沉澱。(4)按照固液質量比為1 5 1 30向步驟(3)所述沉澱中加入蛋白複合提取劑進行提取，除去殘渣後獲得麻瘋樹籽粕毒蛋白粗提液。(5)麻瘋樹籽粕毒蛋白粗提液分別通過截留分子量為30kDa和濃縮膜分子量為 20kDa的超濾膜，獲得分子量小於30kDa大於20kDa濃縮液，然後經脫鹽柱脫鹽、脫色後冷凍乾燥得到麻瘋樹籽粕毒蛋白。步驟(3)中所述複合植物水解酶的酶解條件為複合植物水解酶的加入量為所述脫脂麻瘋樹籽粕質量的2 % 5 %，酶解溫度400C 65°C，酶解的pH為4 6，酶解時間Ih 3h。所述高溫澱粉酶酶解條件為高溫澱粉酶的加入量為脫脂麻瘋樹籽粕質量的 1 % 4%，酶解溫度80°C 95°C，酶解的pH為5. 5 7. 5，酶解時間Ih 3h。最好是，所述植物複合水解酶與高溫澱粉酶的總質量為脫脂麻瘋樹籽粕質量的2. 5%，所述植物複合水解酶與高溫澱粉酶質量比2 1 ；植物複合水解酶酶解時間2h，酶解溫度為50°C，酶解pH 為4. 5 ；高溫澱粉酶酶解時間lh，酶解溫度為90°C，pH為7. 0。所述蛋白複合提取劑提取的條件是提取溫度為15°C 80°C，提取時間為 IOmin 180min，提取1 5次。所述沉澱在提取前，最好經過粉碎。優選的提取條件為提取溫度為60°C，提取時間為120min，沉澱粉碎後的粒度為60目，固液比為1 9。步驟(5)中的超濾條件為超濾時間為55min，超濾壓力為0. 14MPa，超濾溫度為 65°C，超濾液濃度為3mg/ml。本發明與現有的技術相比首先，以排渣法濃縮蛋白，提高原料的蛋白質含量，節省了大量蛋白質提取劑的使用量。其次，以超濾法濃縮麻瘋樹籽粕毒蛋白液。最後，通過大孔吸附樹脂進行脫鹽脫色純化麻瘋樹籽粕毒蛋白。其生產工藝簡單，變廢為寶，製備條件溫和，不涉及用強酸和強鹼對其進行處理，對環境友好。且原料來源廣泛、價格低廉，生產成本低，適於大規模的工業化生產。
具體實施例方式實施例1製備麻瘋樹籽粕毒蛋白粗提液的方法步驟與方法(1)將曬乾的麻瘋樹籽進行粉碎，獲得粉碎的麻瘋樹籽粕，其粉碎粒徑為 100ym~ 600ym, Mif^j 500 μ(2)將粉碎的麻瘋樹籽粕擠壓膨化預處理後，用正己烷進行脫脂，可以達到脫除麻瘋樹籽粕中脂溶性毒素，以獲得脫脂麻瘋樹籽粕。用正己烷脫脂的步驟將粉碎的麻瘋樹籽粕經擠壓膨化預處理後，一次取數克麻瘋樹籽粕放入自製的玻璃脫脂容器內，關閉玻璃脫脂容器下方的閥門，然後向其中加入正己烷，直至完全浸潤麻瘋樹籽粕，用保鮮膜封口，進行浸提麻瘋樹籽油。在此期間，不時按動容器下方的乳膠套，使容器內的麻瘋樹籽粕上下翻動；脫脂完全(索式法測定殘留脂肪含量為左右)後，將正己烷溶劑完全從容器下方閥門放出，然後把麻瘋樹籽粕從脫脂容器上方倒出，平鋪在白色方瓷盤(60CmX40Cm)上，放入通風櫥中脫除正己烷，12h後收集脫脂麻瘋樹籽粕。(3)採用複合植物水解酶對脫脂麻瘋樹籽粕進行酶解，獲得的酶解產物採用高溫澱粉酶進行酶解，然後離心取得沉澱。複合植物水解酶 的加入量為脫脂麻瘋樹籽粕質量的2% 5%，酶解溫度40°C 65°C，酶解的ph為4 6，酶解時間Ih 3h ；高溫澱粉酶的加入量為脫脂麻瘋樹籽粕質量的1 % 4%，酶解溫度80°C 95°C，酶解的ph為5. 5 7. 5，酶解時間Ih 3h ；離心轉速為 3800r/min 5000r/min,時間 IOmin 25min。通過比較不同酶解條件下得到的沉澱中的蛋白質含量、佛波酯的殘留情況，得出酶的投放量是脫脂麻瘋樹籽粕質量的2. 5%，植物複合水解酶與高溫澱粉酶質量比例 2 1、植物複合水解酶作用時間2h、溫度50°C、ph4. 5，高溫澱粉酶作用時間lh、溫度90°C、 Ph7. 0時脫脂麻瘋樹籽粕中蛋白質含量(凱式定氮測定)達到最高值75%左右、佛波酯不得檢出(高效液相測定，色譜柱為十八烷基矽烷鍵合矽膠填充柱(Spherisorb C18)，以磷酸溶液和乙腈為流動相)。其中，複合植物水解酶、高溫澱粉酶均來源於諾維信。(4)按照固液質量比為1 5 1 30向步驟(3)所述沉澱中加入蛋白複合提取劑進行提取，除去殘渣後獲得麻瘋樹籽粕毒蛋白粗提液。所述沉澱在採用蛋白複合提取劑提取前，最好粉碎。
提取溫度為15°C 80°C，提取時間為IOmin 180min，提取1 5次。採用真空過濾器或壓力過濾器除去殘渣，也可以採用離心法，離心力為IOOOg 15000g，獲得麻瘋籽
粕毒蛋白質粗提液。通過比較麻瘋樹籽粕毒蛋白粗提液中的毒蛋白提取率(高效液相定性定量檢測， 標準品來源於sigma公司)，得出了麻瘋樹籽餅粕中毒蛋白提取的最優工藝，即沉澱粉碎後的粒度為60目、提取時間120min、料液比1 9、提取溫度60°C。在此工藝下毒蛋白質提取率最高，達到90%左右。其中蛋白複合提取劑來源於北京天恩生物工程高新技術研究所。實施例2麻瘋樹籽粕毒蛋白粗提液中毒蛋白的分離純化方法麻瘋樹籽粕毒蛋白粗提液分別通過截留分子量為30kDa和濃縮膜分子量為20kDa 的超濾膜，獲得分子量小於30kDa大於20kDa濃縮液，然後經脫鹽柱(大孔樹脂，流速2mL/ min，溫度25°C )脫鹽、脫色後冷凍乾燥得到麻瘋樹籽粕毒蛋白。步驟1 超濾(1)單因素試驗將實施例1中得到的麻瘋樹籽粕毒蛋白粗提液分別通過截留分子量為30kDa、20kDa的超濾膜進行毒蛋白超濾分離試驗，試驗研究了不同的超濾壓力、時間、超濾溫度及超濾液濃度對麻瘋樹籽餅粕中毒蛋白質脫除的影響。通過單因素實驗試驗， 獲得較優的提取條件是超濾時間45min、超濾溫度45°C、壓力0. lOMPa，超濾液濃度5mg/ml，得到毒蛋白的透過率為70%左右，純度為75%。 (2)正交試驗以單因素實驗獲得的提取條件為基礎，選擇對麻瘋樹籽餅粕毒蛋白透過率影響較大的3個因素(超濾時間、溫度及超濾液濃度)進行L9(34)正交試驗，對分離工藝進行優化。得到超濾法分離麻瘋樹籽餅粕毒蛋白curcin的最優條件超濾時間為 55min、超濾壓力0. 14MPa、超濾溫度65°C、超濾液濃度3mg/ml。在此條件下，麻瘋樹籽餅粕中的毒蛋白透過率85%，純度為80%。步驟2 脫鹽、脫色後冷凍乾燥將分子量小於30kDa大於20kDa濃縮液經脫鹽柱(大孔樹脂，流速2mL/min，溫度 250C )脫鹽、脫色後冷凍乾燥得到麻瘋樹籽粕毒蛋白，其中毒蛋白含量達到95%。除去分子量小於30kDa大於20kDa的濃縮液，剩餘的超濾液，經脫鹽柱(大孔樹月旨，流速2mL/min，溫度25°C )脫鹽、脫色後冷凍乾燥得到麻瘋樹籽粕濃縮蛋白，可以作為飼料。
權利要求
1.一種製備麻瘋樹籽粕毒蛋白的方法，包括如下步驟(1)將曬乾的麻瘋樹籽進行粉碎，獲得粉碎的麻瘋樹籽粕，其粉碎粒徑為 οομπι 600 μ m0(2)將粉碎的麻瘋樹籽粕擠壓膨化預處理後，用正己烷進行脫脂，獲得脫脂麻瘋樹籽粕。(3)採用複合植物水解酶對脫脂麻瘋樹籽粕進行酶解，獲得的產物採用高溫澱粉酶進行酶解，然後離心取得沉澱。(4)按照固液質量比為1 5 1 30向步驟(3)所述沉澱中加入蛋白複合提取劑進行提取，除去殘渣後獲得麻瘋樹籽粕毒蛋白粗提液。(5)麻瘋樹籽粕毒蛋白粗提液分別通過截留分子量為30kDa和濃縮膜分子量為20kDa 的超濾膜，獲得分子量小於30kDa大於20kDa濃縮液，然後經脫鹽柱脫鹽、脫色後冷凍乾燥得到麻瘋樹籽粕毒蛋白。
2.根據權利要求1所述製備麻瘋樹籽粕毒蛋白的方法，其特徵在於步驟(3)中所述複合植物水解酶的酶解條件為複合植物水解酶的加入量為所述脫脂麻瘋樹籽粕質量的 2% 5%，酶解溫度40°C 65°C，酶解的pH為4 6，酶解時間Ih 3h。
3.根據權利要求1或2所述製備麻瘋樹籽粕毒蛋白的方法，其特徵在於步驟(3)所述高溫澱粉酶酶解條件為高溫澱粉酶的加入量為脫脂麻瘋樹籽粕質量的 4%，酶解溫度80°C 95°C，酶解的pH為5. 5 7. 5，酶解時間Ih 3h。
4.根據權利要求3所述製備麻瘋樹籽粕毒蛋白的方法，其特徵在於步驟(3)中所述植物複合水解酶與高溫澱粉酶的總質量為脫脂麻瘋樹籽粕質量的2. 5%，所述植物複合水解酶與高溫澱粉酶質量比2 1 ；植物複合水解酶酶解時間2h，酶解溫度為50°C，酶解pH為 4. 5 ；高溫澱粉酶酶解時間lh，酶解溫度為90°C，pH為7. 0。
5.根據權利要求4所述製備麻瘋樹籽粕毒蛋白的方法，其特徵在於所述蛋白複合提取劑提取的條件是提取溫度為15°C 80°C，提取時間為IOmin 180min，提取1 5次。
6.根據權利要求5所述製備麻瘋樹籽粕毒蛋白的方法，其特徵在於步驟(4)所述沉澱在提取前，經過粉碎。
7.根據權利要求6所述製備麻瘋樹籽粕毒蛋白的方法，其特徵在於提取條件為提取溫度為60°C，提取時間為120min，沉澱粉碎後的粒度為60目，固液比為1 9。
8.根據權利要求7所述製備麻瘋樹籽粕毒蛋白的方法，其特徵在於步驟(5)中的超濾條件為超濾時間為55min，超濾壓力為0. 14MPa，超濾溫度為65°C，超濾液濃度為3mg/ml。
全文摘要
本發明提供一種麻瘋樹籽粕毒蛋白的製備方法，涉及蛋白分離和純化領域。該製備方法為將麻瘋樹籽進行粉碎擠壓膨化預處理後，進行脫脂；採用複合植物水解酶對脫脂麻瘋樹籽粕進行酶解，然後採用高溫澱粉酶進行酶解，離心取得沉澱；向沉澱中加入蛋白複合提取劑進行提取，除去殘渣後獲得的麻瘋樹籽粕毒蛋白粗提液分別通過截留分子量為30kDa和濃縮膜分子量為20kDa的超濾膜，獲得分子量小於30kDa大於20kDa濃縮液，然後經脫鹽柱脫鹽、脫色後冷凍乾燥得到麻瘋樹籽粕毒蛋白。本發明節生產工藝簡單，變廢為寶，製備條件溫和，不涉及用強酸和強鹼對其進行處理，對環境友好，生產成本低，適於大規模的工業化生產。
文檔編號C07K1/36GK102260337SQ20101018076
公開日2011年11月30日 申請日期2010年5月24日 優先權日2010年5月24日
發明者姚新華, 姚陳名, 陳新華 申請人:丹陽市春潤生物能源有限公司