組織工程化移植物的處理方法

2024-04-06 04:16:05

專利名稱：：組織工程化移植物的處理方法
技術領域：
：本發明涉及醫學工程領域，尤其涉及組織工程化移植物的保存方法。技術背景組織工程移植物的產業化需要有大批量產品的生產和臨床使用，更重要的是，在組織缺損病人急需組織移植時，希望立即提供可移植的工程化產品。為了縮短工程化移植物構建過程所需的時間，儘快提供可供移植的缺損組織或部位的替代材料，必需解決組織工程化移植物的保存問題。根據保存溫度不同，保存方式可以分為常溫保存和低溫保存。對於有活性的組織工程產品，在其保存期間應儘量降低甚至關閉所有的生化反應，而溫度是控制生化反應的重要因素，降低儲存溫度可以極大地抑制組織內的生化反應。目前使用最多的低溫保存溫度是4t:和深低溫(-196°C)。4'C條件下，細胞內外僅存有少量生化反應，研究表明，4。C條件下，細胞的活性呈逐漸下降的趨勢，而且伴隨著細胞水腫、核固縮、空泡形成等形態學的改變。可見，4。C保存對細胞的活性還是有損傷，故臨床主要應用於短時間內(24小時內)保存組織和器官。在-196'C條件下，細胞內外的反應都會終止，但是由於低溫凍存操作相對複雜，對儀器以及凍存方案要求較高，而且在降溫過程中細胞內形成的冰晶會在降溫和復溫過程中對細胞造成冰晶損傷和溶質損傷，使其在組織和器官保存中的應用受到很大限制，其在組織工程領域的使用也只限於種子細胞凍存的研究階段，目前尚未組織工程複合物低溫凍存的研究和報導。在37t:下，細胞內大多數酶的活性都處於最高水平，各種酶促反應、氧化反應也最為活躍，細胞活性、功能都維持在相對較高水平。但由於新陳代謝旺盛，也會由此帶來在體外細胞、組織的活性不能較長時間地保持的問題。因此目前尚無理想的保存液與之配合，也沒有在此溫度下細胞、組織保存的研究報導。目前常用的組織、器官保存液有Euro-Collins液、SackII液、UV液等。主要用於4r下短時間內(24小時內)保存組織和器官，目前尚無保存液在常溫下或者37"C較長時間保存器官和組織。對於急需使用的移植物，如果仍然採用低溫或深低溫保存，不但耗時耗力、成本極高，而且會因為要經過復甦等過程給細胞帶來損傷。因此，本領域迫切需要一種可短期保存移植物的方法，它不會給移植物帶來損傷，而且可以保持其良好的生理性能，同時成本低廉且便於操作。
發明內容本發明旨在提供一種組織工程化移植物的處理方法。本發明的另一個目的是提供成骨誘導液或成軟骨誘導液的一種用途。在本發明的第一方面，提供了一種組織工程化移植物的處理方法，它包括步驟(a)在37土2'C將骨移植物或軟骨移植物和成骨誘導液或成軟骨誘導液放置在一容器中2小時一14天；和(b)從容器中取出骨移植物或軟骨移植物作為移植手術準備材料。在另一優選例中，所述骨移植物中單位體積中成骨樣組織佔30—80%;所述軟骨移植物中單位體積中成軟骨樣組織佔40—70%。在另一優選例中，步驟(a)中是將骨移植物或軟骨移植物和新鮮配製的成骨誘導液或成軟骨誘導液放置在一容器中2小時—14天，且不更換誘導液。在另一優選例中，步驟(a)中所述容器是密封容器。在另一優選例中，步驟(a)中是將骨移植物或軟骨移植物和新鮮配製的成骨誘導液或成軟骨誘導液放置在一容器中3—10天。在另一優選例中，步驟(a)中是將骨移植物或軟骨移植物和新鮮配製的成骨誘導液或成軟骨誘導液放置在一容器中4一7天。在另一優選例中，在所述步驟(a)前還包括步驟(a')移植物在誘導液中培養5—9天，每周換液2次。在另一優選例中，所述的骨移植物是骨髓基質幹細胞和人脫鈣骨複合物。在另一優選例中，所述的成骨誘導液中含有10±5nmol/L地塞米松，10±5nmol/LP—甘油磷酸鈉和50±20ymol/L2—磷酸抗壞血酸。在另一優選例中，所述的成骨誘導液中含有10土3nmol/L地塞米松，10±3nraol/LP—甘油磷酸鈉和50±10nmol/L2—磷酸抗壞血酸。在另一優選例中，步驟(a)中的容器由運輸工具由一地運送到另一地，所述的運輸工具包括汽車、輪船、火車和/或飛機;一地至另一地的距離在500米一10000公裡。在本發明的第二方面，提供了一種成骨誘導液或成軟骨誘導液在處理骨移植物或軟骨移植物中的應用。據此，本發明提供了一種可短期保存移植物的方法，它不會給移植物帶來損傷，而且可以保持其良好的生理性能，同時成本低廉且便於操作。圖1顯示了DNA檢測細胞在材料上增殖的情況。圖2顯示了ALP活性測定結果。圖3顯示了ALP比生成率結果。圖4顯示了OCN含量測定結果。圖5顯示了0CN比生成率結果。圖6顯示了葡萄糖代謝檢測結果。圖7顯示了乳酸代謝檢測結果。圖8顯示了氨代謝檢測結果。圖9顯示了葡萄糖、乳酸和氨比生成率結果；其中A顯示葡萄糖比生成率結果，B顯示乳酸比生成率結果，C顯示氨比生成率結果。具體實施方式本發明經過廣泛而深入的研究，意外地發現將組織工程化移植物放在新鮮配製的、相應的誘導液中，可以在37'C保存7天左右。這一發現既能在保存期間使移植物保持最佳生理活性，又能使移植物不會因為需要經過復甦等過程而遭受損傷。如本文所用，"組織工程化移植物"、"組織工程移植物"和"移植物"可互換使用，都是將具有分化潛能的種子細胞接種於生物可降解材料上，通過體外培養生物材料部分或全部降解後所形成的。本發明的組織工程化移植物中優選組織工程化骨移植物或軟骨移植物。本發明所用的組織工程化骨移植物中的種子細胞可以是本領域常用的，選自骨髓基質千細胞、真皮成纖維細胞、脂肪幹細胞、肌腱細胞、軟骨細胞等。優選骨髓基質幹細胞。所述的生物可降解材料選自(i)可降解性合成高分子材料，例如聚a-羥基酸(如聚乳酸PLA、聚羥基乙酸PGA、聚羥基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚胺基酸(polyaminoacid)、假聚胺基酸(pesudo—polyaminoacid)、聚原酸酉旨(polyorthoesters)、聚酉旨尿'院(polyesterurethane)、聚碳酸酉旨(polycarbonate)、聚乙二醇、聚對二氧六環酮(polydioxanone)等；(ii)天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠等；各種脫細胞基質；(iii)可注射性材料，如Pluronic(—種市售的聚環氧乙丙烯商品)、藻酸,丐凝膠等；(iv)上述材料的混合物或複合材料，尤其是高分子材料與天然材料的複合材料，以及固體材料與可注射性材料的複合材料。如本文所用，組織工程化移植物的"處理方法"和"保存方法"都是指使移植物保持生理活性的方法。如本文所用，"誘導液"和"誘導培養液"可互換使用，都表示可促進種子細胞進一步分化、增殖的溶液。本發明的誘導液優選本領域所常規使用的成骨誘導液或成軟骨誘導液。本發明提供的組織工程化移植物的處理方法中將本領域常規使用的誘導液作為相應移植物的保存液，其中所含成分是本領域常規的。在本發明的一個較佳實施例中，所述的用於保存骨移植物的誘導液中含有10土5nmol/L地塞米松，10±5nraol/Le—甘油磷酸鈉和50±20umol/L2—磷酸抗壞血酸；較佳地所述的成骨誘導液中含有10±3nmol/L地塞米松，10±3nmol/LP—甘油磷酸鈉和50土10iiinol/L2—磷酸抗壞血酸。在本發明的一個較佳實施例中，所述的用於保存軟骨移植物的誘導液中含有轉移生長因子-/3il0土5ng/ml，胰島素樣生長因子100±50ng/ml，地塞米松40±20ng/ml。本發明用於保存移植物的誘導液中還可添加或複合其他各種細胞、生長因子、各種轉基因成分，從而促進種子細胞分化為骨或軟骨細胞，以及保持骨或軟骨細胞的表型和/或促進骨或軟骨細胞生長。代表性的物質包括(但並不限於)轉移生長因子-P3、BMP-2、BMP-4、BMP-7、CDMP、血小板源性生長因子-BB(PDGF-BB)、胰島素、胰島素樣生長因子(IGF)—1和2、鹼性脂肪幹細胞生長因子(bFGF)、角質細胞生長因子(KGF)、神經生長因子(NGF)和肝細胞生長因子(HGF)和/或表皮生長因子(EGF)。移植物在所述誘導液中可以在37士2X:保存2小時一14天，較佳地保存3一10天，更佳地可保存4一7天。所述誘導液作為保存液使用時應含有足夠的氧氣，例如在15ml的容器中裝有5ml誘導液。更佳地，誘導液應新鮮配製，更佳地應將裝有誘導液和移植物的容器封口，以免有微生物進入和隔絕氧氣。本發明對移植物的處理可以將移植物從一地運送到另一地。即在37±2'C將骨移植物或軟骨移植物和成骨誘導液或成軟骨誘導液放置在一容器中後，通過運輸工具將容器從一地運送到另一地。所述的運輸工具包括但不限於，汽車、輪船、火車和/或飛機。兩地的距離可相隔500米一10000公裡。本發明提到的上述特徵，或實施例提到的特徵可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特徵可與任何組合物形式並用，說明書中所揭示的各個特徵，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特徵取代。因此除有特別說明，所揭示的特徵僅為均等或相似特徵的一般性例子。本發明的主要優點在於1、提供了一種急需使用的移植物的保存方法，它對移植物沒有任何損傷；2、本發明提供的保存方法能在一段時間內(1一14天)保持移植物最佳的生理性能；3、本發明提供的保存方法操作簡便、成本低廉。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數按重量計。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。實施例1保存人骨髓基質幹細胞和人脫鈣骨複合物材料和方法實驗材料DMEM低糖培養基(美國Hyclone公司)，Percoll分離液(美國Pharmacia公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，地塞米松、e—甘油磷酸鈉、2—磷酸抗壞血酸、Hoechst33258、DMS0、葡萄糖試劑盒、乳酸試劑盒、氨離子檢測試劑盒、鹼性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性檢測試劑盒(美國Sigma公司)，骨鈣素(osteocalcin,0CN)含量檢測試劑盒(美國Biosource公司)等。實驗方法1.人BMSCs的分離和培養按標準骨髓穿刺程序，從3例健康志願者(l男2女，年齡28—32歲)髂前上棘處抽取骨髓3—5ml，Perco11密度梯度離心獲取單個核細胞，以1.5X105個細胞/cra2的密度接種於培養皿，每皿加入10ml含10%胎牛血清的DMEM基礎培養液，置於37'C、5%(]02的飽和溼度培養箱內培養。48h後首次換液，以後每周換液2次。待原代細胞生長至80%—90%融合時消化傳代，從2代細胞更換成成骨誘導液(DMEM基礎培養液，10%胎牛血清，10nmol/L地塞米松，10mmol/LP—甘油磷酸鈉，50umol/L2—磷酸抗壞血酸)培養，每周換液2次至第3代，消化細胞接種脫鈣骨(demineralizedbonematrix,DBM)材料。2.細胞接種和複合物保存選擇人股骨來源DBM(購自上海組織工程研究與開發中心)，製備成4X4X4im^備用，消化收集hBMSCs，調整濃度為2X106cells/ml，均勻地接種在DBM上，每塊材料接種20u1細胞懸液。在培養箱內靜置4h後，加入成骨誘導液體外繼續培養7天，每周換液2次。7天後將複合物分別轉移至①含有5ml新鮮成骨誘導液的15ral離心管中，並用封口膜將管口封閉，37r保存，稱為37'C實驗組，②4t:冰箱和培養箱中保存，稱為4'C實驗組。保存時間設定為5、7、9、11天。同時以未保存的複合物(體外37"C、5XC02條件下，成骨誘導液持續培養2周，每周換液2次)為對照組。3.DNA測定細胞在DBM上的增殖情況通過Hoechst33258螢光染料測定細胞DNA，進而確定DBM材料上細胞數目，觀察細胞增殖。收集複合物，PBS衝洗，-8(TC保存待測，配製染液(10mgHoechst33258溶於10mlddH20)和分析液(0.1ng/ml，10u1染液溶於100mlDPBS)，將複合物在印pendorf管中儘可能鉗碎成小塊，加入500ul蛋白酶K，56°。過夜，400g離心10min，吸取40y1懸液至黑色96孔板，每孔中加入分析液160ul，37。C避光孵育20rain，在酶標儀(美國Thermo公司)上選擇激發波360nm，吸收波465nm測定螢光值。同時以各濃度單純hBMSCs繪製標準曲線，根據標準曲線換算各螢光值對應細胞數。4.細胞代謝檢測觀察細胞物質代謝通過測定培養液中葡萄糖、乳酸、氨離子濃度，方法參照試劑盒，簡言之，採集各時間點培養液樣本，根據試劑盒中提供之試劑和方法檢測培養液中葡萄糖、乳酸、氨離子濃度。5.ALP活性測定採用磷酸對硝基本酯二鈉鹽(美國Sigma公司)比色法測定複合物ALP活性，方法參照試劑盒手冊。6.0CN含量測定採用人0CN放射免疫試劑盒(human0CNRIAKit,Biosource公司)檢測0CN含量。檢測前一天更換無血清基礎培養液lml培養24h，然後收集培養液，依照試劑盒操作程序進行檢測。7.組織學對照組和單純材料在體外培養7天後取材回植裸鼠皮下，實驗組則分別在5，7，9，11天取材回植。手術步驟如下戊巴比妥腹腔注射麻醉((3.5mg/100g)，背部鈍性分離出四個腔隙，分別將對照組和單純材料各2塊，以及各時間點37t:和4"C保存複合物各2塊植入腔隙內，關閉切口，共計20隻，4周取材10%福馬林中固定24小時後酒精脫鈣，石蠟包埋，H&E染色。切片使用光鏡(1X70，Olympus,Japan)觀察，同時使用圖像處理軟體(MediaCybernetics,SilverSpring,MD)計算成骨比例。成骨比例定義為同一視野中新生骨面積與脫鈣骨支架面積之比。結果用均值士標準差表示。8.統計學處理採用單因素方差分析對實驗組和對照組的細胞數、代謝、ALP和OCN各檢測結果使用單因素方差分析進行統計學處理，各組樣本量n=3。P<0.05認為差異有顯著性意義。結果1.細胞在材料上增殖結果發現，37i:實驗組細胞數目在保存的前5天急劇減少，5—7沒有變化，7天之後開始出現減少；與對照組有顯著性差異。4"C實驗組細胞數目趨勢與37X:相似，前5天急劇減少，5天後不再明顯變化。而對照組一直保持在2.0X106水平(見圖1)。DNA檢測結果表明，DBM上的細胞數在保存的前5天急劇下降，這可能是由於環境的急劇變化所致。在這之後細胞數目基本保持穩定，意味著剩餘細胞已經適應新的缺氧環境，隨著葡萄糖的消耗和代謝產物乳酸和氨的增加，細胞的增殖減緩，反映在增殖曲線上及細胞數目保持穩定。37t保存9天之後細胞數目開始出現輕微下降。2.ALP活性測定37。C實驗組，ALP活性在前7天持續增加，之後開始減少。4'C實驗組，ALP活性維持在較低水平(見圖2)。37i:實驗組，ALP比生成率在保存的前9天維持在較高水平，之後急劇下降。4t:實驗組，比生成率在保存期間一直維持在較低水平(見圖3)。比速率主要用來描述單個細胞代謝情況，比生成速率用以下公式計算formulaseeoriginaldocumentpage11比消耗速率用以下公式計算1d512XUn-&n+1)。s.(n+1=——x——《-ft是比生長速率，單位隨ol/l0000細胞/天；tn和tw是時間點，單位天；Xt。和X^是在tn和tw時的細胞數，單位X104細胞；ft是比消耗速率，單位mmol/10000cell/天。4.0CN含量測定OCN含量測定的結果與ALP結果相似37'C實驗組，0CN含量在前7天持續增加，之後開始減少。4'C實驗組，觀察期間含量始終維持在lng/mL左右(見圖4)。37。C實驗組，OCN比生成率在保存的前9天維持在較高水平，之後急劇下降。4。C實驗組，比生成率在保存期間一直維持在較低水平(見圖5)。結果表明，37"C保存條件下，細胞的活性在保存前7天維持在一個較高水平，之後出現下降。而在4X:保存條件下，細胞的活性始終處在一個較低水平。表明，37"C保存條件下，隨著代謝消耗和副產物的堆積，細胞的活性和成骨分化能力在保存前9天維持在較高水平之後急速下降。4t:保存條件下，細胞處於一種"靜止"狀態。5.代謝檢測37°。實驗組，葡萄糖濃度持續降低，從5.6mmol/L減少到2.0mmol/L，乳酸在前9天則持續增加，從L8mmol/L增加到5.3mmol/L，然後進入平臺期(見圖6)，氨的濃度從1.0mmol/L增加到了3.Ommol/L(見圖7),4。C實驗組，三者濃度基本未發生改變。37t:實驗組，乳酸(見圖8A)和氨(見圖8B)的比生成速率在保存的第9天達到最高，然後急劇下降，葡萄糖(見圖8C)的比消耗速率也表現出同樣的趨勢。4。C實驗組，三者的比速率基本未發生改變。—結果表明，人骨髓基質幹細胞在37t:，5ml成骨低糖誘導液中活性最多可以維持9天，3mmol/L的氨濃度可能是抑制細胞活性和增殖的最小濃度。4'C保存期間，葡萄糖的消耗和代謝產物的產生都維持在一個較低的水平。6.組織學檢測成骨情況見表l，組織學觀察發現37"C保存5，7天和對照組有新生骨形成，鏡下觀察發現在支架骨小梁表面有大量成骨樣細胞成層狀分布，骨基質分泌旺盛。成骨比例分別是21.4土0.7%，19.8±0.5%，和23.6±1.4%。9，11天複合物僅有少量新骨形成。成骨比例分別為7.5±1.2%和6.8±1.8%。單純材料和4X:保存複合物則未見新骨形成。表1成骨情況組織學觀察結果tableseeoriginaldocumentpage12目前保存組織和器官的主要方法是4。C保存和低溫凍存，低溫凍存已經開始應用於組織工程領域，例如人骨髓基質幹細胞，軟骨細胞，組織工程血管等等。但是由於在凍存過程中產生的冰晶損傷和溶質損傷，其應用受到了很大的限制。關於4匸保存在組織工程中的應用目前尚未見報導。37i:是最適合哺乳動物細胞增殖，分化的溫度，4t在臨床器官移植應用較多，主要用於短期保存組織和器官的。葡萄糖是細胞代謝的主要能量物質，代謝產物主要是水和二氧化碳，絕大多數哺乳動物細胞在去除葡萄糖之後會出現死亡。葡萄糖主要通過磷酸戊糖途徑合成細胞所需的核酸，通過糖酵解途徑為細胞代謝提供能量。乳酸和氨是細胞的主要代謝產物，前者主要來源於葡萄糖代謝，後者主要來源於穀氨醯胺的代謝。Miller報導當培養液中的乳酸濃度超過30—40mmol/L後會對細胞的增殖和活性產生抑制，其抑制作用的強弱隨細胞不同而不同。ALP和OCN是成骨過程中分泌的特異性蛋白質。ALP在成熟的成骨細胞中表達，與骨基質的鈣化緊密相關，ALP活性的高表達是成骨細胞分化的特異性標誌。0CN是礦化組織中一種非常重要的非膠原蛋白，僅由成骨細胞和成牙骨質細胞分泌，故被認為是成骨細胞特異性蛋白質。兩者主要在成骨分化的早期階段表達。發明人發現37'C條件下，ALP活性和0CN含量在保存的前9天持續增高，之後急劇下降。而在4'C條件下，兩者在保存期間都維持在較低水平。發明人認為37"C條件下，5ml新鮮成骨誘導液中，人骨髓基質幹細胞最多可以在7天內保持較高的活性和成骨分化能力。之後活性和成骨分化能力急劇下降。4t:可能並不適合骨組織工程複合物的體外保存。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並非用以限定本發明的實質技術內容範圍，本發明的實質技術內容是廣義地定義於申請的權利要求範圍中，任何他人完成的技術實體或方法，若是與申請的權利要求範圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋於該權利要求範圍之中。權利要求1.一種組織工程化移植物的處理方法，其特徵在於，它包括步驟(a)在37±2℃將骨移植物或軟骨移植物和成骨誘導液或成軟骨誘導液放置在一容器中2小時-14天；和(b)從容器中取出骨移植物或軟骨移植物作為移植手術準備材料。2.如權利要求1所述的處理方法，其特徵在於，所述骨移植物中單位體積中成骨樣組織佔30_80%;所述軟骨移植物中單位體積中成軟骨樣組織佔40—70%。3.如權利要求1所述的處理方法，其特徵在於，步驟(a)中是將骨移植物或軟骨移植物和新鮮配製的成骨誘導液或成軟骨誘導液放置在一容器中2小時一14天，且不更換誘導液。4.如權利要求1所述的處理方法，其特徵在於，步驟(a)中所述容器是密封容器。5.如權利要求1所述的處理方法，其特徵在於，步驟(a)中是將骨移植物或軟骨移植物和新鮮配製的成骨誘導液或成軟骨誘導液放置在一容器中3—10天。6.如權利要求1所述的處理方法，其特徵在於，步驟(a)中是將骨移植物或軟骨移植物和新鮮配製的成骨誘導液或成軟骨誘導液放置在一容器中4一7天。7.如權利要求1所述的處理方法，其特徵在於，所述的骨移植物是骨髓基質幹細胞和人脫鈣骨複合物。8.如權利要求1所述的處理方法，其特徵在於，所述的成骨誘導液中含有10±5nmol/L地塞米松，10±5nmol/LP—甘油磷酸鈉和50±20umol/L2—磷酸抗壞血酸。9.如權利要求1所述的處理方法，其特徵在於，步驟(a)中的容器由運輸工具由一地運送到另一地，所述的運輸工具包括汽車、輪船、火車和/或飛機；一地至另一地的距離在500米一IOOOO公裡。10.—種成骨誘導液或成軟骨誘導液在處理骨移植物或軟骨移植物中的應用。全文摘要本發明公開了一種組織工程化移植物的處理方法，它包括步驟(a)在37±2℃將骨移植物或軟骨移植物和成骨誘導液或成軟骨誘導液放置在一容器中2小時-14天；和(b)從容器中取出骨移植物或軟骨移植物作為移植手術準備材料。所述的方法可短期保存移植物，它不會給移植物帶來損傷，而且可以保持其良好的生理性能，同時成本低廉且便於操作。文檔編號A61L27/00GK101332312SQ20071004301公開日2008年12月31日申請日期2007年6月29日優先權日2007年6月29日發明者劉廣鵬,磊崔,曹誼林,王衡健申請人:上海國睿生命科技有限公司