羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組全序列及其應用的製作方法
2024-04-05 23:09:05 1
專利名稱：羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組全序列及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於病毒基因組學技術領域，具體涉及羅氏沼蝦雙順反子病毒的基因組序列及其應用。
背景技術：
羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii DeMan, 1879 ),又稱淡水長臂大蝦， 屬於沼蝦屬(Macrobrachium )，是我國淡水甲殼類動物主要養殖品種。根據聯合國糧農組織(FAO )於2009 的統計資，羅氏沼蝦的全球養殖總產 2008 達到了的207749 噸，其中亞洲產則為127627噸，佔全球產 98%，中國是全球最大的養殖國。病毒是羅氏沼蝦育苗和養殖過程中的主要病原，暴發於2009年和2010年的羅氏沼蝦幼體綜合症(Macrobrachium rosenbergii larval Syndrome，MRLS)，造成羅氏沼蝦在幼體期出現大量死亡，特別是在幼體6-9日齡死亡尤為嚴重，死亡率一般為80-90%，嚴重的達到100%，涉及我國主要羅氏沼蝦育苗區域，給羅氏沼蝦育苗產業造成的經濟損失無法估量。經研究發現其主要病原為一種新的雙順反子病毒，暫命名為羅氏沼蝦雙順反子病毒 (Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus, MRDV), MRDV 為單正鏈 RNA 病毒，歸為雙順反子病毒科，被發現以來，因無該病毒基因組相關信息，更缺少檢測方法，嚴重阻礙了該病毒引起疾病的診斷和預防工作，因此該病毒基因組全序列的解析及其相關應用顯得尤為重要。
發明內容
針對現有技術存在的問題，本發明的目的在於設計提供羅氏沼蝦雙順反子病毒的基因組序列及其應用的技術方案，本發明為檢測MRDV、研究MRDV感染途徑等目的奠定可靠的基礎。所述的一種分離的核酸分子，其特徵在於所述的核酸分子含有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列或其反義序列。所述的一種分離的核酸分子，其特徵在於所述的核酸分子為DNA或RNA。所述的一種分離的核酸分子用於製備檢測羅氏沼蝦雙順反子病毒的引物、探針或
試齊U盒。所述的一種分離的DNA分子，其特徵在於含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反義序列。所述的一種分離的DNA分子，其特徵在於含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反義序列中連續的150-10300個核苷酸。所述的一種分離的DNA分子，其特徵在於含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反義序列中連續的300-10300個核苷酸。所述的一種分離的DNA分子，其特徵在於含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反義序列中連續的1000-10300個核苷酸。所述的一種引物，其特徵在於含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反義序列中15-100 個連續核苷酸。所述的一種探針，其特徵在於含有SEQ ID N0:1所示序列或其反義序列中25-7000 個連續核苷酸。所述的一種試劑盒，其特徵在於含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反義序列中 50-500個連續核苷酸。本發明對羅氏沼蝦雙順反子病毒的基因組進行測序，得到了羅氏沼蝦雙順反子病毒的基因組全序列，並且本發明利用該全序列用於製備檢測羅氏沼蝦雙順反子病毒的引物、探針或試劑盒，為檢測MRDV、研究MRDV感染途徑等目的奠定可靠的基礎。
具體實施例方式本發明中的核酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。本發明的基因組全序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。 這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。第一方面，本發明提供了一核酸，該核酸含有在SEQ ID N0:1所示的羅氏沼蝦雙順反子病毒的基因組核苷酸序列。還提供了含有與本文所公開的核苷酸序列有序列相同性的序列的核酸。根據具體的序列，序列相同性的程度宜大於50%(例如 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%或更高)。這些序列包括例如突變體和等位基因變體。本發明還提供了包含本文所公開的一種或多種核苷酸序列片段的核酸。這些片段應包含諸序列中至少η個連續的胺基酸，並且根據具體的序列，η為10或更高(例如，11， 12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，50，60，75，100 或更高)。較佳地，該片段是羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組特有的，換言之在其他生物體的基因組中並不存在。更佳地，該片段是羅氏沼蝦雙順反子病毒毒株的基因組特有的。本發明還提供了與本文所提供的核酸發生雜交的核酸。雜交條件如本文中所述。本發明還提供了一核酸，該核酸包含與上述序列互補的序列(例如，用於反義、用於探針、或用於擴增引物)。當然，本發明的核酸可以用多種方法製備(例如，化學合成、從DNA文庫、或從生物體本身製得等)，並可採用各種形式(例如單鏈、雙鏈、載體、探針、引物等)。術語「核酸」包括DNA和RNA，以及它們的類似物，如含有修飾骨架的那些類似物，還包括肽核酸(PNA)等。應理解，因為SEQ ID NO: 1代表了羅氏沼蝦雙順反子病毒的完整基因組。本發明還提供了含有本發明的核苷酸序列的載體(如表達載體、測序載體、克隆載體等)以及用這些載體轉化的宿主細胞。
第二方面，本發明還提供了一種蛋白質，該蛋白質含有本文所示的羅氏沼蝦雙順反子病毒核苷酸序列中所編碼的胺基酸序列。還提供了含有與這些蛋白質有序列相同性的序列的蛋白。根據具體的序列，序列相同性程度宜大於50% (例如6096，70%, 80%, 90%, 95%, 99%或更高)。序列相同性用如上所述的方法確定。這些同源蛋白包括本文所示的羅氏沼蝦雙順反子病毒核苷酸序列中所編碼的突變體和等位基因變體。本發明還提供了一種蛋白質，該蛋白質含有序列表中所公開的羅氏沼蝦雙順反子病毒核苷酸序列中所編碼的胺基酸序列片段。這些片段應包含諸序列中至少η個連續的胺基酸，並且根據具體的序列，η為7或更高(例如，8，10，12，14，16，18，20或更高)。這些片段宜包含該序列的表位。本發明還提供了編碼本發明蛋白的核酸。第三方面，本發明還提供了含有本發明核酸的核苷酸序列的計算機、計算機存儲器、計算機存儲介質(如軟盤、硬碟、CD-ROM等)和/或計算機資料庫。較佳地，它含有本文列出的一種或多種羅氏沼蝦雙順反子病毒核苷酸序列。這可用於分析本文所列出羅氏沼蝦雙順反子病毒核苷酸序列。例如，可用於檢索以鑑別序列中的開放閱讀框(ORF)或編碼序列。第四方面，本發明提供了鑑別胺基酸序列的方法，它包括步驟檢索本文所列出的羅氏沼蝦雙順反子病毒核苷酸序列中推定的開放閱讀框或蛋白編碼序列。類似地，本發明提供了此處所列出的羅氏沼蝦雙順反子病毒核苷酸序列在檢索推定的開放閱讀框或蛋白質編碼序列中的用途。開放閱讀框或蛋白編碼序列分析通常在計算機上用標準的生物信息技術進行。 用於分析的典型算法或程序包括0RFFINDER (NCBI), GENMARK[Borodovsky &Mcininth (1993)Computers Chem 17:122-133〕和GLIMMER[Salzberg et al. (1998)Nucl Acids Res 26:544-548]。對開放閱讀框或蛋白編碼序列的檢索可包括步驟檢索此處所列出的羅氏沼蝦雙順反子病毒核苷酸序列中的起始密碼子和檢索上遊序列中的處於讀框中終止密碼子。中間的密碼子就代表了推定的蛋白編碼序列。通常，應檢索一個序列中6種可能的讀框。用這種方法鑑別出的胺基酸序列可用任何合適的系統進行表達，以獲得蛋白。該蛋白可用於產生抗體，而該抗體識別在鑑別出的胺基酸序列中的表位。這些抗體可用於篩選羅氏沼蝦雙順反子病毒，以檢測是否存在含所鑑別胺基酸序列的蛋白質。此外，一旦鑑別出ORF或蛋白編碼序列，那麼就可將該序列與序列資料庫進行比較。序列分析工具可在NCB工(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)處找到，例如 BLAST, BLAST2, BLASTn, BLASTp, tBLASTn, BLASTx，和 tBLASTx 算法[還可參見 Altschul 等人.(1997)Gapped BLAST and PSI-BLAST: new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25:2289-3402]。用於比較的合適資料庫包括非冗餘GenBank，EMBL, DDBJ和PDB序列，以及非冗餘GenBank CDS翻譯物， PDB, SwissProt, Spupdate和P^序列。這種比較可給出蛋白質功能的指示。胺基酸序列中的疏水區可用以上算法加以預測，例如基於Esposti等人的統計學研究的算法[「膜蛋白親水性的關鍵評價」 (Critical evaluation of the hydropathy ofmembrane proteins) (1990)Eur J Biochem 190 207-219]。疏水區代表了潛在的跨膜區或疏水性前導序列，這暗示蛋白質可以被分泌或位於表面。這些特性通常是良好免疫原的標
ο類似地，可用PSORT算法(http://www. psort. nibb. ac. jp)來預測跨膜區或前導序列，以及用MOTIFS程序來預測功能區(GCG Wisconsin&PROSITE)。本發明還提供了一種核酸，該核酸含有本文所列出的羅氏沼蝦雙順反子病毒核苷酸序列中的開放閱讀框或蛋白編碼序列。此外，基於本發明所提供的基因組序列，還提供了若干種蛋白質，該蛋白質含有所述開放閱讀框或蛋白編碼序列所編碼的胺基酸序列。例如，SEQ ID NO 1中第392-6589位的ORF就編碼一個長度為2065個胺基酸的病毒蛋白酶和 RNA 聚合酶前體蛋白(pre-proprotein) (SEQ ID NO: 2), SEQ ID NO 1 中第 6961-10053 位的ORF就編碼一個長度為1030個胺基酸的病毒衣殼前體蛋白(pre-proprotein) (SEQ ID NO :3)。第五方面，本發明提供了結合這些蛋白的抗體。它們可能是多克隆的或單克隆的， 可用本領域技術人員已知的任何合適方法製得。本發明的抗體可以以各種不同方式使用，例如用於證實蛋白質的表達，或用於證實蛋白質表達的場所。例如，標記的抗體(如螢光標記以用於FACS(流式細胞分選儀))可以與完整的病毒一起孵育，而在病毒表面上存在標記就證實蛋白質的位置。第六方面，本發明提供了各種方法。本發明提供了一種生產本發明的蛋白的方法，該方法包括步驟在誘導蛋白表達的條件下，培育本發明的宿主細胞。一種方法還可包括化學合成蛋白或化學合成(至少部分合成)核苷酸。本發明提供了一種檢測本發明的多核苷酸的方法，該方法包括下列步驟(a)在雜交條件下使本發明的核酸探針與生物樣品接觸，形成雙鏈體；和(b)檢測所述雙鏈體。本發明提供了一種檢測本發明的蛋白質的方法，該方法包括下列步驟(a)在適合形成抗體一抗原複合物的條件下使本發明的抗體和生物樣品接觸；和(b)檢測所述複合物。第七方面，本發明提供了檢測選擇性結合於抗原或多肽或蛋白質的抗體的方法， 這些抗原或多肽或蛋白質是對羅氏沼蝦雙順反子病毒的任何毒種或毒株特異性的，較佳地是對羅氏沼蝦雙順反子病毒毒株特異性的，但更佳地是對羅氏沼蝦雙順反子病毒特異的。 該方法包括步驟(a)在適合形成抗體-抗原複合物的條件下，使本發明抗原或多肽或蛋白質與生物樣品接觸；和(b)檢測所述複合物。方法綜述
本發明提供了羅氏沼蝦雙順反子病毒MRDV核苷酸序列、和其所編碼的胺基酸序列。利用這些所公開的序列，可以產生核酸探針試驗和表達盒及載體。蛋白質還可化學合成。表達載體可以轉入宿主細胞以產生蛋白。純化或分離的多膚可用於產生抗體以檢測MRDV蛋白。 而且，宿主細胞或提取物可用於生物試驗以分離促效劑和拮抗劑。此外，利用這些序列，人們可檢索以鑑定開放讀框(ORF)和鑑定胺基酸序列。蛋白質還可用於免疫原性組合物以及用作疫苗組份。除非另有描述，本發明的實施將採用分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規技術，這些均是本領域技術人員所知的。在本說明書中採用了核苷酸和胺基酸的標準縮寫。免疫診斷試驗
本發明的羅氏沼蝦雙順反子病毒抗原或開發的重組抗原，可用來製備相應的實驗動物抗體，該類抗體可用於免疫試驗來檢測臨床羅氏沼蝦樣品的病毒抗原水平。免疫試驗的設計可作很大變化，其各種方案均是本領域中已知的。將合適的材料(包括本發明的組合物)以及進行試驗所需的其它試劑和材料(例如合適的緩衝液、鹽溶液等)和合適的試驗說明書包裝到合適的容器中，構成適用於免疫診斷且含有適當標記的試劑的試劑盒。核酸雜交
「雜交」指兩個核酸序列相互之間通過氫鍵而結合。通常，一個序列固定於固體載體，另一個將游離於溶液內。然後，在有利於形成氫鍵的條件下使兩個序列相互接觸。影響這種結合的因素包括溶劑的類型和體積；反應溫度；雜交時間；攪拌；封閉液相序列與固體載體非特異性結合的試劑(Denhardt』 s試劑或BLOTTO)；各序列的濃度；是否使用化合物來增加序列結合的速度(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；以及雜交後洗滌條件的嚴謹程度。核酸探針試驗
採用本發明的核酸探針的方法(如PCR、分支DNA探針試驗或印跡技術)能確定cDNA 或mRNA的存在。如果探針和本發明的序列能形成穩定地足以被檢測到的雙鏈體或雙鏈複合物，則稱探針與本發明的序列「雜交」。核酸探針將與本發明的羅氏沼蝦雙順反子病毒核苷酸序列(包括有義和反義鏈) 雜交。儘管有許多不同的核苷酸序列編碼該胺基酸序列，但是天然的羅氏沼蝦雙順反子病毒序列是較佳的，因為它是實際存在於細胞中的序列。mRNA代表一種編碼序列，因此探針應與該編碼序列互補；單鏈cDNA與mRNA互補，因此cDNA探針應與非編碼序列互補。探針的確切長度和序列將取決於雜交條件，如溫度、鹽濃度等。例如，對於診斷應用，根據分析物序列的複雜程度，核酸探針通常含有至少10-20個核苷酸，較佳的15-25個， 更佳的至少30個核苷酸，但是也可短於該長度。短的引物通常需要較低溫度，以便和模板形成足夠穩定的雜交複合物。探針可用合成方法產生，例如Matteucci等人[J. Am. Chem. Soc. (1981) 103 :3185]的方法或Urdea等人[Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80 :7461]的方法，或用市售的自動寡核苷酸合成儀合成。可以根據偏好選擇探針的化學特徵。對於某些應用，DNA或RNA是合適的。對於其它的應用，可以加入修飾，例如骨架修飾，如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯，可用來增加體內半衰期，改變RNA親和力，增加核酸酶抗性等「例如參見Agrawal和工yer (1995) CurrOpin Biotechnol 6:12-19 ;Agrawal (1996) T 工 BTECH14:376-387]；還可採用類似物如膚核酸[例如參見 Corey (1997) T 工 BTECH15 2^-2 ;Buchardt 等人(1993) TIBTECH 11:384-386]。另外，聚合酶鏈反應(PCR)是另一個熟知的檢測少量靶核酸的手段。該試驗在 Mullis 等人[Meth. Enzymol. (1987) 155 3；35_350]；美國專利 4，683，195 和 4，683， 202中有所描述。用兩個「引物」核苷酸與靶核酸雜交，並用來引導反應。引物可包含不與
7擴增靶序列(或其互補序列)雜交的序列，以幫助雙鏈體的穩定性，或例如可插入一個簡便的限制性位點。這些序列通常側接所需的羅氏沼蝦雙順反子病毒序列。利用最初的靶核酸作為模板，熱穩定的聚合酶能從引物產生靶核酸的拷貝。在聚合酶產生臨界量的靶核酸後，它們可用較傳統的方法(如Southern印跡)來檢測。當採用 Southern印跡方法時，標記的探針將與羅氏沼蝦雙順反子病毒序列(如其互補序列)雜交。另外，mRNA或cDNA也可用Sambrook等人〔同上〕描述的傳統印跡技術來檢測。用凝膠電泳可純化井分離利用聚合酶從mRNA產生的mRNA或cDNA。然後，將凝膠上的核酸印跡到固體載體如硝酸纖維素上。使固體載體與標記的探針接觸，然後洗滌除去所有未雜交的探針。然後，檢測含有標記探針的雙鏈體。該探針通常用放射活性物質作標記。基因組序列的應用
基於對羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組全序列的測定，可以了解與該病毒增殖及重要調控功能有關的基因結構和功能，找到其分子生理機制以及如何侵染宿主的關鍵點，尋找病毒致病甚至致死基因。一種應用方法是，用羅氏沼蝦雙順反子病毒感染羅氏沼蝦幼體，建立cDNA文庫。 用雙向末端法測定cDNA克隆，或直接對MRDV cDNA的文庫用PCR擴增的方法進行序列測定。 基於本發明所提供的羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組序列，可以大大方便引物的設計以及克隆的進程。另一種直接的應用是使用本發明的引物或探針，來檢測樣品中是否存在羅氏沼蝦雙順反子病毒或其遺傳物質。對於探針而言，這種檢測方法包括步驟 將DNA樣品與本發明的探針接觸，
觀察是否形成DNA-探針複合物，形成了複合物就表示樣品中存在羅氏沼蝦雙順反子病毒或遺傳物質。對於引物而言，這種檢測方法包括步驟 用本發明的特異性引物，對樣品進行PCR反應，
觀察是否擴增產生了特異性的擴增產物，產生了特異性擴增產物就表示樣品中存在羅氏沼蝦雙順反子病毒或遺傳物質。在本發明的一個實例中，羅氏沼蝦雙順反子病毒的基因組序列是通過如下方法獲得的，該方法包括步驟
1.分離純化MRDV病毒，獲取高純度RNA樣品。2.以此RNA樣品為模板，以帶有錨定序列的隨機引物進行反轉錄反應，以合成單鏈cDNA。繼續以此cDNA為模板，利用錨定序列引物，在Taq和De印Vent DNA多聚酶的作用下進行PCR擴增，並將擴增產物克隆入T載體，進行序列測定，獲得大部分病毒序列
3.將得到的序列輸入計算機，利用軟體(如hnerpeace軟體)進行拼接，再經後期工作得到完整的病毒基因組全序列。經過多次反覆測序，在平均每個鹼基測序約6次的基礎上獲得了如SEQ ID NO 1 所示的羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組全序列。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室手冊(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1 病毒RNA的提取
取羅氏沼蝦雙順反子病毒株CN-NTH感染的羅氏沼蝦幼體，進行組織研磨，以體積比1 10加PBS緩衝液，超聲破碎3-5秒，將細胞破碎。4°C 6000rpm離心30min後取上清液，用 0. 22um濾膜過濾除菌，再進行蔗糖/甘油非連續密度梯度離心，獲得高純度MRDV病毒，用病毒RNA提取試劑盒提取病毒RNA。逆轉錄PCR (RT-PCR)
設計併合成引物上5，-GCCGGAGCTCTGCAGAATTCNNNNNN-3』 (SEQ ID NO :4)。取前述製備的RNA病毒5uL置於200 u L的PCR擴增專用小管中，加入IOOpmol的引物1，置於 65°C變性IOmin後，立即置於冰上，加入IOX逆轉錄緩衝液2 uL, 1 mmol/L 4XdNTP, 20U RNasin,禾口 50U Expand Reverse Transcriptase，力口水至終體積 20 u L。混勾後 42 "0 育Ih0PCR 擴增
設計併合成以下引物2。引物 2 :5，-GCCGGAGCTCTGCAGAATTC -3，(SEQ ID NO :5)。取上述逆轉錄產物5uL置於200 u L的PCR擴增專用小管內，加入10 X PCR緩衝液 2 u L, 350 nmol 4 X dNTP, 700nmol 引物 2，8U 含 De印 Vent 的 Taq DNA 聚合酶， 混勻後置PCR儀進行擴增，循環參數95°C 3min 1個循環，94°C 30s, 54°C 30s, 68°C 3min 40個循環。反應產物取50uL於1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，並將大小為l_2Kb的片段割下回收純化。連接反應
按如下條件與PMD20-T質粒講行連接
權利要求
1.一種分離的核酸分子，其特徵在於所述的核酸分子含有SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列或其反義序列。
2.如權利要求1所述的一種分離的核酸分子，其特徵在於所述的核酸分子為DNA或RNA。
3.如權利要求1所述的一種分離的核酸分子用於製備檢測羅氏沼蝦雙順反子病毒的引物、探針或試劑盒。
4.一種分離的DNA分子，其特徵在於含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反義序列。
5.如權利要求4所述的一種分離的DNA分子，其特徵在於含有SEQID NO: 1所示序列或其反義序列中連續的150-10300個核苷酸。
6.如權利要求4所述的一種分離的DNA分子，其特徵在於含有SEQID NO: 1所示序列或其反義序列中連續的300-10300個核苷酸。
7.如權利要求4所述的一種分離的DNA分子，其特徵在於含有SEQID NO: 1所示序列或其反義序列中連續的1000-10300個核苷酸。
8.一種引物，其特徵在於含有SEQ ID N0:1所示序列或其反義序列中15-100個連續核苷酸。
9.一種探針，其特徵在於含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反義序列中25-7000個連續核苷酸。
10.一種試劑盒，其特徵在於含有SEQ ID NO: 1所示序列或其反義序列中50-500個連續核苷酸。
全文摘要
羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組全序列及其應用，屬於病毒基因組學技術領域。本發明提供了羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組全序列如SEQIDNO:1所示，並且本發明提供了羅氏沼蝦雙順反子病毒特異性的引物、探針或試劑盒。本發明為檢測MRDV、研究MRDV感染途徑等目的奠定可靠的基礎。
文檔編號C12Q1/70GK102352366SQ20111029648
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月28日 優先權日2011年9月28日
發明者姚嘉贇, 尹文林, 徐洋, 曹錚, 沈錦玉, 潘曉藝, 石正麗, 郝貴傑 申請人:浙江省淡水水產研究所