用於逆轉錄病毒載體的懸浮包裝細胞系的製作方法

2024-04-07 10:09:05 1

專利名稱：用於逆轉錄病毒載體的懸浮包裝細胞系的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於逆轉錄病毒載體的懸浮包裝細胞系及其在生產感染性的無複製能力的逆轉錄病毒載體方面的應用。
病毒由編碼病毒基因的基因組和病毒衣殼組成，在逆轉錄病毒中衣殼可由一些被膜包圍。
識別逆轉錄病毒要區分順式元件5′-LTR、3′-LTR、包裝序列Psi、正鏈引物結合位點與負鏈引物結合位點，以及反式元件gag(衣殼蛋白)、pol(反轉錄酶)和env(被膜蛋白)。反式元件可由病毒基因組上的外源基因代替；然而這樣的病毒將依賴於稱為輔助病毒的病毒，這種輔助病毒既可以是完整的具感染性的病毒，也可以是非感染性的例如無包裝序列的病毒。包含這種非感染性的輔助病毒和/或一種或多種輔助病毒的輔助基因的細胞，稱之為包裝細胞系，其中輔助病毒基因可為瞬時表達的、游離的或整合到基因組中的基因。因此，包裝細胞系並不釋放有複製能力的感染性的病毒顆粒。如果輔助基因來自不同的輔助病毒，那麼所形成的載體可稱作嵌合逆轉錄病毒載體；這個過程稱為假型(pseudoty ping)。通常使用的這種嵌合包裝系統有例如攜帶親嗜性MoMuLv病毒的gag-pol基因和兼嗜性4070Ampho病毒的env基因的GP+env Am12(Markowwitz，D.G等，Trans.Assoc.Am.Physicians 101(1988)212-218)。甚至可能在包裝細胞系中出現來自幾種病毒(甚至帶有遺傳修飾的env基因)的env基因混合物。
包裝細胞系也可以包含不完整的分節段形式的病毒輔助基因組，這種情況下可稱為含割裂病毒基因組的包裝細胞系，這種變異具有更大的安全性來抵抗通過重組事件不期望地釋放具有感染性和複製能力的病毒。
然而，如果包裝細胞系經除順式元件外還攜帶外源基因的逆轉錄病毒載體轉染或轉導，那麼這些病毒基因組便可作為具感染性但無複製能力的逆轉錄病毒載體被包裝和釋放。這種細胞系可稱為逆轉錄病毒生產細胞系。
所有過去製備的逆轉錄病毒包裝細胞系都是以貼壁細胞即貼於表面生長的細胞為基礎的基於貼壁細胞NIH3T3的包裝細胞系GP+E86和GP+envAm12可見Markowitz.D.G.等在Trans.Assoc.Am.Physicians 101(1988)212-218中的描述。Miller，A.D.等在分子細胞生物學(Mol.and cell Biol.)，6(1986)2895-2902中描述了基於貼壁細胞NIH3T3的包裝細胞系PA317。Miller，A.D.等在病毒學雜誌(J.Virol.)，65(1991)2220-2224中描述了基於NIH3T3細胞的GALV包裝細胞系PG13。Danos，O.等在美國國家科學院院報(PNAS USA)，85(1988)6460-6464中描述了基於NIH-3T3細胞的包裝細胞系ΨCre和ΨCrip。
Rigg，R.J.等在病毒學(Virology)218(1996)290-295中描述了基於一種人細胞系的包裝細胞系Propack-A。Cosset，F.-L.等在病毒學雜誌，69(1995)7430-7436中描述了基於一種人纖維瘤細胞系(HT1080)的包裝細胞系FLY A13和FLY RD18。基於D17和其它狗貼壁細胞系的包裝細胞系可見WO92/05266的描述。
通常描述的細胞系大多也是貼壁生長。貼壁細胞系的一個優點在於它容易操作。因而貼壁細胞相對容易克隆，並且可使用病毒尤其是逆轉錄病毒，即經轉染或轉導後直接克隆選擇細胞是可能的。單個克隆可以容易地通過挑選進行識別、計數並分離。死細胞簡單地因脫落而不可能被誤認為活細胞，為變換培養基僅僅需要簡單地通過吸管除去上清液且加入新鮮培養基。接種和維持細胞通常並不關鍵，因為貼壁細胞形成細胞克隆，並在組織單元中相互刺激生長。轉移細胞時，對於貼壁細胞需要額外的胰蛋白酶處理以分散細胞，但通常並不關鍵。
懸浮生長的細胞需要一系列不同的方法以進行克隆和轉導實驗。因而克隆選擇需要使用固定添加劑如軟瓊脂，用稱作有限稀釋的方法系列稀釋細胞，直到理論上每個容器只有一個細胞，或者使用表面標記物或螢光標記物(如GFP)，使得可通過FAC分選器直接選擇重組細胞。活細胞和死細胞只能通過染色區分。變換培養基總是需要離心步驟。
過去並不知道懸浮生長的細胞系可作為逆轉錄病毒的包裝細胞系。到目前為止也沒有實驗描述已建立的貼壁生長的包裝細胞系可轉變為懸浮生長。
令人驚奇的是，本發明證明確實可能將貼壁包裝細胞系加以改變以適應懸浮生長，並且所得懸浮包裝細胞系能夠生產高滴度的病毒。此外證明，通過逆轉錄病毒包裝基因質粒和逆轉錄病毒載體質粒共轉染，可從經典的懸浮細胞系(例如人紅細胞白血病細胞系K562、大鼠肝癌細胞系N1-S1和大鼠淋巴瘤細胞系C58)製備生產逆轉錄病毒的懸浮生長細胞系，即這些細胞系釋放能轉導其它細胞的逆轉錄病毒載體顆粒。
除了已提到的懸浮細胞需要其它克隆培養技術這點與貼壁細胞的差異外，生產懸浮包裝細胞系的技術流程與多次描述的製備貼壁包裝細胞系方法相似，都是通過導入單獨不能形成感染性病毒的輔助序列(一段或優選斷裂形式)來製備。
一旦生產出懸浮包裝細胞系，便可以通過用相容逆轉錄病毒載體轉導，使之轉變為釋放感染性但無複製能力的逆轉錄病毒載體的懸浮生產細胞系(例如，一種兼嗜性包裝細胞系，其包含來源於一種親嗜性包裝細胞系的載體)，並且優選地可通過用一種逆轉錄病毒載體質粒轉染實現轉變。
過去並不知道完全懸浮生長的哺乳動物細胞系可作為逆轉錄病毒的包裝細胞系。過去也沒有已知的方法可將建立的貼壁生長的包裝細胞系完全轉變為懸浮生長。
本發明的目的是提供用於逆轉錄病毒載體懸浮生長的包裝細胞系，以及生產該包裝細胞系的方法及其用途。
本發明涉及一種完全懸浮生長的用於逆轉錄病毒的包裝細胞系，該細胞系優選地經逆轉錄病毒載體轉染。
本發明進一步的目的為一種生產逆轉錄病毒載體的方法，其特徵為將用上述載體轉導的懸浮生長細胞系懸浮培養，將細胞與細胞上清液分離，並從上清液中分離載體。
包裝細胞系可理解為一種哺乳動物細胞系，它包含製備病毒顆粒所必需的gag、pol和env基因(輔助基因)，而不包含具有功能活性的包裝序列(Ψ)。這種細胞系單獨不能形成包含基因組RNA的病毒顆粒。
具有功能活性的包裝序列可理解為逆轉錄病毒基因組中一段功能上導致RNA基因組包裝的區域。它的功能可以通過全部或部分缺失或突變而被失活。
根據本發明，可優選地從貼壁生長的逆轉錄病毒包裝細胞系通過至少三個月時間逐步將貼壁包裝細胞系改變為適應懸浮生長，從而生產完全懸浮生長的逆轉錄病毒包裝細胞系(甚至較長時間，如幾天，無需生長需要的不溶性基質(細胞粘附的管壁或微載體))。所述步驟包括連續減少培養基中胎牛血清含量直至無血清，反覆用胰蛋白酶或/和DNase處理細胞，使用懸浮細胞系專用的培養基(如DMF024A)，優選地採用適於懸浮細胞和雜交瘤細胞的組織培養瓶(Sarstedt)，在一個振搖器上持續振搖培養瓶，細胞濃度在5×104和1×106個細胞/毫升(因此與貼壁培養相比較必須更加頻繁地分散細胞)。
根據本發明的完全懸浮生長並由逆轉錄病毒載體質粒轉染或用逆轉錄病毒載體轉導的細胞系，可優選地通過如下方法生產用逆轉錄病毒載體質粒轉染或用逆轉錄病毒載體轉導懸浮細胞系，以共轉染或共轉導表面標記的方式通過有限稀釋和/或加入固定添加劑選擇轉染或轉導的細胞，並分離以此方式所選擇的根據本發明的懸浮細胞。懸浮細胞系優選地為逆轉錄病毒包裝細胞系。為了生產懸浮生長的逆轉錄病毒包裝細胞系，優選地將一種逆轉錄病毒包裝細胞系轉變成一種懸浮生長的細胞系，該逆轉錄病毒包裝細胞系貼壁生長且由編碼輔助序列的核酸和逆轉錄病毒載體質粒轉染，或由逆轉錄病毒載體轉導，上述轉變採用的方法為連續減少培養基的血清含量，直至基本上不含血清，反覆用胰蛋白酶和DNase處理使細胞脫離支持物，在此過程中細胞濃度維持在5×104至1×106個細胞/毫升的範圍內。這一方法的實施特別優選經過一段較長時間，優選為至少三個月。在另一優選的實施方案中，通過有限稀釋和/或加入固定添加劑，以共轉染或共轉導表面標記的方式選擇轉染或轉導的細胞。
令人驚奇的是結果表明，儘管經逆轉錄病毒載體質粒轉染或用逆轉錄病毒載體轉導以後經歷幾個月大規模的長期操作，以這種方式處理的完全懸浮生長的包裝細胞系仍能生產逆轉錄病毒。
同樣令人驚奇的是，通過用逆轉錄病毒載體質粒轉染或用逆轉錄病毒載體轉導，經如有限稀釋的分離步驟(其可將細胞稀釋至實際每一容器懸液中只有單個細胞)，或採用固定添加劑例如鋪上層瓊脂或甲基纖維素(Metho Cult H4100/幹細胞技術)，或以細胞表面標記的方式分選細胞，從而能夠將這種完全懸浮生長的包裝細胞系克隆，由此形成的完全懸浮生長的逆轉錄病毒生產細胞系能夠與貼壁逆轉錄病毒生產細胞系同等程度地生產逆轉錄病毒載體。
與用攪拌式發酵罐或高密度透析培養方法培養的貼壁逆轉錄病毒生產細胞系相比較，以這種方式生產的逆轉錄病毒生產細胞系容許更為簡單的大規模培養。
此外，分離載體病毒的方法也不相同。對於貼壁逆轉錄病毒生產細胞系，僅僅需要移出包含逆轉錄病毒的培養上清液，並且儘管並非絕對必要，但為了安全的原因仍然總是要實行無菌過濾的步驟；而對於完全懸浮生長的逆轉錄病毒生產細胞系，更小更輕的逆轉錄病毒載體顆粒是通過過濾和離心步驟或至少兩次離心步驟與較大較重的生產細胞系分離的。
包含治療基因的逆轉錄病毒載體被用作逆轉錄病毒載體質粒或逆轉錄病毒載體。為了防止在懸浮生產細胞系生產過程中釋放有複製能力的逆轉錄病毒載體，這些載體不包含象gag、pol、env這樣的包裝序列。治療相關基因通常插在5′-LTR和3′-LTR之間，並且較為便利的是含有新黴素抗性基因或潮黴素抗性基因。
無複製能力(複製缺陷)的載體可理解為不包含逆轉錄病毒基因功能(gag、env、pol)因而不能獨立形成病毒顆粒的載體。然而，載體通常包含包裝功能(psi)。為了形成感染性的逆轉錄病毒顆粒，可用複製缺陷型DNA載體轉導包含穩定形式之基因功能gag、env和pol(作為游離體或整合到基因組中)的包裝細胞系。由於gag、env的功能，形成RNA轉錄物，其被包裝入病毒顆粒。這些病毒顆粒為複製缺陷型的，因為它們包含的RNA基因組並不攜帶逆轉錄病毒基因功能。縮略詞MoMuLV MoLoney鼠白血病病毒Fcs 胎牛血清ΔLNGFR 低親和力神經生長因子受體，其細胞內結構域缺失(參見WO95/06723)SV40-P/ESV40的啟動子/增強子單元neoR新黴素抗性基因pBR322 大腸桿菌基礎載體質粒T25 細胞培養瓶大小CMV-P/E CMV啟動子/增強子單元(參見例如EP-B0173177)TK-P單純皰疹胸苷激酶啟動子poly-A 聚腺苷酸化位點hygR潮黴素抗性基因gpt gpt選擇基因pUC19 基礎載體pUC20 基礎載體5′LTR MoMuLV MoMuLV的5′長末端重複序列cfu 集落形成單位本發明由以下實施例和公開發表的文獻進一步闡明，其範圍源於專利的權利要求書。描述的方法應理解為還可描述甚至經過修飾的發明主題的實施例。實施例1 改變貼壁逆轉錄病毒包裝細胞系使之適應懸浮生長貼壁包裝細胞系FLY A13(兼嗜性env，來自MoMuLV)和FLYRD18(env來自貓內源性病毒RD114)(Cosset，F-L.等，病毒學雜誌，69(1995)7430-7436)都基於人纖維瘤系HT1080，其通過以下方法步驟經改變以適應為懸浮生長a)改變貼壁包裝細胞系以適應懸浮生長I.連續並緩慢減少培養基中的胎牛血清，時間大約5個月；10％FCS-＞5％-＞2.5％-＞2％-＞1％-＞0.5％-＞無血清II.使用用於懸浮細胞系的培養基III.使用用於懸浮細胞系的培養瓶(Sarstedt)IV.在振搖器上連續緩和振搖培養瓶V.維持培養需要經常分離由胰蛋白酶和DNase酶處理形成的細胞團塊，並經常分散以保持懸浮。細胞濃度總是關鍵因素(5×104-1×106個細胞/毫升)，即絕不能太高或太稀。b)瞬時培養的逆轉錄病毒滴度測定懸浮生長的包裝細胞系與相應的貼壁生長的包裝細胞系就生產性質進行比較。
為此，用逆轉錄病毒載體質粒轉染所有細胞系，並測定瞬時培養物的逆轉錄病毒滴度。材料*逆轉錄病毒載體pLΔNSN(6853bp)[-5′LTR MoMuLV-Ψ-ΔLNGFR-SV40-P/E-neoR-3′LTRMoMuLV-pBR322-質粒部分-]*轉染試劑DOSPER；每次每份混合物加20μgDOSPER(製造商Boehringer Mannheim GmbH，GER)*質粒DNA濃度50μg DNA/混合物/質粒方法第1天接種用於轉染的細胞貼壁細胞6×105細胞/盤，在60mm培養皿上懸浮細胞3×105細胞/毫升；在用於懸浮細胞的培養瓶中(T25，Sarstedt，豎式的)；總量2毫升。溫和振搖，37℃下5％CO2中培養懸浮細胞過液。第2天變換培養基(對於懸浮細胞採用離心和重懸方法)，製備DNA/DOSPER混合物，逐滴加在細胞上(每種情況下100μlDNA/DOSPER混合物)。
37℃、5％CO2溫育5～6小時，隨後加入培養基。第3天轉染24小時後移出上清液，離心(只對於懸浮細胞系)、過濾(0.45μm濾器)，然後在NIH3T3細胞上滴定滴度(G418選擇)。
滴度結果約10-14天後。滴度貼壁細胞系 FLY A138×105cfu/ml2×105cfu/mlFLY RD18過去沒有測定過轉變為懸浮的細胞系FLY A132.4×103cfu/mlFLY RD181×102cfu/ml結果變為懸浮生長的包裝細胞系從理論上講能夠生產重組逆轉錄病毒。滴度的差異是由於在轉染和滴度測定時的實驗條件不同，例如懸浮細胞和貼壁細胞的轉染效率不同，以及無胎牛血清培養基和有胎牛血清培養基中的逆轉錄病毒的穩定性和感染性不同。實施例2經兩個輔助質粒和逆轉錄病毒載體質粒三重轉染懸浮細胞後逆轉錄病毒的生產一種貼壁細胞系和幾種懸浮生長細胞系在瞬時三重轉染製備時比較了其形成感染性逆轉錄病毒顆粒的能力。使用的細胞系貼壁細胞系(對照) NIH3T3(鼠纖維瘤)懸浮細胞系 K562(人紅細胞白血病細胞系)N1-S1(大鼠肝癌)C58(大鼠淋巴瘤)材料a)輔助質粒*gag-pol表達質粒pGAPOGPT(10202bp)[-CMV-P/E-gag-pol-polyA-SV40-P/E-gpt-polyA-pUC19-質粒部分-]*ENV表達質粒pENVCHT(7933bp)[-TK-P-hygR-polyA-CMV-P/E-env(兼嗜性)-IpolyA-pUC20-質粒部分-]b)逆轉錄病毒載體質粒*逆轉錄病毒載體pLΔNSN(6853bp)[-5′LTR MoMuLV-Ψ-ΔLNGFR-SV40-P/E-neoR-3′LTRMoMuLV-pBR322-質粒部分-]*轉染試劑DOSPER(BM)；每次20μgDOSPER/混合物*質粒DNA濃度50μg DNA/混合物/質粒方法第1天接種用於轉染的細胞貼壁細胞(NIH3T3)6×105細胞/盤，在60mm培養皿中懸浮細胞3×105細胞/ml；T25培養瓶中(用於懸浮細胞，豎式)；總量2ml，37℃、5％CO2溫和振搖懸浮細胞，培養過夜。第2天變換培養基(對於懸浮細胞採用離心和重懸方法)，製備DNA/DOSPER混合物，逐滴加在細胞上(每例100μlDNA/DOSPER混合物)。
37℃、5％CO2溫育5～6小時，隨後加入培養基。第3天三重轉染24小時後除去上清液，離心(僅適於懸浮細胞系)、過濾(0.45μm濾器)並在NIH3T3細胞上滴定滴度(G418選擇)大約10～14天以後滴定結果。在NIH3T3上的滴定結果(G418抗性集落數目)NIH3T3(貼壁對照細胞)每1.4ml病毒上清液中3個集落(滴度2cfu/ml)K562每0.8ml病毒上清液中6個集落(滴度7.5cfu/ml)N1-S1每2ml病毒上清液中6個集落(滴度3cfu/ml)C58每2ml病毒上清液中1個集落(滴度0.5cfu/ml)參考文獻表Cosset，F-L.等，病毒學雜誌，69(1995)7430-7436Danos，O.等，美國國家科學院院報，85(1988)6460-6464Markowitz，D.G.等，Trans.Assoc.Am.Physicians，101(1988)212-218Miller，A.D.等，病毒學雜誌，65(1991)2220-2224Miller，A.D.等，分子細胞生物學，6(1986)2895-2902Rigg，R.J.等，病毒學，218(1996)290-295WO92/0526權利要求
1.完全懸浮生長的包裝細胞系。
2.完全懸浮生長的包裝細胞系，其用逆轉錄病毒載體質粒轉染或用逆轉錄病毒載體轉導。
3.生產完全懸浮生長的包裝細胞系的方法，該細胞系用逆轉錄病毒載體質粒轉染或用逆轉錄病毒載體轉導，其中一種懸浮細胞系用逆轉錄病毒載體質粒轉染或用逆轉錄病毒載體轉導，以共轉染或共轉導表面標記的方式通過有限稀釋和/或加入固定添加劑選擇轉染或轉導的細胞，分離以這種方式選擇的懸浮細胞。
4.生產懸浮生長的包裝細胞系的方法，其中將培養於含血清培養基的用編碼輔助序列的核酸和逆轉錄病毒載體質粒轉染的，或用逆轉錄病毒載體轉導的貼壁生長包裝細胞系轉化為懸浮生長細胞系，方法是通過連續減少培養基中的血清含量直到無血清，反覆用胰蛋白酶和脫氧核糖核酸酶處理細胞以便細胞從支持物上脫離，其間懸液中的細胞濃度維持在5×104至1×106個細胞/ml的範圍內。
5.按照權利要求4中所要求的方法，其中該方法進行至少3個月的時間。
6.按照權利要求4或5中所要求的方法，其中以共轉染或共轉導表面標記的方式通過有限稀釋和/或加入固定添加劑選擇轉染或轉導的細胞。
全文摘要
本發明涉及一種經逆轉錄病毒質粒轉染或用逆轉錄病毒載體轉導的完全懸浮生長的包裝細胞系。本發明還涉及一種從懸浮細胞系或貼壁生長細胞系生產上述細胞系的方法。
文檔編號C12N1/15GK1277631SQ98810550
公開日2000年12月20日 申請日期1998年10月22日 優先權日1997年10月25日
發明者S·希伯, S·考赫, T·古特亞爾, U·斯迪格曼斯, R·魯格 申請人:羅切診斷學有限公司