一種重組畢赤酵母工程菌及其在合成萊鮑迪苷a中的應用的製作方法
2024-04-07 10:00:05 1
一種重組畢赤酵母工程菌及其在合成萊鮑迪苷a中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組畢赤酵母工程菌及將其用作全細胞催化劑合成萊鮑迪苷A的方法。本發明的重組畢赤酵母工程菌是通過將含有如下外源DNA的表達載體線性化後轉化畢赤酵母而獲得：編碼蔗糖合成酶Sus1的DNA序列如SEQIDNO.3所示，編碼UDP-糖基轉移酶UGT76G1的DNA序列如SEQIDNO.4所示。本發明的重組畢赤酵母工程菌實現Sus1的胞內表達和UGT76G1的表面展示表達，將本發明重組畢赤酵母用作全細胞催化劑可有效地用於合成萊鮑迪苷A，不僅提高了萊鮑迪苷A的合成效率和原料使用率、節約生產成本，並為萊鮑迪苷A的生產加工開闢新的工業化途徑。
【專利說明】一種重組畢赤酵母工程菌及其在合成萊鮑迪苷A中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程【技術領域】，尤其涉及一種重組畢赤酵母工程菌及其在合成萊鮑迪苷A中的應用。
【背景技術】
[0002]甜菊糖(Stev1l glycoside)是一種具有很多優良特性的高甜度天然甜味劑,在食品、飲料、釀酒、醫藥、日用化工等領域均有著巨大的應用價值。甜菊糖帶有後苦味和甘草異味，混合物組分複雜，難以對其質量規格進行統一，限制其應用。甜菊苷(Stev1side)和萊鮑迪苷A (Rebaud1side A)是甜菊糖中含量最豐富的兩種成分,分別佔幹葉重的5_10%和2-4%。萊鮑迪苷A (RA)是一種無毒、安全、低熱能、高甜度的天然甜昧劑，其甜度是蔗糖的150-300倍，熱值僅為蔗糖的I /300，而且口味純正，沒有後苦味；因而具有巨大的應用價值。目前製備高純度萊鮑迪苷A產品的方法有:培育高產萊鮑迪苷A的甜葉菊品種、樹脂吸附或重結晶提純萊鮑迪苷A、環糊精轉移酶等酶對甜菊糖進行改性，但都存在工藝繁瑣、成本高、效果不佳等缺點。那麼，是否能夠從萊鮑迪苷A (RA)的生物合成途逕入手，結合基因工程技術、構建一種以相應底物為基礎，通過發酵高效合成萊鮑迪苷A (RA)的工程菌，並將其運用於萊鮑迪苷A (RA)的合成加工領域，以提高萊鮑迪苷A (RA)的合成效率、節約生產成本，並為萊鮑迪苷A (RA)的生產加工開闢新的工業化途徑就顯得十分必要。
【發明內容】
[0003]有鑑於此，本發明所解決的技術問題在於克服現有技術中不足，提供一種共表達蔗糖合成酶Susl和UDP-糖基轉移酶UGT76G1的重組畢赤酵母工程菌及其構建方法。
[0004]本發明所解決的技術問題還在於將共表達蔗糖合成酶Susl和UDP-糖基轉移酶UGT76G1的重組畢赤酵母工程菌作為全細胞催化劑用於合成萊鮑迪苷A。
[0005]為了解決上述技術問題，本發明提供了一種重組畢赤酵母工程菌，該重組畢赤酵母工程菌是通過將含有如下外源DNA的表達載體線性化後轉化畢赤酵母而獲得:
編碼蔗糖合成酶基因的DNA序列如SEQ ID N0.3所示，
編碼UDP-糖基轉移酶的DNA序列如SEQ ID N0.4所示。
[0006]其中，所述表達載體包括胞內表達載體和表面展示表達載體,所述胞內表達載體克隆有編碼蔗糖合成酶基因的DNA序列，所述表面展示表達載體克隆有編碼UDP-糖基轉移酶的DNA序列。
[0007]優選地，所述胞內表達載體是將如SEQ ID N0.3所示的DNA序列克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體PPICZA而獲得胞內表達載體pPICZA-Susl ;所述表面展示表達載體是將如SEQ ID N0.3所示的DNA序列與錨定蛋白Gcw61編碼基因融合後克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體PPIC9K而獲得的表面展示表達載體pGCW61- UGT76G1。
[0008]另外，本發明還提供了一種重組畢赤酵母工程菌的構建方法，包括如下步驟: 步驟一、編碼基因的獲取:以蔗糖合成酶Susl和UDP-糖基轉移酶UGT76G1的胺基酸序列為基礎，對序列按照畢赤酵母的密碼子偏好性進行優化，得到密碼子優化的對應編碼序列；其中，蔗糖合成酶Susl胺基酸序列如SEQ ID N0.1所示，其編碼序列如SEQ ID N0.3所示；UDP-糖基轉移酶UGT76G1胺基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其編碼序列如SEQ IDN0.4所示；
步驟二、表達載體的構建:將步驟一獲取的編碼基因分別接入畢赤酵母的表達載體中，所述表達載體包括胞內表達載體和表面展示表達載體，所述胞內表達載體克隆有編碼蔗糖合成酶Susl的DNA序列，所述表面展示表達載體克隆有編碼UDP-糖基轉移酶UGT76G1的DNA序列；
步驟三、表達載體轉化及重組畢赤酵母工程菌獲取:將表面展示表達載體經酶切線性化並純化後電轉化至感受態細胞，並在選擇培養基上篩選陽性轉化子，從而得到初級重組畢赤酵母工程菌，再將胞內表達載體經酶切線性化並純化後電轉化初級重組畢赤酵母工程菌的感受態細胞，並在選擇培養基上篩選陽性轉化子，進而得到重組畢赤酵母工程菌；或者，將將胞內表達載體經酶切線性化並純化後電轉化至感受態細胞，並在選擇培養基上篩選陽性轉化子，從而得到初級重組畢赤酵母工程菌；再將表面展示表達載體經酶切線性化並純化後電轉化初級重組畢赤酵母工程菌的感受態細胞，並在選擇培養基上篩選陽性轉化子，進而得到重組畢赤酵母工程菌。
[0009]優選地，所述胞內表達載體是將如SEQ ID N0.3所示的DNA序列克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體PPICZA而獲得胞內表達載體pPICZA-Susl ;所述表面展示表達載體是將如SEQ ID N0.3所示的DNA序列與錨定蛋白Gcw61編碼基因融合後克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體PPIC9K而獲得的表面展示表達載體pGCW61- UGT76G1。
[0010]優選地，所述步驟三具體包括:將表面展示表達載體PGCW61-UGT76G1經Kpn2 I單酶切線性化並純化後電轉化Pichia pastoris GSl 15感受態細胞，並在MD平板上篩選陽性轉化子，從而得到工程菌GS115/ UGT76G1 ;再將胞內表達載體pPICZA-Susl經Pme I單酶切線性化並純化後電轉化上述GSl 15/ UGT76G1感受態細胞，並在博來黴素抗性平板上篩選陽性轉化子，進而得到重組畢赤酵母工程菌GS115/ Susl- UGT76G1。
[0011]另外，本發明還提供了一種全細胞催化劑，包含本發明的重組畢赤酵母工程菌。
[0012]優選地，所述全細胞催化劑是通過如下步驟製備而成:
Cl)挑取上述重組畢赤酵母工程菌接種至BMGY培養基進行初級培養至0D600接近
5.0-6.0，離心收集細胞；
(2)然後將收集的細胞重懸到BMMY培養基至起始0D600接近0.5-1.0，於25_35°C條件下進行次級培養，次級培養過程中每天補加終濃度1%甲醇，發酵3天後在離心回收菌體；
(3)菌體凍幹後即得到含重組畢赤酵母工程菌的全細胞催化劑。
[0013]另外，本發明還提供了一種萊鮑迪苷A的合成方法，該方法以蔗糖、二磷酸尿苷、甜菊苷為原料，以本發明的全細胞催化劑為催化劑合成萊鮑迪苷A。
[0014]優選地，該方法包括如下步驟:
(O按如下組分及其濃度製備反應體系；
50mM PBS緩衝液，
3mM MgCl2，
250 mM鹿糖，
0.5-lmM UDP,
3mg/mL甜菊苷；
(2)向反應體系中加入菌體量為300D含有重組畢赤酵母工程菌的全細胞催化劑，於37°C進行反應12h後終止反應；
(3)每200ul反應液用600ul正丁醇萃取反應體系中的萊鮑迪苷A，吸取上層正丁醇萃取液而後進行純化分離得到萊鮑迪苷A。
[0015]與現有技術相比，本發明優點在於:
本發明構建得到的重組畢赤酵母工程菌能同時實現蔗糖合成酶Susl的胞內表達和UDP-糖基轉移酶UGT76G1的表面展示表達。而從原理上講蔗糖合成酶Susl能夠將蔗糖的糖基轉移至Μ)Ρ上生成UDPG和果糖，而UDP-糖基轉移酶UGT76G1能特異性地催化ST苷和M)PG反應合成RA。因此，利用本發明共表達蔗糖合成酶Susl和UDP-糖基轉移酶UGT76G1的重組畢赤酵母能有效地將上述兩步反應聯合起來，以甜菊苷(ST)為原料、蔗糖為糖基供體，進行生物轉化高效合成合成萊鮑迪苷A (RA)。由本發明具體實施例中的實驗結果也充分表明採用本發明方案發酵獲得的全細胞催化劑可高效合成萊鮑迪苷A (RA)，其底物ST的轉化率達到95%以上，產量超過93%，不僅提高了萊鮑迪苷A (RA)的合成效率和原料使用率、節約生產成本，並為萊鮑迪苷A (RA)的生產加工開闢新的工業化途徑。
[0016]下面結合附圖和【具體實施方式】進一步詳細描述本發明，但本發明不局限於這些實施方式，任何在本發明基本精神上的改進或替代，仍屬於本發明權利要求書中所要求保護的範圍。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為重組畢赤酵母全細胞催化劑合成RA。A、B分別為反應前後的液相色譜檢測結果。ST和RA的出峰時間分別為6.1 min和7.8 min左右。
[0018]圖2為重組畢赤酵母全細胞催化劑循環使用能力的檢測。
[0019]圖3為合成體系中UDP添加量對RA產量的影響。
【具體實施方式】
[0020]下面結合具體製備實施例和應用實施例，對本發明作進一步詳細描述，但本發明的實施方式不限於此。
[0021]實施例1
基因Susl和UGT76G1的合成
以NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)公布的胺基酸序列為基礎,對序列按照畢赤酵母的密碼子偏好性進行優化，得到密碼子優化的Susl和UGT76G1基因，其序列分別如Seq N0.3和Seq N0.4所示，通過生物技術公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)進行全基因合成，合成的基因克隆在PUC57質粒(購自金斯瑞生物科技公司)上，得到質粒pUC57-Susl和 pUC57- UGT76G1。
[0022]實施例2
胞內表達載體pPICZA-Susl和展示表達載體pGCW61-UGT76Gl的構建
根據Susl基因序列設計正向引物SF (含EcoR I酶切位點)和反向引物SR (含Not I酶切位點)。以實施例1中的質粒PUC57- Susl為模板，SF和SR為引物進行PCR擴增。將膠回收純化後的PCR產物用限制性內切酶EcoR I和Not I進行雙酶切，與同樣經過EcoR I和Not I雙酶切的質粒pPICZA用T4連接酶16°C連接過夜，連接產物化學轉化E.coli ToplO(購自美國Invitrogen英傑生命技術有限公司)，經博萊黴素抗性平板篩選陽性轉化子，陽性轉化子提取質粒經EcoR I和Not I雙酶切鑑定正確後，得到胞內表達載體pPICZA-Susl。含有重組質粒pPICZA-Susl的克隆菌株E.coli ToplO/ pPICZA-Susl加15%甘油於_80°C保存。
[0023]根據UGT76G1基因設計正向引物UF (含EcoR I酶切位點)和反向引物UR (含MluI酶切位點)。以實施例1中的質粒PUC57-UGT76G1為模板，UF和UR為引物進行PCR擴增。將膠回收純化後的PCR產物用限制性內切酶EcoR I和Mlu I進行雙酶切。根據畢赤酵母錨定蛋白Gcw61p的編碼基因設計正向引物GF (含Mlu I酶切位點)和反向引物GR (含NotI酶切位點)。以畢赤酵母基因組為模板，GF和GR為引物進行PCR擴增。將膠回收純化後的PCR產物用限制性內切酶Mlu I和Not I進行雙酶切。將上述兩個片段與經過EcoR I和Not I雙酶切的質粒PPIC9K用T4連接酶16°C連接過夜，連接產物化學轉化E.coli ToplO(購自美國Invitrogen英傑生命技術有限公司)，經卡那黴素抗性平板篩選陽性轉化子，陽性轉化子提取質粒經酶切鑑定正確後，得到展示表達載體PGCW61-UGT76G1。含有重組質粒pGCW61- UGT76G1 的克隆菌株 E.coli ToplO/ pGCW61_ UGT76G1 加入 15% 甘油於 _80°C保存。
[0024]實施例3
重組畢赤酵母工程菌GS115/Susl-UGT76Gl的構建及全細胞催化劑的獲得將展示表達載體PGCW61-UGT76G1經Kpn2 I單酶切線性化並純化後電轉化Pichiapastoris GS115 (購自美國Invitrogen英傑生命技術有限公司)感受態細胞,並在MD平板上篩選陽性轉化子；從而得到工程菌GS115/ UGT76G1。將胞內表達載體pPICZA-Susl經Pme I單酶切線性化並純化後電轉化上述GS115/ UGT76G1感受態細胞，並在博來黴素抗性平板上篩選陽性轉化子；進而得到重組畢赤酵母工程菌GS115/ Susl- UGT76G1。
[0025]挑取上述重組畢赤酵母工程菌GSl 15/ Susl-UGT76G1接種至BMGY培養基，30°C，250rpm培養至0D600接近6.0,於6000rpm，4°C離心5min收集細胞，然後將收集的細胞重懸到BMMY培養基至起始0D600接近1.0，於30°C，250rpm震蕩培養，每天補加終濃度1%甲醇。發酵3天後在6000rpm，4°C離心5min回收菌體；菌體凍幹後即得到重組畢赤酵母全細胞催化劑。
[0026]實施例4
重組畢赤酵母全細胞催化劑合成萊胞迪苷A
200ul反應體系包含以下成分:50mM PBS緩衝液，3mM MgC12，250 mM蔗糖，ImM UDP,3mg/mL ST (甜菊苷)。加入菌體量為300D重組畢赤酵母全細胞催化劑，於37°C進行反應。反應12h後停止反應,每200ul反應液用600ul正丁醇萃取產物RA。吸取上層正丁醇萃取液，用0.2um有機系尼龍膜過濾後用液相色譜檢測RA的合成。
[0027]甜菊苷(ST)和萊鮑迪苷A (RA)的出峰時間為6.1 min和7.8 min左右。由圖1可知，反應12h後大部分ST被消耗，同時RA大量生成。實驗表明Susl在重組酵母胞內活性表達，反應物蔗糖和Μ)Ρ進入細胞後在Susl的作用下生成UDPG和果糖。生成的UDPG從胞內運出，在表面展示UGT76G1的催化下與ST反應生成產物RA。進一步計算得到，ST的轉化率為95.56%,同時RA的產率為93.79%。
[0028]實施例5
重組畢赤酵母全細胞催化劑循環使用能力的檢測
循環使用能力是全細胞催化劑的一個重要性能指標，因而要對的重組畢赤酵母全細胞催化劑的循環使用能力進行評價。將實施3中獲取的重組畢赤酵母加入反應體系，控制RA合成體系中的菌體量為300D，將反應12h後的反應液於9000rpm離心2 min，上清液取出保存於-20 ° C待用，用於測量RA的產量。菌體用pH7.2的0.05M PBS緩衝液洗滌兩次，再次加入RA合成體系進行RA的合成。重複上述操作共進行五次反應，每個反應設3組平行，最後用液相色譜檢測RA的生成，結果如圖2所示。由圖2可知，以第一次RA產量為100%，第二次反應的RA產量略有降低，而第三次重複使用時RA產量下降至51.61%。因此，循環使用次數應控制在三次以內，最好不要超過兩次。
[0029]實施例6
萊胞迪苷A合成體系中UDP添加量的優化
RA合成體系中UDP的價格相對較高，為控制RA合成成本、提高合成反應的經濟性，對反應體系中UDP的添加量進行優化。在200ul反應體系中添加不同濃度的UDP (0,0.25、
0.5、0.75、lmmol/L)，全細胞催化劑的量控制為300D。37。C反應12h，液相檢測RA的產量。如圖3所示,體系中不添加UDP,合成反應無法啟動,沒有RA生成。隨著UDP添加量的增加，RA的合成也相應增加。添加量大於0.25 mmol/L時，RA的生成量變化並不明顯。在進行RA合成反應時，應綜合根據UDP的成本和RA的產量選擇適和的UDP添加量。
[0030]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種重組畢赤酵母工程菌，其特徵在於，所述重組畢赤酵母工程菌是通過將含有如下外源DNA的表達載體線性化後轉化畢赤酵母而獲得: 編碼蔗糖合成酶Susl的DNA序列如SEQ ID N0.3所示， 編碼UDP-糖基轉移酶UGT76G1的DNA序列如SEQ ID N0.4所示。
2.如權利要求1所述的重組畢赤酵母工程菌，其特徵在於:所述表達載體包括胞內表達載體和表面展示表達載體，所述胞內表達載體克隆有編碼蔗糖合成酶Susl基因的DNA序列，所述表面展示表達載體克隆有編碼Μ)Ρ-糖基轉移酶UGT76G1的DNA序列。
3.如權利要求2所述的重組畢赤酵母工程菌，其特徵在於:所述胞內表達載體是將如SEQ ID N0.3所示的DNA序列克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體pPICZA而獲得胞內表達載體pPICZA-Susl ;所述表面展示表達載體是將如SEQ ID N0.3所示的DNA序列與錨定蛋白Gcw61編碼基因融合後克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體pPIC9K而獲得的表面展示表達載體pGCW61- UGT76G1。
4.一種重組畢赤酵母工程菌的構建方法，其特徵在於，包括如下步驟: 步驟一、編碼基因的獲取:以蔗糖合成酶Susl和UDP-糖基轉移酶UGT76G1的胺基酸序列為基礎，對序列按照畢赤酵母的密碼子偏好性進行優化，得到密碼子優化的對應編碼序列；其中，蔗糖合成酶Susl胺基酸序列如SEQ ID N0.1所示，其編碼序列如SEQ ID N0.3所示；UDP-糖基轉移酶UGT76G1胺基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其編碼序列如SEQ IDN0.4所示； 步驟二、表達載體的構建:將步驟一獲取的編碼基因分別接入畢赤酵母的表達載體中，所述表達載體包括胞內表達載體和表面展示表達載體，所述胞內表達載體克隆有編碼蔗糖合成酶Susl的DNA序列，所述表面展示表達載體克隆有編碼UDP-糖基轉移酶UGT76G1的DNA序列； 步驟三、表達載體轉化及重組畢赤酵母工程菌獲取:將表面展示表達載體經酶切線性化並純化後電轉化至感受態細胞，並在選擇培養基上篩選陽性轉化子，從而得到初級重組畢赤酵母工程菌，再將胞內表達載體經酶切線性化並純化後電轉化初級重組畢赤酵母工程菌的感受態細胞，並在選擇培養基上篩選陽性轉化子，進而得到重組畢赤酵母工程菌；或者，將將胞內表達載體經酶切線性化並純化後電轉化至感受態細胞，並在選擇培養基上篩選陽性轉化子，從而得到初級重組畢赤酵母工程菌；再將表面展示表達載體經酶切線性化並純化後電轉化初級重組畢赤酵母工程菌的感受態細胞，並在選擇培養基上篩選陽性轉化子，進而得到重組畢赤酵母工程菌。
5.如權利要求4所述的重組畢赤酵母工程菌的構建方法，其特徵在於:所述胞內表達載體是將如SEQ ID N0.3所示的DNA序列克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體pPICZA而獲得胞內表達載體pPICZA-Susl ;所述表面展示表達載體是將如SEQ ID N0.3所示的DNA序列與錨定蛋白Gcw61編碼基因融合後克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體PPIC9K而獲得的表面展示表達載體PGCW61- UGT76G1。
6.如權利要求5所述的重組畢赤酵母工程菌的構建方法，其特徵在於，所述步驟三具體包括:將表面展示表達載體PGCW61-UGT76G1經Kpn2 I單酶切線性化並純化後電轉化Pichia pastoris GS115感受態細胞，並在MD平板上篩選陽性轉化子，從而得到工程菌GS115/ UGT76G1 ;再將胞內表達載體pPICZA-Susl經Pme I單酶切線性化並純化後電轉化上述GS115/ UGT76G1感受態細胞，並在博來黴素抗性平板上篩選陽性轉化子，進而得到重組畢赤酵母工程菌GS115/ Susl- UGT76G1。
7.—種全細胞催化劑，其特徵在於:包含如權利要求1-3中任意一項所述的重組畢赤酵母工程菌。
8.如權利要求7所述的全細胞催化劑，其特徵在於，所述全細胞催化劑是通過如下步驟製備而成: Cl)挑取上述重組畢赤酵母工程菌接種至BMGY培養基進行初級培養至0D600接近5.0-6.0，離心收集細胞； (2)然後將收集的細胞重懸到BMMY培養基至起始0D600接近0.5-1.0，於25_35°C條件下進行次級培養，次級培養過程中每天補加終濃度1%甲醇，發酵3天後在離心回收菌體； (3)菌體凍幹後即得到含重組畢赤酵母工程菌的全細胞催化劑。
9.一種萊鮑迪苷A的合成方法，其特徵在於:該方法以蔗糖、二磷酸尿苷、甜菊苷為原料，以權利要求7或8中所述的全細胞催化劑為催化劑合成萊鮑迪苷A。
10.如權利要求9所述的萊鮑迪苷A的合成方法，其特徵在於，該方法包括如下步驟: (O按如下組分及其濃度製備反應體系； .50mM PBS緩衝液，
.3mM MgCl2， .250 mM鹿糖，
.0.5-lmM UDP, 3mg/mL甜菊苷； (2)向反應體系中加入菌體量為300D含有重組畢赤酵母工程菌的全細胞催化劑，於37°C進行反應12h後終止反應； (3)每200ul反應液用600ul正丁醇萃取反應體系中的萊鮑迪苷A，吸取上層正丁醇萃取液而後進行純化分離得到萊鮑迪苷A。
【文檔編號】C12N1/19GK104232496SQ201410477408
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月18日 優先權日:2014年9月18日
【發明者】林影, 梁書利, 毛國紅, 劉曉肖, 王蓓蓓 申請人:廣州康琳奈生物科技有限公司