殼聚糖固定化乙醯膽鹼酯酶電化學生物傳感器及應用的製作方法
2024-03-10 12:32:15
專利名稱：殼聚糖固定化乙醯膽鹼酯酶電化學生物傳感器及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種電化學生物傳感器及應用，尤其是殼聚糖固定化 乙醯膽鹼酯酶電化學生物傳感器及應用。
背景技術：
目前，農藥檢測的方法很多，有氣相色譜法、高效液相色譜法、 氣相色譜-質譜聯用技術、酶抑制法、免疫分析法、生物傳感器法。
色譜法涉及到比較複雜的前處理，設備要求高；酶抑制法缺點是測定 樣品和農藥種類有限，目前只用於蔬菜、水果中有機磷和氨基甲酸酯 類農藥的殘留檢測，且不能給出定性和定量結果，只能作為定性的快 速初篩檢測法；免疫分析法由於受到農藥種類繁多、抗體製備難度大、 在不能肯定樣本中存在農藥種類時檢測有一定的盲目性以及抗體依 賴國外進口等影響，應用範圍受到限制。
生物傳感器因為具有以下優點而引起各國研究者的興趣。 採用固定化生物活性物質作催化劑，價值昂貴的試劑可以重複多 次使用，或者採用微量酶試劑即可達到測量目的，克服了過去酶法分 析試劑費用高和化學分析繁瑣複雜的缺點。生物傳感器是由選擇性好 的生物材料構成的分子識別元件，專一性好，只對特定的底物起反應， 一般不需要進行樣品的預處理。作業系統比較簡單，容易實現自動分析。體積小，可以實現連續在位監測。分析速度快、樣品用量少。傳 感器連同測定儀的成本遠低於大型的分析儀器，因而便於推廣普及， 並用於家庭測量。
目前國內外研究現狀
An amperometric acetylthiocholine sensor based on immobilization of acetylcholinesterase on a multiwall carbon nanotube—cross-linked chitosan compositeW文章中，將殼聚糖溶液與戊二醛溶液混合，使殼 聚糖帶上自由的醛基，然後加入多壁碳納米管(MWNTs)，將此三 者(CMC)混合的液體塗於預處理好的玻碳電極(GCE)，再用滴 塗法加入AchE，此時形成AChE-CMC/GCE。
A disposable sensor based on immobilization of acetylcholinesterase to multiwall carbon nanotube modified screen-printed electrode for determination of carbaryF這篇文章中，將殼聚糖溶解於醋酸中， MWNTs加入醋酸纖維素中，將三者混合物處理後滴塗在處理好的絲 網印刷玻碳電極(SPCE)上，此時形成的是CAMC/SPCE，再將AchE 塗於CAMC/SPCE上，此時形成AChE-CAMC/SPCE 。
國內這方面的研究一般也是致力於乙醯膽鹼酯酶殼聚糖膜的研
究[3,4'5]。
本實驗室以前曾使用聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)而不是
殼聚糖，利用層層自組裝[6]法固定酶，層層自組裝法與滴塗法相比， 由於是利用了不同電荷間的靜電吸附作用，無疑更為牢固。但是通過
研究表明使用PDDA相比於使用殼聚糖的缺點是乙醯膽鹼酯酶較易脫落和滲漏。、 Dan Du , Xi Huang ， Jie Cai， Aidong Zhang ,Jiawang Ding ,Shizhen
Chen(2007) Anal Bioanal Chem 387:1059—1065 [2]、 Jie Cai, Dan Du (2008) J Appl Electrochem38:1217—1222 [3]、王曄,鄭劼，趙肅清,彭元,徐鳳彩.自製乙醯膽鹼酯酶膜對有機磷
農藥殘留的檢測研究[J].廣西輕工業2007,10(10):13-14、王曄,彭元,趙肅清,徐鳳彩.乙醯膽鹼酯酶殼聚糖膜的製備研究 [J].廣西科學院學報2007，23(2):85-88、王曄,彭元,趙肅清,徐鳳彩.乙醯膽鹼酯酶膜的酶學性質及其對 有機磷農藥的檢測效果[J].廣西科學院學報2007，23(3):160-162 、 Yongjin Zou， Cuili Xiang， Lixian Sun, Fen Xu(2008) Electrochimica Acta 53:4089409
發明內容
本發明的目的是為了克服使用PDDA固定乙醯膽鹼酯酶易脫落 和滲透的不足以及參考了國內外的一些研究成果，本發明提出了一種 採用殼聚糖固定化乙醯膽鹼酯酶而成的生物電化學傳感器。
本發明的技術原理
由於乙醯膽鹼酯酶的等電點Ip=4.5，故當酶液pH〉Ip時，AChE 帶負電荷。本研究根據等電點使酶帶上電荷，然後與帶相反電荷的殼 聚糖修飾層以離子鍵形式相互作用進行固定，構建了基於多壁碳納米 管和殼聚糖層層自組裝的乙醯膽鹼酯酶傳感器，並將其應用於有機磷農藥對硫磷的實際檢測。首先是利用電沉積技術將帶有負電荷的碳納 米管沉積到玻碳電極表面，隨後在殼聚糖溶液和碳納米管分散液中進 行層層靜電自組裝過程，得到自組裝效率高、修飾層穩定的修飾電極。
然後，在殼聚糖溶液和膽鹼酯酶的PBS溶液中再進行層層自組裝， 得到穩定性較高的固定化乙醯膽鹼酯酶電化學生物傳感器。
本發明的殼聚糖固定化乙醯膽鹼酯酶電化學生物傳感器，具體通
過如下步驟製備
(1) 、玻碳電極經過拋光、在pH7.40的磷酸鹽緩衝液中循環伏安掃描
10圈電化學活化進行預處理；
(2) 、將步驟(1)經預處理過的玻碳電極與鉑電極組成兩電極系統
進行電沉積2小時，形成亮藍色的帶有大量負電荷的碳納米管 的電沉積層；
(3) 、將步驟(2)中經過電沉積後的玻碳電極浸入到用2mol/L的醋
酸溶液分散，並且用氫氧化鈉調節pH值為5.0的0.5%的殼聚 糖溶液中，進行殼聚糖的靜電自組裝，15min後取出用去離子 水仔細衝洗2min，再浸入到pH9.18的四硼酸鈉溶液作為分散 劑的碳納米管的分散液中，進行碳納米管的靜電自組裝，其中 碳納米管的濃度為lmgTnL.1， 15min後取出，用去離子水小心 衝洗2min，至此，碳納米管修飾層為1層，反覆操作，直到 碳納米管的修飾層層數為5，最後，將得到的最外層為多壁碳 納米管的電極在紅外燈下烘乾；
(4) 、繼續將步驟(3)中所得的電極浸入到用2mol/L的醋酸溶液分散，並且用氫氧化鈉調節pH值為5.0的0.5%的殼聚糖溶液中， 進行殼聚糖的靜電自組裝，15min後取出用去離子水仔細衝洗 2min，除去多餘的殼聚糖，再浸入用pH為7.4的PBS配製的 100U乙醯膽鹼酯酶溶液中15min後取出，用去離子水仔細衝 洗電極表面2min，至此完成一層的乙醯膽鹼酯酶的組裝，如 此交替浸泡衝洗，直到乙醯膽鹼酯酶的修飾層數為4，便得到 殼聚糖固定化乙醯膽鹼酯酶電化學生物傳感器。 本發明的有益效果
本發明的殼聚糖固定化乙醯膽鹼酯酶電化學生物傳感器，酶電 極不易脫落，具有較好的重複性和穩定性，壽命比較長，而且可 以在常溫下迅速而穩定地檢測有機磷和氨基甲酸酯類農藥的濃 度，具有較高的靈敏度。 .
圖1 、殼聚糖固定化乙醯膽鹼酯酶電化學生物傳感器製備過程示意 圖
圖2、殼聚糖固定化乙醯膽鹼酯酶電化學生物傳感器 圖3 、傳感器的穩定性
圖4-a 、酶抑制率與對硫磷濃度負對數關係曲線
圖4-b 、生物傳感器測定對硫磷的標準曲線 '
圖5-a、酶抑制率與敵百蟲濃度負對數關係曲線
圖5-b 、生物傳感器測定敵百蟲的標準曲線
圖6-a 、酶抑制率與樂果濃度負對數關係曲線圖6-b 、生物傳感器測定樂果的標準曲線 圖7-a 、酶抑制率與馬拉硫磷濃度負對數關係曲線 圖7-b 、生物傳感器測定馬拉硫磷的標準曲線 圖8-a 、酶抑制率與克百威濃度負對數關係曲線 圖8-b 、生物傳感器測定克百威的標準曲線 圖9-a、酶抑制率與滅多威濃度負對數關係曲線 圖9-b、生物傳感器測定滅多威的標準曲線 圖10-a、酶抑制率與異丙威濃度負對數關係曲線 圖10-b、生物傳感器測定異丙威的標準曲線
具體實施例方式
下面通過實施例並結合附圖對本發明進一步說明。
實施例
殼聚糖固定化乙醯膽鹼酯酶電化學生物傳感器的製備，其製備過 程的示意圖見圖l。具體製備步驟如下
(1) 、玻碳電極經過拋光、在pH7.40的磷酸鹽緩衝液中循環伏安掃描
IO圈電化學活化進行預處理；
(2) 、將步驟(1)經預處理過的玻碳電極與鉑電極組成兩電極系統
進行電沉積2小時，形成亮藍色的帶有大量負電荷的碳納米管 的電沉積層；
(3) 、將步驟(2)中經過電沉積後的玻碳電極浸入到用2mol/L的醋
酸溶液分散，並且用氫氧化鈉調節pH值為5.0的0.5%的殼聚 糖溶液中，進行殼聚糖的靜電自組裝，15min後取出用去離子水仔細衝洗2min，再浸入到pH9.18的四硼酸鈉溶液作為分散 劑的碳納米管的分散液中，進行碳納米管的靜電自組裝，耳中 碳納米管的濃度為lmg，mL—1， 15min後取出，用去離子水小心 衝洗2min,至此，碳納米管修飾層為1層，反覆操作，直到 碳納米管的修飾層層數為5，最後，將得到的最外層為多壁碳 納米管的電極在紅外燈下烘乾； (4)、繼續將步驟(3)中所得的電極浸入到用2mol/L的醋酸溶液分 散，並且用氫氧化鈉調節pH值為5.0的0.5%的殼聚糖溶液中， 進行殼聚糖的靜電自組裝，15min後取出用去離子水仔細衝洗 2min，除去多餘的殼聚糖，再浸入用pH為7.4的PBS配製的 100U乙醯膽鹼酯酶溶液中15min後取出，用去離子水仔細衝 洗電極表面2min，至此完成一層的乙醯膽鹼酯酶的組裝，如 此交替浸泡衝洗，直到乙醯膽鹼酯酶的修飾層數為4，便得到 殼聚糖固定化乙醯膽鹼酯酶電化學生物傳感器，見附圖2。
殼聚糖固定化乙醯膽鹼酯酶電化學生物傳感器的應用
將製備好的固定化酶電極(乙醯膽鹼酯酶/殼聚糖)4/(MWNTs/ 殼聚糖}5/電沉積(ED) /玻碳電極(GCE)存放在pH-7.40的PBS 中4"C保存，30天內每5天在O.lOmoll"的PBS中測定其對60pL 0.10 mol丄-1的氯化乙醯硫代膽鹼(ATChCl)的電流響應。30天後， 酶電極的響應電流值仍有初始電流的85%。而直接將乙醯膽鹼酯 酶固定於(MWNTs/CSh/ED/GCE上時，響應信號在30天內降低 非常之快，10天內即降低到初始電流的50%左右，結果見圖3。對於有機磷農藥對硫磷，用100ppm的標準樣品逐級稀釋至 10^g丄'1，分別將酶電極浸入農藥溶液10min後，測定酶抑制率見圖
4。 如圖4是抑制率對對硫磷濃度的負對數的曲線。由圖4-a我們可 以看到，若以5%的抑制率作為檢出限的標準，那麼該生物傳感器對 對硫磷的檢出限可達.10^g丄—1。由圖4-b我們可以看到抑制率與對硫 磷濃度在10_9-10—5 g丄—1的範圍內呈良好的線性關係，線性回歸方程為 A (%) =133.08+13-log[C, (g.L")](相關係數R=0.9959)。
對於有機磷農藥敵百蟲，用100ppm的標準樣品逐級稀釋至 l(r12g.L"，分別將酶電極浸入農藥溶液10min後，測定酶抑制率見圖
5。 圖5是抑制率對敵百蟲濃度的負對數的曲線。由圖5-a我們可以 看到，若以5%的抑制率作為檢出限的標準，那麼該生物傳感器對敵 百蟲的檢出限可達10-Ug丄"。由圖5-b我們可以看到抑制率與敵百蟲 濃度在10—9-10'5g*L"的範圍內呈良好的線性關係，線性回歸方程為A
(%) =129.1 l+12.45.1og[C敵百蟲(g.L國1)](相關係數R=0.9994)。
對於有機磷農藥樂果，用100ppm的標準樣品逐級稀釋至 lO^g.I/1,分別將酶電極浸入農藥溶液10min後，測定酶抑制率見圖
6。 圖6是抑制率對樂果濃度的負對數的曲線。由圖6-a我們可以看 到，若以5%作為檢出限的標準，那麼該生物傳感器對樂果的檢出限 可達10-Hg.L—1。由圖.6-b我們可以看到抑制率與樂果濃度在10久1(T5 g-L—1的範圍內呈良好的線性關係，線性回歸方程為A (%) =122.58+11.48.1og[C樂果(g'L")](相關係數R=0.9923)。
對於有機磷農藥馬拉硫磷，用100ppm的標準樣品逐級稀釋至10^g丄"，分別將酶電極浸入農藥溶液10min後，測定酶抑制率見圖 7。圖7是抑制率對馬拉硫磷濃度的負對數的曲線。由圖7-a我們可 以看到，若以5%作為檢出限的標準，那麼該生物傳感器對馬拉硫磷 的檢出限可達10^g七"。由圖7-b我們可以看到抑制率與馬拉硫磷的 濃度在10-、10-Sg，L"的範圍內呈良好的線性關係，線性回歸方程為A (%) =119.76+11.3'log[C馬拉硫磷(g.L")](相關係數R-0.9973)。
對於氨基甲酸酯類農藥克百威，用100ppm的標準樣品逐級稀釋 至10^g丄"，分別將酶電極浸入農藥溶液10min後，測定酶抑制率見 圖8。圖8是抑制率對克百威濃度的負對數的曲線。由圖8-a我們可 以看到，若以5%作為檢出限的標準，那麼該生物傳感器對克百威的 檢出限可達10^g乇"。由圖8-b我們可以看到抑制率與克百威的濃度 在10久l(^g'I/1的範圍內呈良好的線性關係，線性回歸方程為A(%) =90.602+7.07-log[C克百威(g'L")](線性相關係數R=0.9900)。
對於氨基甲酸酯類農藥滅多威，用100ppm的標準樣品逐級稀釋 至10^g.L"，分別將酶電極浸入農藥溶液10min後，測定酶抑制率見 圖9。圖9是抑制率對滅多威濃度的負對數的曲線。由圖9-a我們可 以看到，若以5%作為檢出限的標準，那麼該生物傳感器對滅多威的 檢出限可達lO^g.L^由圖9-b我們可以看到抑制率與滅多威的濃度 在10《1(r、L"的範圍內呈良好的線性關係，線性回歸方程為A(%) :124.97+12.2Hog[C滅多威(g'L隱1)](相關係數R=0.9915)。
對於氨基甲酸酯類農藥異丙威，用100ppm的標準樣品逐級稀釋 至10^g.L"，分別將酶電極浸入農藥溶液10min後，測定酶抑制率見圖10。圖IO是抑制率對異丙威濃度的負對數的曲線。由10-a我們可 以看到，若以5%作為檢出限的標準，那麼該生物傳感器對異丙威的 檢出限可達10"Vl/1。由圖10-b我們可以看到抑制率與異丙威的濃 度在10—9-10—5 g丄"的範圍內呈較好的線性關係，線性回歸方程為A (%) =115.36+11.69'log[C異丙威(g'L—1)](相關係數R=0.9950)。
分別取3份10ml取自青島的海水樣品，用該傳感器對三份水樣 進行檢測，未檢出水樣中含有馬拉硫磷、樂果以及敵百蟲，然後分別 向3份海水樣品中加入O.lppm的馬拉硫磷、樂果以及敵百蟲標準溶 液各10pL，作回收實驗，結果如表l。可以看出，樣品的加標回收率 均在52.01%-136.87%之間，馬拉硫磷、敵百蟲、樂果的平均加標回 收率分別為89.5%、 100.6%和96.8%，說明該傳感器對於實際樣品中 的有機磷農藥具有較好的檢測效果。
分別取兩份10ml取自青島的海水樣品，用該傳感器對兩份水樣 進行檢測，未檢出水樣中含有異丙威以及滅多威，然後分別向兩份海 水樣品中加入O.lppm的異丙威以及滅多威標準溶液各10pL，作回收 實驗，其測定結果如表2。可以看出，樣品的加標回收率均在 75.37%-140.28%之間，異丙威和滅多威的平均加標回收率分別為 106.8%和120.8°/。，說明該傳感器對於實際樣品中的氨基甲酸酯類農 藥具有較好的檢測效果。
權利要求
1、一種殼聚糖固定化乙醯膽鹼酯酶電化學生物傳感器，其特徵在於通過下列步驟製備(1)、玻碳電極經過拋光、在pH值為7.40的磷酸鹽緩衝液中循環伏安掃描10圈電化學活化進行預處理；(2)、將步驟(1)經預處理過的玻碳電極與鉑電極組成兩電極系統進行電沉積2小時，形成亮藍色的帶有大量負電荷的碳納米管的電沉積層；(3)、將步驟(2)中經過電沉積後的玻碳電極浸入到用2mol/L的醋酸溶液分散，並且用氫氧化鈉調節pH值為5.0的0.5％的殼聚糖溶液中，進行殼聚糖的靜電自組裝，15min後取出用去離子水仔細衝洗2min，再浸入到pH9.18的四硼酸鈉溶液作為分散劑的碳納米管的分散液中，進行碳納米管的靜電自組裝，其中碳納米管的濃度為1mg·mL-1，15min後取出，用去離子水小心衝洗2min，至此，碳納米管修飾層為1層，反覆操作，直到碳納米管的修飾層層數為5，最後，將得到的最外層為多壁碳納米管的電極在紅外燈下烘乾；(4)、繼續將步驟(3)中所得的電極浸入到用2mol/L的醋酸溶液分散，並且用氫氧化鈉調節pH值為5.0的0.5％的殼聚糖溶液中，進行殼聚糖的靜電自組裝，15min後取出用去離子水仔細衝洗2min，除去多餘的殼聚糖，再浸入用pH為7.4的PBS配製的100U乙醯膽鹼酯酶溶液中15min後取出，用去離子水仔細衝洗電極表面2min，至此完成一層的乙醯膽鹼酯酶的組裝，如此交替浸泡衝洗，直到乙醯膽鹼酯酶的修飾層數為4，便得到殼聚糖固定化乙醯膽鹼酯酶電化學生物傳感器。
2、如權利要求1所述殼聚糖固定化乙醯膽鹼酯酶電化學生物傳感器， 其特徵在於可用於有機磷和氨基甲酸酯類農藥的檢測。
全文摘要
本發明涉及一種電化學生物傳感器及其應用，特別涉及一種殼聚糖固定化乙醯膽鹼酯酶電化學生物傳感器及其應用。即採用殼聚糖，採用層層自組裝方法固定乙醯膽鹼酯酶，而不是簡單的交聯法。這種生物傳感器檢測有機磷和氨基甲酸酯類農藥不僅具有較高的靈敏度，而且製備的酶電極不易脫落，具有較好的重複性和穩定性，壽命比較長。
文檔編號A01N57/00GK101526493SQ200910048779
公開日2009年9月9日 申請日期2009年4月3日 優先權日2009年4月3日
發明者張淑平, 彥 趙, 煒 鄭, 傑 馬 申請人:上海理工大學