檢測左旋肉鹼含量的方法與流程

2024-04-02 10:22:05

本發明涉及食品領域，具體的，本發明涉及檢測左旋肉鹼含量的方法。
背景技術：
：左旋肉鹼(L-carnitine)，又稱L-肉鹼或音譯卡尼丁，是一種促使脂肪轉化為能量的類胺基酸，紅色肉類是左旋肉鹼的主要來源，對人體無毒副作用。左旋肉鹼的主要生理功能是促進脂肪轉化成能量，服用左旋肉鹼能夠在減少身體脂肪、降低體重的同時，不減少水分和肌肉。目前國標法檢測左旋肉鹼含量，採用紫外分光光度法，一方面由於乙醯輔酶A和肉鹼乙醯轉移酶費用昂貴，一方面在比色階段花費時間較長。因此，目前國標法檢測左旋肉鹼含量的方法在使用上很大程度上受限於自身的缺陷。如何快速而高準確度的檢測食品中左旋肉鹼的含量，仍需進一步研究。技術實現要素：本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在於提出一種快速、準確地檢測食品中左旋肉鹼含量的方法。在本發明的第一方面，本發明提出了一種檢測左旋肉鹼含量的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括：將待測樣品與顯色液和乙醯輔酶A進行第一接觸和第一酶標檢測；將第一接觸後樣品與肉鹼乙醯轉移酶進行第二接觸和第二酶標檢測；以及基於第二酶標檢測與第一酶標檢測的差值，確定待測樣品中左旋肉鹼的含量。利用根據本發明實施例的檢測左旋肉鹼含量的方法，能夠快速、準確地檢測食品中左旋肉鹼含量，檢測時間相比於現有技術，縮短到15min左右，檢測效率，相比於現有技術，實現了批量檢測，檢測靈敏度，相比於現有技術，檢出限低至0.5mg/100g，定量限低至1.5mg/100g。根據本發明的實施例，上述方法還可以進一步包括如下附加技術特徵至少之一：根據本發明的實施例，所述第一酶標檢測和所述第二酶標檢測的檢測波長為405nm。發明人通過波長篩選實驗發現，在檢測波長405nm下，第一酶標檢測和第二酶標檢測差值大，檢測靈敏度更高。根據本發明的實施例，所述乙醯輔酶A是以水溶液的形式提供的，所述乙醯輔酶A的濃度為0.2～0.4mg/ml，優選0.4mg/ml；所述肉鹼乙醯轉移酶是以水溶液的形式提供的，所述肉鹼乙醯轉移酶的酶活為15～45units/ml。發明人在實驗中發現，乙醯輔酶A和肉鹼乙醯轉移酶的酶活在上述劑量下，對食品中乙醯輔酶A的檢測靈敏度和準確度更高。根據本發明的實施例，所述待測樣品、所述顯色液、所述乙醯輔酶A和所述肉鹼乙醯轉移酶的體積為100:40:50:50。發明人發現，在上述體積比下，顯色反應充分，對食品中乙醯輔酶A檢測準確度進一步提高，且不會造成顯色反應試劑的浪費。根據本發明的實施例，所述第二接觸的時間為10～20min，優選10min。發明人通過條件篩選實驗發現，第二接觸的時間為10～20min範圍內，標準曲線方程的線性較好，更進一步地，優選10min，這樣既保證了標準曲線的線性，又保證了較強的吸光度，對樣品中左旋肉鹼含量的檢測更加準確、可靠、靈敏。根據本發明的實施例，所述基於第二酶標檢測與第一酶標檢測的差值，確定待測樣品中左旋肉鹼的含量是通過如下方式實現的：將所述差值與標準曲線進行比對，其中，所述標準曲線是通過對左旋肉鹼標準工作液進行酶標檢測獲得的。通過上述方式獲得標準曲線，進而用於比對，可進一步提高檢測結果的準確度，提高檢測結果的穩定性。根據本發明的實施例，所述左旋肉鹼標準工作液是左旋肉鹼標準品的水溶液，所述左旋肉鹼標準品的濃度分別為1.6μg/ml，3.2μg/ml，6.4μg/ml，9.6μg/ml，16μg/ml。發明人通過實驗發現，在上述濃度梯度的左旋肉鹼標準品下，所得出的標準曲線適於與食品中左旋肉鹼的吸光度對應的差值進行比對，左旋肉鹼的吸光度對應的差值在標準曲線精確比對的區間，進而測得的食品中左旋肉鹼的含量更加準確。在本發明的第二方面，本發明提出了一種檢測左旋肉鹼含量的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括：(1)吸取製備好的左旋肉鹼標準工作液和待測樣品100uL於96孔微孔板中，每孔加入40uL顯色液和50μL乙醯輔酶A溶液，混合均勻後放入酶標儀樣品室中，檢測波長調為405nm，5min後進行讀數，結果記錄為A1；(2)拿出微孔板，每孔加入50μL肉鹼乙醯轉移酶溶液，混合均勻後放入酶標儀樣品室中，反應10min後讀數，結果記錄為A2；(3)以左旋肉鹼標準工作液的濃度為橫坐標，以左旋肉鹼標準工作液的吸光值A2-A1為縱坐標，製作標準曲線；以及(4)將待測樣品的吸光值A2-A1與標準曲線比對，獲得待測樣品中左旋肉鹼濃度，其中，所述左旋肉鹼標準工作液是左旋肉鹼標準品的水溶液，所述左旋肉鹼標準品的濃度分別為1.6μg/ml，3.2μg/ml，6.4μg/ml，9.6μg/ml，16μg/ml，所述顯色液中含有0.2mg/ml的2-硝基苯甲酸，23.84mg/ml的N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸，0.74mg/ml的乙二胺四乙酸二鈉，pH為7.4～7.6，所述乙醯輔酶A溶液是乙醯輔酶A的水溶液，所述乙醯輔酶A的濃度為0.4mg/ml，所述肉鹼乙醯轉移酶溶液是肉鹼乙醯轉移酶的水溶液，所述肉鹼乙醯轉移酶的酶活為15～45units/ml。利用根據本發明實施例的檢測左旋肉鹼含量的方法，能夠快速、準確地檢測食品中左旋肉鹼含量，檢測時間相比於現有技術，縮短到15min左右，檢測效率，相比於現有技術，實現了批量檢測，檢測靈敏度，相比於現有技術，檢出限低至0.5mg/100g，定量限低至1.5mg/100g。具體實施方式下面詳細描述本發明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。實施例中未註明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。在以下實施例1～4中，發明人分別從乙醯輔酶A的濃度、肉鹼乙醯轉移酶的用量、讀數時間、檢測波長的角度，對檢測左旋肉鹼含量的條件進行優化的實驗過程。實施例1檢測步驟：1.1準確稱取5g(精確0.0001g)混合均勻的試樣於燒杯中，溫水溶解，轉入100mL容量瓶中；加10mL10％高氯酸溶液，混合均勻後靜置30min。用蒸餾水定容至刻度，混勻，過濾。取濾液20mL，用4mol/L氫氧化鉀溶液調pH為12.5～13.0後，置於40℃水浴60min。冷卻後用10％高氯酸調pH為7.0～7.5。將樣液轉入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容。混勻後置於4℃冰箱中過夜。將試樣處理液從冰箱中取出放置至室溫，取上清液用0.45μm濾膜過濾後備用。1.2吸取100uL製備好的左旋肉鹼標準工作液和試樣待測液各三份於96孔微孔板中，按順序用排槍加入40uL顯色工作液和50μL乙醯輔酶A工作液，混合均勻後放入酶標儀樣品室中，檢測波長調為405nm，5min後進行讀數，結果記錄為A1(平行樣的吸光度平均值)。拿出微孔板，迅速用排槍按順序加入50μL肉鹼乙醯轉移酶溶液，混合均勻後放入酶標儀樣品室中，反應10min後讀數，結果記錄為A2(平行樣的吸光度平均值)，以左旋肉鹼標準工作液的濃度為橫坐標，以吸光值A2-A1為縱坐標，製作標準曲線，然後在標準曲線上查得試樣待測液的濃度通過計算得出樣品中左旋肉鹼的含量。左旋肉鹼標準儲備液(80.52μg/mL)：可根據需要製備不同濃度的標準儲備液。左旋肉鹼標準工作液：可根據需要製備不同濃度的標準工作液。顯色工作液：吸取1.0mL顯色儲備液用水定容至5mL。乙醯輔酶A工作液：吸取100uL乙醯輔酶A儲備液，用水稀釋至2.5mL，臨用時配置。肉鹼乙醯轉移酶工作液：吸取100μL乙醯肉鹼轉移酶懸浮液，用水稀釋至4mL，臨用時配置。1)、標準曲線的建立：根據檢測方法建立標準曲線的原始數據如表1和表2所示。表1：表2左旋肉鹼濃度(μg/mL)吸光度A1吸光度A2A2-A11.610.0910.1450.0543.220.0910.1810.0906.440.0910.2490.1589.660.0930.3150.22216.10.0910.4240.333以左旋肉鹼濃度為X軸，A2-A1的值為Y軸，做散點圖，進而得出標準曲線計算公式為：Y＝0.019X+0.029，曲線相關性為R2＝0.997。2)、根據標準曲線通過計算得到樣品的左旋肉鹼含量。計算的原始數據如表3和表4所示：表3：表4：3)、回收率驗證：在不同日期採用上述方法對樣品進行左旋肉鹼三水平加標回收率的驗證，加標水平分別為8mg/100g、10mg/100g、12mg/100g，其結果如表5所示：序號2016.4.82016.4.28回收率-8mg/100g(％)99.499.2回收率-10mg/100g(％)101.998.4回收率-12mg/100g(％)101.595.54)、檢出限：0.5mg/100g，定量限：1.5mg/100g實施例2檢測步驟：2.1準確稱取5g(精確0.0001g)混合均勻的試樣於燒杯中，溫水溶解，轉入100mL容量瓶中；加10mL10％高氯酸溶液，混合均勻後靜置30min。用蒸餾水定容至刻度，混勻，過濾。取濾液20mL，用4mol/L氫氧化鉀溶液調pH為12.5～13.0後，置於40℃水浴60min。冷卻後用10％高氯酸調pH為7.0～7.5。將樣液轉入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容。混勻後置於4℃冰箱中過夜。將試樣處理液從冰箱中取出放置至室溫，取上清液用0.45μm濾膜過濾後備用。2.2吸取100uL製備好的左旋肉鹼標準工作液和試樣待測液各三份於96孔微孔板中，按順序用排槍加入40uL顯色工作液和50μL乙醯輔酶A工作液，混合均勻後放入酶標儀樣品室中，檢測波長調為405nm，5min後進行讀數，結果記錄為A1(平行樣的吸光度平均值)。拿出微孔板，迅速用排槍按順序加入50μL肉鹼乙醯轉移酶溶液，混合均勻後放入酶標儀樣品室中，反應10min後讀數，結果記錄為A2(平行樣的吸光度平均值)，以左旋肉鹼標準工作液的濃度為橫坐標，以吸光值A2-A1為縱坐標，製作標準曲線，然後在標準曲線上查得試樣待測液的濃度通過計算得出樣品中左旋肉鹼的含量。左旋肉鹼標準儲備液(80.52μg/mL)：可根據需要製備不同濃度的標準儲備液。左旋肉鹼標準工作液：可根據需要製備不同濃度的標準工作液。顯色工作液：吸取1.0mL顯色儲備液用水定容至5mL。乙醯輔酶A工作液：吸取100uL乙醯輔酶A儲備液，用水稀釋至5mL，臨用時配置。肉鹼乙醯轉移酶工作液：吸取100μL乙醯肉鹼轉移酶懸浮液，用水稀釋至2mL，臨用時配置。結果顯示，標準曲線的計算公式為：y＝0.0209x+0.0347，曲線相關性為R2＝0.9992樣品的檢測數據如表5所示。表5：表5結果顯示，左旋肉鹼轉移酶和乙醯輔酶A在實施例2的配比下得到的結果在平行樣偏差範圍內。實施例3檢測步驟：3.1準確稱取5g(精確0.0001g)混合均勻的試樣於燒杯中，溫水溶解，轉入100mL容量瓶中；加10mL10％高氯酸溶液，混合均勻後靜置30min。用蒸餾水定容至刻度，混勻，過濾。取濾液20mL，用4mol/L氫氧化鉀溶液調pH為12.5～13.0後，置於40℃水浴60min。冷卻後用10％高氯酸調pH為7.0～7.5。將樣液轉入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容。混勻後置於4℃冰箱中過夜。將試樣處理液從冰箱中取出放置至室溫，取上清液用0.45μm濾膜過濾後備用。3.2吸取100uL製備好的左旋肉鹼標準工作液和試樣待測液各三份於96孔微孔板中，按順序用排槍加入40uL顯色工作液和50μL乙醯輔酶A工作液，混合均勻後放入酶標儀樣品室中，檢測波長調為405nm，5min後進行讀數，結果記錄為A1(平行樣的吸光度平均值)。拿出微孔板，迅速用排槍按順序加入50μL肉鹼乙醯轉移酶溶液，混合均勻後放入酶標儀樣品室中，分別反應7、8、10、13、15、20min後讀數，結果記錄為A2(平行樣的吸光度平均值)，以左旋肉鹼標準工作液的濃度為橫坐標，以吸光值A2-A1為縱坐標，製作標準曲線，然後在標準曲線上查得試樣待測液的濃度通過計算得出樣品中左旋肉鹼的含量。左旋肉鹼標準儲備液(80.52μg/mL)：可根據需要製備不同濃度的標準儲備液。左旋肉鹼標準工作液：可根據需要製備不同濃度的標準工作液。顯色工作液：吸取1.0mL顯色儲備液用水定容至5mL。乙醯輔酶A工作液：吸取100uL乙醯輔酶A儲備液，用水稀釋至2.5mL，臨用時配置。肉鹼乙醯轉移酶工作液：吸取100μL乙醯肉鹼轉移酶懸浮液，用水稀釋至4mL，臨用時配置。在不同時間點讀數所得標準曲線的線性方程和所得樣品中左旋肉鹼的含量如表6所示。表6：計算7-20min的比色結果，與國標法測定的結果之間的相對偏差在10％範圍內，但其比色時間在7min、8min時其反應不完全，標準曲線方程線性不好，10min-20min時其標準曲線方程線性較好，但隨著時間的增加，其吸光度也有所下降，因此首選10min作為最優比色時間。實施例4在本實施例中，發明人採取450nm的波長作為檢測波長進行吸光度的讀數，其餘條件與實施例1相同，其讀數結果如表7所示。表7：通過以上左旋肉鹼標準樣品的數據做出的標準曲線方程為：y＝0.0131x+0.0083；R2＝0.9984由表7可以看出吸光度A2和A1的差距比較小，這樣誤差會變大，因此不宜採用450nm作為其吸收波長。根據實施例1～4的條件篩選結果，發明人得出：檢測左旋肉鹼含量的方法可採用如下步驟：檢測步驟：吸取製備好的左旋肉鹼標準工作液和試樣待測液100uL-150uL(優選100uL)(可吸取平行樣2-4個)於96孔微孔板中，按順序用排槍加入40uL顯色工作液和50μL乙醯輔酶A溶液，混合均勻後放入酶標儀樣品室中，檢測波長調為405nm，5min後進行讀數，結果記錄為A1(平行樣的吸光度平均值)。拿出微孔板，迅速用排槍按順序加入50μL肉鹼乙醯轉移酶溶液，混合均勻後放入酶標儀樣品室中，反應10-20min(優選10min)後讀數，結果記錄為A2(平行樣的吸光度平均值)，以左旋肉鹼標準工作液的濃度為橫坐標，以吸光值A2-A1為縱坐標，製作標準曲線，然後在標準曲線上查得試樣待測液的濃度通過計算得出樣品中左旋肉鹼的含量。左旋肉鹼標準儲備液(80μg/mL)：可根據需要製備不同濃度的標準儲備液。左旋肉鹼標準工作液：可根據需要製備不同濃度的標準工作液。顯色工作液：吸取1.0mL顯色儲備液用水定容至5mL。乙醯輔酶A工作液：吸取100uL乙醯輔酶A儲備液，溶於2.5mL或5mL水中(優選2.5mL)，臨用時配置。肉鹼乙醯轉移酶工作液：吸取100μL肉鹼乙醯轉移酶懸浮液，溶於2mL或4mL水中(優選4mL)，臨用時配置。在本說明書的描述中，參考術語「一個實施例」、「一些實施例」、「示例」、「具體示例」、或「一些示例」等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特徵、結構、材料或者特點包含於本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特徵、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特徵進行結合和組合。儘管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在本發明的範圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp