一種大規模細胞生產和培養的高效率培養系統及應用方法與流程
2024-03-27 23:48:05
本發明涉及細胞工業化生產技術領域，尤其涉及一種大規模細胞生產和培養的高效率培養系統及應用方法。
背景技術：
細胞培養是把細胞在人工環境下，利用營養物質等，使其繁育增殖，並用於各種目的的培養過程。細胞培養現已廣泛應用於科研、生物製藥、再生醫學、臨床應用和基因工程等各個領域。
隨著社會的進步，科技的蓬勃發展，人類對生命質量和預期壽命也有了更高的期望。擁有一個健康、幸福、快樂的生命周期是每一個人的夢想。但如同腫瘤等頑疾，傳統的治療手段所帶來的副作用也讓很多的患者痛苦不堪。
細胞治療是近幾年興起的疾病治療新技術，是指利用某些具有特定功能的細胞的特性，採用生物工程方法獲取和通過體外擴增、培養修飾後，使這些細胞具有增強免疫殺傷能力、特異性識別病原體和腫瘤細胞、促進組織器官再生和機體康復等治療功效，從而達到治療疾病的目的。
該技術以良好的療效、低副作用和個性化等獨特的優勢，為一些難治性疾病的治療，提供新的選擇。在當前和今後很長的階段，細胞治療都將在臨床治療中擔當重要的角色，二十一世紀將是細胞治療發揮重要作用的時代。
細胞治療技術中「細胞體外培養」是最為關鍵、重要的一環。它是細胞治療的基礎，直接關係到治療的效果和安全性。而在細胞治療中針對患者回輸的細胞數量巨大，並且質量要求極高，因此需要在極其嚴格的萬級實驗室環境下的百級工作檯進行長時間的培養，培養過程中需要有專門受過長時間培訓的專業培養人員進行操作。因所培養的細胞最終是需要回輸人體，因此必須確保所培養細胞的安全性，絕對不受汙染。因此在細胞培養過程中維持無菌環境佔整個過程的大部分時間，所耗費的人力、物力和財力是不可估量的，但即使在設備完善的實驗室內，若操作者技術操作不規範，也會導致汙染，最終導致一系列的治療方案的延遲，對患者的治療造成危害。大批量，高要求的培養細胞作為細胞治療的關鍵，僅僅依靠實驗室環境下的專人培養已經無法滿足日益增長的科研、生物製藥、再生醫學、臨床應用和基因工程等需求，並且還存在很多缺點。因此亟需一種新的細胞生產系統及其相關配套部件。
技術實現要素：
本發明為一種大規模細胞生產和培養的高效率培養系統及應用方法，相較於現有的細胞培養技術，本發明採用可以隔絕汙染環境的細胞培養袋進行細胞培養的全過程，可以簡化細胞培養的步驟，降低細胞培養的苛刻要求，節省成本。採用透氣的細胞培養袋來進行細胞培養，僅需保證細胞培養袋內的環境是無菌環境即可，無需要求培養環境無菌的實驗室和工作檯，減少了實驗室中採用手工消毒過程存在的汙染風險，能夠極大保證細胞培養的安全性，簡化細胞培養步驟。使用本發明的細胞培養袋，只需在乾淨環境下即可進行細胞的培養。其次，本發明的細胞培養過程中所需步驟極為簡化，無需傳統細胞培養的各項技術要求，對於細胞培養人員無需進行長時間專業培訓，即可進行操作，能夠降低細胞培養的難度，適合細胞的大批量培養。
為達到以上目的，本發明採取的技術方案是：
一種大規模細胞生產和培養的高效率培養系統，包括至少一個細胞培養袋和至少一個細胞培養基保存袋；
所述細胞培養袋用於細胞培養，並且細胞培養袋存在不同的規格，所述細胞培養袋的下端密封邊緣處間隔設有連接管，所述連接管包括第一連接管、第二連接管和第三連接管，第一連接管用於輸注培養基，第二連接管用於細胞的輸出，第三連接管用於細胞的輸入；
所述細胞培養基保存袋用於儲存製備的細胞培養基，為細胞培養袋的細胞培養輸注細胞培養基，細胞培養基保存袋存在不同的規格，所述細胞培養基保存袋的下端密封邊緣處設有連接管，所述連接管包括第四連接管、第五連接管，第四連接管、第五連接管用於向細胞培養袋輸注細胞培養基；
所述第一連接管、第二連接管、第三連接管、第四連接管、第五連接管的管口採用熱合密封方式密封。
在上述方案的基礎上，所述的細胞培養袋至少包括第一細胞培養袋和第二細胞培養袋，所述的第一細胞培養袋的連接管與所述的第二細胞培養袋的連接管連接時，採用接管法連接；
所述的細胞培養袋的連接管與所述的細胞培養基保存袋的連接管連接時，採用接管法連接，
所述的接管法連接，藉助無菌熱合方式進行熱合連接或熱切斷開，通過高溫瞬間操作保證無菌汙染。
在上述方案的基礎上，所述的第一細胞培養袋的第二連接管與所述的第二細胞培養袋的第三連接管連接時，採用接管法連接；
所述的細胞培養袋的第一連接管與所述的細胞培養基保存袋的第四連接管或第五連接管連接時，採用接管法連接。
所述的細胞培養袋為保證袋內培養的細胞濃度維持在一個有效區間內，細胞培養袋從體積上分為不同的規格，不同規格的細胞培養袋構成這個完整的培養體系。根據實際需求的細胞數量，細胞培養袋的規格可以不斷上延。細胞培養時，根據細胞初始數量，一般從小規格細胞培養袋開始培養，到原規格細胞培養袋的培養液體積無法維持合適的細胞濃度，則將原細胞培養袋通過細胞輸出連接管與大一級規格的細胞培養袋細胞輸入連接管，通過接管熱合完成細胞和培養液在不同細胞培養袋的轉移；轉移完成後，通過熱切斷，分離兩個細胞培養袋；
為維持培養過程中的細胞密度，當細胞密度升高時，需要添加細胞培養基。細胞培養基保存袋的培養基輸注連接管和細胞培養袋的培養基輸入連接管連接，通過熱合完成細胞培養液輸入細胞培養袋，輸注完成後通過熱切斷，分離細胞培養袋和細胞培養基保存袋連接管，並熱壓密封。
在上述方案的基礎上，所述細胞培養袋的規格包括50ml、200ml、2000ml、5000ml，細胞培養基保存袋的規格包括50ml、100ml、200ml，為保證細胞培養過程中維持適宜的細胞培養濃度，而設計不同規格細胞培養袋和細胞培養基保存袋，在細胞培養過程中，通過向細胞培養基保存袋中添加細胞培養基或更換更大規格的細胞培養袋來維持適宜的細胞培養濃度，根據不同的細胞種植密度的需求，採用相應規格大小的細胞培養袋和細胞培養基保存袋。
在上述方案的基礎上，所述細胞培養基保存袋體上設有刻度，便於調整輸注培養基量。
在上述方案的基礎上，所述細胞培養袋和連接管的材質為符合塑料水溶性注射容器標準的高透氣性材質。
在上述方案的基礎上，所述高透氣性材質可以選用聚乙烯、tpx或eva等。
在上述方案的基礎上，所述細胞培養基保存袋由高阻隔性的不透氣材質製成，因採用不透氣的材料製成，能夠有效保證培養基的安全無菌環境，可一次性多量製備。
所述大規模細胞生產和培養的高效率培養系統的應用方法，包括以下步驟：
1、配製細胞培養基，將細胞培養基置於細胞培養基保存袋中，一次性製備多個細胞培養基保存袋，將細胞培養基保存袋放置於4℃環境中冷儲待用；使用時將裝有細胞培養基的細胞培養基保存袋升溫至37℃；
2、將所需培養的細胞通過第三連接管注入細胞培養袋中，同時使用接管法將細胞培養基保存袋的第四連接管或第五連接管通過無菌熱合接管機與細胞培養袋的第一連接管熱合連接，通過擠壓將細胞培養基注入細胞培養袋，當細胞培養基輸注完畢後，採用無菌熱合接管機高溫瞬間截斷第四連接管或第五連接管和第一連接管，並將第四連接管或第五連接管和第一連接管的管口熱合密封，使細胞培養袋與細胞培養基保存袋分離；
3、在細胞培養過程中，通過比濁法進行細胞培養濃度的測定，當細胞培養未在適宜培養濃度時，需要添注細胞培養基，取用細胞培養基保存袋，採用無菌熱合接管機將細胞培養基保存袋連接的第四連接管或第五連接管與細胞培養袋連接的第一連接管熱合連接，能夠有效保證在無菌環境下，將細胞培養基保存袋中的細胞培養基擠壓至細胞培養袋中；
4、當細胞培養基輸注完畢後，採用無菌熱合接管機高溫瞬間截斷第四連接管或第五連接管和第一連接管，並將第四連接管或第五連接管和第一連接管的管口熱合密封，使細胞培養袋與細胞培養基保存袋分離；
5、在細胞培養過程中隨著培養時間增長，當細胞培養袋無法保證細胞適宜培養濃度時，需要更換更大規格的細胞培養袋，通過無菌熱合接管機將原細胞培養袋中培養的細胞通過第二連接管轉移到規格更大的細胞培養袋中，繼續進行培養；
6、原細胞培養袋中培養的細胞轉移完成後，通過無菌熱合接管機將原細胞培養袋和現細胞培養袋分離即可。
在上述方案的基礎上，所述細胞培養基包括細胞生產因子、無血清培養基和基礎培養基。
在上述方案的基礎上，所述細胞培養的細胞種類包括懸浮細胞和貼壁細胞，所述懸浮細胞種類包括免疫細胞，貼壁細胞種類包括間充質幹細胞和ips及其誘導分化幹細胞；所述細胞培養方式包括懸浮培養和貼壁培養。
在上述方案的基礎上，所述細胞培養袋中的細胞培養濃度，採用比濁法進行確定，通過使用分光光度計測定細胞培養液吸光度，對比細胞濃度標準曲線來確定所述的細胞培養濃度。
在上述方案的基礎上，所述的細胞培養袋培養於細胞培養箱中，所述的細胞培養箱為co2細胞培養箱。
有益效果：
1、本細胞培養系統中所採用的細胞培養袋，安全性高，結構簡單、設計合理、使用方便，通過設置細胞培養袋和細胞培養基保存袋，使用時極為安全方便，各個細胞培養袋之間在需要進行連接時採用無菌熱合接管機熱合連接，降低了細胞汙染和操作人員感染的機率，提高了操作的安全性，提高了細胞培養的工作效率，可專用於細胞培養箱中。
2、本系統的細胞培養袋採用符合塑料水溶性注射容器標準的透氣材質，在細胞培養過程中無溶出物質，不含對細胞產生不良影響的可塑劑或溶出物質；採用高透氣性的聚乙烯、tpx或eva等，可以滿足細胞培養時氣體濃度環境要求和ph值的要求；採用連接管連接，在注入細胞培養基或者取樣時，通過直接接觸操作，提高了操作的安全性；與使用培養瓶相比，氣體交換面積大，利於在有限的培養空間內大量培養，可獲得更多數量的細胞，封閉式培養，降低了細胞汙染和操作人員感染的機率；細胞培養袋的材質透明柔韌，便於在顯微鏡下直接觀察細胞的狀態。
該發明的技術關鍵點和欲保護點：
1、本發明主要為一種常規環境下使用的大規模細胞生產和培養的高效率培養系統，包括細胞培養袋和細胞培養基保存袋，各袋相互獨立，且各袋存在不同的規格。
2、細胞培養袋採用符合塑料水溶性注射容器標準的透氣材質，連接有三根連接管，分別為第一連接管、第二連接管和第三連接管，細胞培養基保存袋為不透氣材質，連接第四連接管、第五連接管。
3、各個袋體之間平時為獨立狀態，需要進行培養液輸注時採用無菌熱合接管機保證無菌狀態下進行熱合連接、斷開。
4、細胞培養中通過根據不同細胞的培養密度，選用不同大小的細胞培養袋進行培養，以保證細胞生長的最佳濃度。
5、細胞培養基保存袋可一次性多量製備細胞培養基，一周內用完即可，無需隨時製備，細胞培養基保存袋體上存在刻度。
6本細胞培養系統培養的細胞種類包括懸浮細胞和貼壁細胞。
附圖說明
本發明有如下附圖：
圖1細胞培養袋的結構圖。
圖2細胞培養基保存袋的結構圖。
具體實施方式
以下結合附圖1和2對本發明作進一步詳細說明。
一種大規模細胞生產和培養的高效率培養系統，包括至少一個細胞培養袋和至少一個細胞培養基保存袋；
所述細胞培養袋用於細胞培養，並且細胞培養袋存在不同的規格，所述細胞培養袋的下端密封邊緣處間隔設有連接管，所述連接管包括第一連接管1、第二連接管2和第三連接管3，第一連接管1用於輸注培養基，第二連接管2用於細胞的輸出，第三連接管3用於細胞的輸入；
所述細胞培養基保存袋用於儲存製備的細胞培養基，為細胞培養袋的細胞培養輸注細胞培養基，細胞培養基保存袋存在不同的規格，所述細胞培養基保存袋的下端密封邊緣處設有連接管，所述連接管包括第四連接管4、第五連接管5，第四連接管4、第五連接管5用於向細胞培養袋輸注細胞培養基；
所述第一連接管1、第二連接管2、第三連接管3、第四連接管4、第五連接管5的管口採用熱合密封方式密封。
在上述方案的基礎上，所述的細胞培養袋至少包括第一細胞培養袋和第二細胞培養袋，所述的第一細胞培養袋的連接管與所述的第二細胞培養袋的連接管連接時，採用接管法連接；
所述的細胞培養袋的連接管與所述的細胞培養基保存袋的連接管連接時，採用接管法連接，
所述的接管法連接，藉助無菌熱合方式進行熱合連接或熱切斷開，通過高溫瞬間操作保證無菌汙染。
在上述方案的基礎上，所述的第一細胞培養袋的第二連接管2與所述的第二細胞培養袋的第三連接管3連接時，採用接管法連接；
所述的細胞培養袋的第一連接管1與所述的細胞培養基保存袋的第四連接管4或第五連接管5連接時，採用接管法連接。
在上述方案的基礎上，所述細胞培養袋的規格包括50ml、200ml、2000ml、5000ml，細胞培養基保存袋的規格包括50ml、100ml、200ml，為保證細胞培養過程中維持適宜的細胞培養濃度，而設計不同規格細胞培養袋和細胞培養基保存袋，在細胞培養過程中，通過向細胞培養基保存袋中添加培養基或更換更大規格的細胞培養袋來維持適宜的細胞培養濃度，根據不同的細胞種植密度的需求，採用相應規格大小的細胞培養袋和細胞培養基保存袋。
在上述方案的基礎上，所述細胞培養基保存袋體上設有刻度，便於調整輸注培養基量。
在上述方案的基礎上，所述細胞培養袋和連接管的材質為符合塑料水溶性注射容器標準的高透氣性材質。
在上述方案的基礎上，所述高透氣性材質可以選用聚乙烯、tpx或eva等。
在上述方案的基礎上，所述細胞培養基保存袋由高阻隔性的不透氣材質製成，因採用不透氣的材料製成，能夠有效保證培養基的安全無菌環境，可一次性多量製備。
所述大規模細胞生產和培養的高效率培養系統的應用方法，包括以下步驟：
1、配製細胞培養基，將細胞培養基置於細胞培養基保存袋中，一次性製備多個細胞培養基保存袋，將細胞培養基保存袋放置於4℃環境中冷儲待用；使用時將裝有細胞培養基的細胞培養基保存袋升溫至37℃；
2、將所需培養的細胞通過第三連接管3注入細胞培養袋中，同時使用接管法將細胞培養基保存袋的第四連接管4或第五連接管5通過無菌熱合接管機與細胞培養袋的第一連接管1熱合連接，通過擠壓將細胞培養基注入細胞培養袋，當細胞培養基輸注完畢後，採用無菌熱合接管機高溫瞬間截斷第四連接管4或第五連接管5和第一連接管1，並將第四連接管4或第五連接管5和第一連接管1的管口熱合密封，使細胞培養袋與細胞培養基保存袋分離；
3、在細胞培養過程中，通過比濁法進行細胞培養濃度的測定，當細胞培養未在適宜培養濃度時，需要添注細胞培養基，取用細胞培養基保存袋，採用無菌熱合接管機將細胞培養基保存袋連接的第四連接管4或第五連接管5與細胞培養袋連接的第一連接管1熱合連接，能夠有效保證在無菌環境下，將細胞培養基保存袋中的細胞培養基擠壓至細胞培養袋中；
4、當細胞培養基輸注完畢後，採用無菌熱合接管機高溫瞬間截斷第四連接管4或第五連接管5和第一連接管1，並將第四連接管4或第五連接管5和第一連接管1的管口熱合密封，使細胞培養袋與細胞培養基保存袋分離；
5、在細胞培養過程中隨著培養時間增長，當細胞培養袋無法保證細胞適宜培養濃度時，需要更換更大規格的細胞培養袋，通過無菌熱合接管機將原細胞培養袋中培養的細胞通過第二連接管2轉移到規格更大的細胞培養袋中，繼續進行培養；
6、原細胞培養袋中培養的細胞轉移完成後，通過無菌熱合接管機將原細胞培養袋和現細胞培養袋分離即可。
在上述方案的基礎上，所述細胞培養基包括細胞生產因子、無血清培養基和基礎培養基。
在上述方案的基礎上，所述細胞培養的細胞種類包括懸浮細胞和貼壁細胞，所述懸浮細胞種類包括免疫細胞，貼壁細胞種類包括間充質幹細胞和ips及其誘導分化幹細胞。
在上述方案的基礎上，所述細胞培養袋中的細胞培養濃度，採用比濁法進行確定，通過使用分光光度計測定細胞培養液吸光度，對比細胞濃度標準曲線來確定所述的細胞培養濃度。
在上述方案的基礎上，所述的細胞培養袋培養於細胞培養箱中，所述的細胞培養箱為co2細胞培養箱。
細胞培養過程中通過比濁法來判斷培養的細胞濃度，(前期採用標準的細胞方法已經繪製完成細胞濃度標準曲線，通過曲線獲知細胞培養基添加量)獲知細胞的培養狀態，確定培養狀態後，通過調節細胞培養基的多少(輸注細胞培養基)和細胞培養袋的大小(更換細胞培養袋)來保證培養過程中細胞培養濃度，保證最優的培養效果。
實施例1：
選取適用於細胞培養的高透氣性的塑料材質，按照圖1的方式，製備為細胞培養袋，採用高頻熱合的方式，將連接管焊接於細胞培養袋的下端，其中第二連接管2用於細胞的輸出以便收集；第一連接管1用於輸注培養基；第三連接管3用於細胞的輸入。
實施例2：
選取高阻隔性，不透氣的塑料材質，按照圖2的方式，製備為細胞培養基保存袋，採用高頻熱合的方式，將連接管焊接於細胞培養基保存袋的下端，其中第四連接管4、第五連接管5用於向細胞培養袋輸注細胞培養基；細胞培養基保存袋體上設有刻度。
實施例3
可在開放環境下，使用無菌熱合接管機，將細胞培養袋的第一連接管1與細胞培養基保存袋的第四連接管4或第五連接管5熱合連接後，將新鮮的細胞培養基注入細胞培養袋，進行細胞擴增培養。
本說明書中未作詳細描述的內容屬於本領域專業技術人員公知的現有技術。