一種菸草黑脛病病菌液固複合體系培養方法及培養物應用的製作方法
2024-03-01 15:34:15
專利名稱：一種菸草黑脛病病菌液固複合體系培養方法及培養物應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於農業微生物發酵工程技術領域，具體涉及一種菸草黑脛病病菌液固複合體系培養方法及培養物的應用。
背景技術：
菸草黑脛病(tobacco black shank)是世界菸草生產中危害最嚴重的病害之一， 特別是在溫帶、亞熱帶和熱帶發生較重，也是我國菸草生產的主要病害類型。目前，在實驗室、溫室有採用平板菌絲塊、攪碎菌絲液、遊動孢子液等製備菸草黑脛病病菌接種體的方法。這幾類方法製備的接種體操作複雜、技術難度大，一般不適用於大田人工接種。在田間菸草黑脛病病菌接種體應用較多的是穀物培養接種體，主要供菸草種質資源抗性鑑定或藥劑篩選時人工接種病原物用。這種穀物培養是將平板上的菌絲塊直接接種到穀物培養基表面，讓菌絲由內向四周、由上向下生長、蔓延。由於是單點或幾點表層接種， 菌絲通常需要45飛0天才可能長滿整個基質，周期較長；培養時上下層菌絲生長不同步，導致上部菌絲過度老熟、而下部菌絲過於幼嫩，固體培養物不均一，影響病菌的侵染，造成極大人為誤差；而且培養時病菌菌絲不能很快佔領基質而為其他可能汙染的雜菌提供了生長的機會，導致病菌培養的雜菌汙染，培養病菌失敗。此外，穀物培養接種體的穀粒過大，大量過剩的營養物為其潛在的拮抗微生物提供了豐富的養料，致使拮抗微生物迅速繁殖，而病菌接種體的有效數量急劇下降，不能形成有效浸染。因此，如何有效地固體培養菸草黑脛病病菌是菸草育種、植保工作中值得探索的技術問題。
發明內容
下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制， 基於本發明教導所作的任何變更或改進，均屬於本發明的保護範圍。本發明的第一目的是通過以下技術方案來實現的，包括病菌分離、平板培養、液體培養、固體培養，具體包括以下步驟
A、病菌分離，從發病田塊中採集病株，經過分離、純化、致病力測定，獲得病菌，將菌種採用菌絲塊水浸法置於10°C條件下恆溫保存，備用；
B、平板培養，將病菌接種於培養基平板上，於M 30°C溫度下培養5 7天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養物，用作液體培養菌種；
C、液體培養，將B步驟得到的平板菌絲接種於培養液中，於M 30°C溫度下，13(Tl50r/ min轉速下振蕩培養5 7天，培養得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團，鏡檢可發現遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個以上；
D、固體培養，將C步驟得到的液體菌絲接種於固體培養基，2Γ30 培養8 12天，培養得到的固體培養物整個基質布滿白色菌絲，菌絲經過液體浸泡、低溫誘導、室溫釋放孢子， 鏡檢可見遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個以上。本發明的另一目的是這樣實現的，培養物用於菸草黑脛病的人工接種物，或者用於製備帶菸草黑脛病病菌病土的添加物。本發明相對於現有技術，具有以下優點及效果
(1)培養質量穩定。本發明通過增加液體培養步驟來增大固體培養的接種量，能使病菌迅速佔領基質，達到同步、快速生長，生長周期短，比常規縮短培養時間1(Γ15天，在嚴格無菌操作的前提下，可杜絕雜菌汙染；通過嚴密控制培養的每一個流程，從而形成科學完整的質量保障措施；而且每一個流程時間控制範圍窄，可合理安排培養時間，保障病菌培養質量的時效性；
(2)培養病菌的有效侵染數量大。培養所用的顆粒比通常用的穀粒小3飛倍，病菌能佔據整粒基質，過剩的營養物質少，這樣既能促進病菌的繼續繁殖，又能避免潛在拮抗微生物的生長、使病菌免於消解，病菌的有效侵染數量大。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制， 基於本發明教導所作的任何變更或改進，均屬於本發明的保護範圍。包括病菌分離、平板培養、液體培養、固體培養，具體包括以下步驟
Α、病菌分離，從發病田塊中採集病株，經過分離、純化、致病力測定，獲得病菌，將菌種採用菌絲塊水浸法置於10°C條件下恆溫保存，備用；
B、平板培養，將病菌接種於培養基平板上，於M 30°C溫度下培養5 7天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養物，用作液體培養菌種；
C、液體培養，將B步驟得到的平板菌絲接種於培養液中，於M 30°C溫度下，13(Tl50r/ min轉速下振蕩培養5 7天，培養得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團，鏡檢可發現遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個以上；
D、固體培養，將C步驟得到的液體菌絲接種於固體培養基，2Γ30 培養8 12天，培養得到的固體培養物整個基質布滿白色菌絲，菌絲經過液體浸泡、低溫誘導、室溫釋放孢子， 鏡檢可見遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個以上。所述的B步驟培養基為燕麥、芝麻、黑麥、白芸豆、利馬豆、大豆培養基中的任意一種。所述的C步驟培養液為2(T30g的燕麥、芝麻、黑麥、白芸豆、利馬豆、大豆中任意一種，加入IOOOmL蒸餾水中浸泡1818小時後，將組織搗碎後過濾，常規溼熱方法滅菌，再加入用l(T20g 6 7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌製備的煙根組織液混勻即成，所述培養液佔容器容積的309Γ50%。所述的C步驟培養液為15(T250g新鮮胡蘿蔔、番茄、大豆芽、綠豆芽中的任意一種，加入IOOOmL餾水，將組織搗碎後過濾，再依次經過0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾後滅菌； 再加入用l(T20g 6 7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌製備的煙根組織液混勻即成，所述培養液佔容器容積的309Γ50%。所述的C步驟平板菌絲接種於培養液是用滅菌的解剖刀切取菸草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為2、X 2 4mm，固體培養基載體厚度為廣2mm，每100毫升培養液接種菌絲2 4塊。所述的D步驟固體培養基為粒徑廣3mm的粗米糠或粉碎豌豆杆或蠶豆杆中的一種或一種以上，與粗麥麩以3 4:廣2的質量比混勻，加入409Γ50%的水充分混勻，固體培養基佔容器容積的50% 80%，常規溼熱滅菌。所述的D步驟固體培養基為粒徑廣3mm的新鮮豆腐渣和粗麥麩以6 8:廣2的質量比混勻，加水混合控制含水量為409Γ50%，固體培養基佔容器容積的509Γ80%，常規溼熱滅菌。所述的D步驟液體菌絲接種於固體培養基系按39Γ5%的體積比加入，加入後培養基底部無積液。實施例1
將從發病田塊中採集病株，經過分離、純化、致病力測定，獲得病菌，將菌種採用菌絲塊水浸法置於10°c條件下恆溫保存，備用；將病菌接種於培養基為IOg燕麥在IOOOmL蒸餾水中浸泡M小時後，將組織搗碎後過濾，常規溼熱方法滅菌，再加入用IOg 6 7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌製備的煙根組織液混勻，並製成培養基板，於溫度下培養5天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養物，用作液體培養菌種；再將得到的平板菌絲接種於以150g新鮮胡蘿蔔加入IOOOmL餾水將組織搗碎後過濾，再依次經過 0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾後滅菌；再加入用IOg 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、 過濾滅菌製備的煙根組織液混勻即成培養液中，平板菌絲接種於培養液是用滅菌解剖刀切取菸草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為4X4mm，固體培養基載體厚度為1. 9mm，每100毫升培養液接種菌絲2塊。接種後於溫度下，130r/min轉速下振蕩培養7天，培養得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團，鏡檢可發現遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個以上；將得到的液體菌絲接種於粒徑Imm的新鮮豆腐渣與粗麥麩以8:2的質量比混勻，控制含水量在45%的固體培養基中，液體菌絲按固體培養基4% 的體積比加入，加入後培養基底部無積液，28°C培養9天，培養得到的固體培養物整個基質布滿白色菌絲，菌絲經過液體浸泡、低溫誘導、室溫釋放孢子，鏡檢可見遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個以上。獲得的培養物可作為菸草黑脛病的人工接種物，或者用於製備帶菸草黑脛病病菌病土的添加物之用。實施例2
將從發病田塊中採集病株，經過分離、純化、致病力測定，獲得病菌，將菌種採用菌絲塊水浸法置於10°c條件下恆溫保存，備用；將病菌接種於培養基為30g芝麻在IOOOmL蒸餾水中浸泡18小時後，將組織搗碎後過濾，常規溼熱方法滅菌，再加入用20g 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌製備的煙根組織液混勻，並製成培養基板，於30°C溫度下培養5天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養物，用作液體培養菌種；再將得到的平板菌絲接種於以150g新鮮胡蘿蔔加入IOOOmL餾水將組織搗碎後過濾，再依次經過 0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾後滅菌；再加入用IOg 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、 過濾滅菌製備的煙根組織液混勻即成培養液中，平板菌絲接種於培養液是用滅菌解剖刀切取菸草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為2 X 2mm，固體培養基載體厚度為1mm，每100毫升培養液接種菌絲2塊。接種後於30°C溫度下，150r/min轉速下振蕩培養7天，培養得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團，鏡檢可發現遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個以上；將得到的液體菌絲接種於粗米糠與粗麥麩以4:1的質量比混勻，加入50%的水充分混勻製得的固體培養基，液體菌絲按固體培養基4. 5%的體積比加入，加入後培養基底部無積液，24°C培養10天，培養得到的固體培養物整個基質布滿白色菌絲，菌絲經過液體浸泡、低溫誘導、室溫釋放孢子，鏡檢可見遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個以上。獲得的培養物可作為菸草黑脛病的人工接種物， 或者用於製備帶菸草黑脛病病菌病土的添加物之用。實施例3
將從發病田塊中採集病株，經過分離、純化、致病力測定，獲得病菌，將菌種採用菌絲塊水浸法置於10°c條件下恆溫保存，備用；將病菌接種於培養基為28g利馬豆在IOOOmL蒸餾水中浸泡觀小時後，將組織搗碎後過濾，常規溼熱方法滅菌，再加入用15g 6 7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌製備的煙根組織液混勻，並製成培養基板，於溫度下培養6天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養物，用作液體培養菌種；再將得到的平板菌絲接種於以250g新鮮番茄加入IOOOmL餾水將組織搗碎後過濾，再依次經過 0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾後滅菌；再加入用15g 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、 過濾滅菌製備的煙根組織液混勻即成培養液中，平板菌絲接種於培養液是用滅菌解剖刀切取菸草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為4X4mm，固體培養基載體厚度為2mm，每100毫升培養液接種菌絲4塊。接種後於溫度下，140r/min轉速下振蕩培養6天，培養得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團，鏡檢可發現遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個以上；將得到的液體菌絲接種於豌豆杆粉與粗麥麩以3 1的質量比混勻，加入45%的水充分混勻製得的固體培養基，液體菌絲按固體培養基3. 5%的體積比加入，加入後培養基底部無積液，28°C培養9天，培養得到的固體培養物整個基質布滿白色菌絲，菌絲經過液體浸泡、低溫誘導、室溫釋放孢子，鏡檢可見遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個以上。獲得的培養物可作為菸草黑脛病的人工接種物， 或者用於製備帶菸草黑脛病病菌病土的添加物之用。實施例4
將從發病田塊中採集病株，經過分離、純化、致病力測定，獲得病菌，將菌種採用菌絲塊水浸法置於10°c條件下恆溫保存，備用；將病菌接種於培養基為20g白芸豆在IOOOmL蒸餾水中浸泡觀小時後，將組織搗碎後過濾，常規溼熱方法滅菌，再加入用IOg 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌製備的煙根組織液混勻，並製成培養基板，於溫度下培養7天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養物，用作液體培養菌種；再將得到的平板菌絲接種於以150g新鮮大豆芽加入IOOOmL餾水將組織搗碎後過濾，再依次經過0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾後滅菌；再加入用20g 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌製備的煙根組織液混勻即成培養液中，平板菌絲接種於培養液是用滅菌解剖刀切取菸草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為3 X 3mm，固體培養基載體厚度為1. 5mm，每 100毫升培養液接種菌絲3塊。接種後於溫度下，130r/min轉速下振蕩培養7天，培養得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團，鏡檢可發現遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個以上；將得到的液體菌絲接種於蠶豆杆粉與粗麥麩以3:1. 5的質量比混勻，加入50%的水充分混勻製得的固體培養基，液體菌絲按固體培養基3%的體積比加入，加入後培養基底部無積液，27°C培養10天，培養得到的固體培養物整個基質布滿白色菌絲，菌絲經過液體浸泡、低溫誘導、室溫釋放孢子，鏡檢可見遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個以上。獲得的培養物可作為菸草黑脛病的
6人工接種物，或者用於製備帶菸草黑脛病病菌病土的添加物之用。實施例5
將從發病田塊中採集病株，經過分離、純化、致病力測定，獲得病菌，將菌種採用菌絲塊水浸法置於10°c條件下恆溫保存，備用；將病菌接種於培養基為25g黑麥在IOOOmL蒸餾水中浸泡23小時後，將組織搗碎後過濾，常規溼熱方法滅菌，再加入用14g 6 7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌製備的煙根組織液混勻，並製成培養基板，於溫度下培養6天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養物，用作液體培養菌種；再將得到的平板菌絲接種於以250g新鮮綠豆芽加入IOOOmL餾水將組織搗碎後過濾，再依次經過 0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾後滅菌；再加入用20g 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、 過濾滅菌製備的煙根組織液混勻即成培養液中，平板菌絲接種於培養液是用滅菌解剖刀切取菸草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為4X4mm，固體培養基載體厚度為2mm，每100毫升培養液接種菌絲2塊。接種後於25°C溫度下，150r/min轉速下振蕩培養6天，培養得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團，鏡檢可發現遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個以上；將得到的液體菌絲接種於粗米糠與豌豆杆粉1:1混合後，再與粗麥麩以3:2的質量比混勻，加入50%的水充分混勻製得的固體培養基，液體菌絲按固體培養基4%的體積比加入，加入後培養基底部無積液，^TC培養8天，培養得到的固體培養物整個基質布滿白色菌絲，菌絲經過液體浸泡、低溫誘導、室溫釋放孢子，鏡檢可見遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個以上。獲得的培養物可作為菸草黑脛病的人工接種物，或者用於製備帶菸草黑脛病病菌病土的添加物之用。實施例6
將從發病田塊中採集病株，經過分離、純化、致病力測定，獲得病菌，將菌種採用菌絲塊水浸法置於10°c條件下恆溫保存，備用；將病菌接種於培養基為20g大豆在IOOOmL蒸餾水中浸泡27小時後，將組織搗碎後過濾，常規溼熱方法滅菌，再加入用17g 6 7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌製備的煙根組織液混勻，並製成培養基板，於30°C溫度下培養5天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養物，用作液體培養菌種；再將得到的平板菌絲接種於以150g新鮮胡蘿蔔和IOOg番茄加入IOOOmL餾水將組織搗碎後過濾， 再依次經過0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾後滅菌；再加入用IOg 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌製備的煙根組織液混勻即成培養液中，平板菌絲接種於培養液是用滅菌解剖刀切取菸草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為2. 5X2. 5mm,固體培養基載體厚度為1. 7mm,每100毫升培養液接種菌絲3塊。接種後於溫度下，140r/min轉速下振蕩培養5天，培養得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團，鏡檢可發現遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個以上；將得到的液體菌絲接種於粒徑 Imm的粗米糠與蠶豆杆粉的混合物與粗麥麩以4:1的質量比混勻，加入50%的水充分混勻製得的固體培養基，液體菌絲按固體培養基5%的體積比加入，加入後培養基底部無積液，
培養10天，培養得到的固體培養物整個基質布滿白色菌絲，菌絲經過液體浸泡、低溫誘導、室溫釋放孢子，鏡檢可見遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個以上。獲得的培養物可作為菸草黑脛病的人工接種物，或者用於製備帶菸草黑脛病病菌病土的添加物之用。實施例7將從發病田塊中採集病株，經過分離、純化、致病力測定，獲得病菌，將菌種採用菌絲塊水浸法置於10°C條件下恆溫保存，備用；將病菌接種於培養基為20g燕麥在IOOOmL蒸餾水中浸泡沈小時後，將組織搗碎後過濾，常規溼熱方法滅菌，再加入用18g 6 7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌製備的煙根組織液混勻，並製成培養基板，於30°C溫度下培養5天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養物，用作液體培養菌種；再將得到的平板菌絲接種於以130g新鮮胡蘿蔔和120g番茄加入IOOOmL餾水將組織搗碎後過濾， 再依次經過0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾後滅菌；再加入用17g 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌製備的煙根組織液混勻即成培養液中，平板菌絲接種於培養液是用滅菌解剖刀切取菸草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為3. 5X3. 5mm,固體培養基載體厚度為1. 9mm,每100毫升培養液接種菌絲4塊。接種後於溫度下，130r/min轉速下振蕩培養7天，培養得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團，鏡檢可發現遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個以上；將得到的液體菌絲接種於粒徑3mm 的新鮮豆腐渣與粗麥麩以6:1的質量比混勻，控制含水量在45%的固體培養基中，液體菌絲按固體培養基3%的體積比加入，加入後培養基底部無積液，培養9天，培養得到的固體培養物整個基質布滿白色菌絲，菌絲經過液體浸泡、低溫誘導、室溫釋放孢子，鏡檢可見遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個以上。獲得的培養物可作為菸草黑脛病的人工接種物，或者用於製備帶菸草黑脛病病菌病土的添加物之用。
權利要求
1.一種菸草黑脛病病菌的液固複合體系培養方法，包括病菌分離、平板培養、液體培養、固體培養，其特徵在於培養方法具體包括以下步驟A、病菌分離，從發病田塊中採集病株，經過分離、純化、致病力測定，獲得病菌，將菌種採用菌絲塊水浸法置於10°C條件下恆溫保存，備用；B、平板培養，將病菌接種於培養基平板上，於M 30°C溫度下培養5 7天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養物，用作液體培養菌種；C、液體培養，將B步驟得到的平板菌絲接種於培養液中，於M 30°C溫度下，13(Tl50r/min轉速下振蕩培養5 7天，培養得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團，鏡檢可發現遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個以上；D、固體培養，將C步驟得到的液體菌絲接種於固體培養基，2Γ30 培養8 12天，培養得到的固體培養物整個基質布滿白色菌絲，菌絲經過液體浸泡、低溫誘導、室溫釋放孢子，鏡檢可見遊動孢子囊和遊動孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個以上。
2.根據權利要求1所述的液固複合體系培養方法，其特徵是所述的B步驟中的培養基為燕麥、芝麻、黑麥、白芸豆、利馬豆、大豆培養基中的任意一種。
3.根據權利要求1或2所述的液固複合體系培養方法，其特徵在於所述的C步驟中的培養液為2(T30g的燕麥、芝麻、黑麥、白芸豆、利馬豆、大豆中任意一種，加入IOOOmL蒸餾水中浸泡1818小時後，將組織搗碎後過濾，常規溼熱方法滅菌，再加入用l(T20g 6 7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌製備的煙根組織液混勻即得到培養液，所述培養液佔容器容積的30% 50%。
4.根據權利要求1或2所述的液固複合體系培養方法，其特徵是所述的C步驟中的培養液為15(T250g新鮮胡蘿蔔、番茄、大豆芽、綠豆芽中的任意一種，加入IOOOmL餾水，將組織搗碎後過濾，再依次經過0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾後滅菌；再加入用l(T20g 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌製備的煙根組織液混勻即成，所述培養液佔容器容積的30% 50%。
5.根據權利要求1所述的液固複合體系培養方法，其特徵是所述的C步驟平板菌絲接種於培養液是用滅菌的解剖刀切取菸草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為2 4X2 4mm，固體培養基載體厚度為廣2mm，每100毫升培養液接種菌絲2、塊。
6.根據權利要求1所述的液固複合體系培養方法，其特徵是所述的D步驟固體培養基為粒徑廣3mm的粗米糠或豌豆杆粉或蠶豆杆粉中的一種或一種以上，與粗麥麩以3 4:廣2的質量比混勻，加入40% 50%的水充分混勻，固體培養基佔容器容積的50% 80%，常規溼熱滅菌。
7.根據權利要求1或6所述的液固複合體系培養方法，其特徵是所述的D步驟固體培養基為粒徑廣3mm的新鮮豆腐渣和粗麥麩以6 8:廣2的質量比混勻，加水混合控制含水量為40% 50%，固體培養基佔容器容積的50% 80%，常規溼熱滅菌。
8.根據權利要求1所述的液固複合體系培養方法，其特徵是所述的D步驟液體菌絲接種於固體培養基系按39Γ5%的體積比加入，加入後培養基底部無積液。
9.權利要求1或8所述的液固複合體系培養方法獲得的培養物用於菸草黑脛病的人工接種物，或者用於製備帶菸草黑脛病病菌病土的添加物。
全文摘要
本發明公開了一種菸草黑脛病病菌液固複合體系培養方法及培養物應用，該法培養獲得的固體物可用於菸草黑脛病的人工接種物，也可用於製備帶菸草黑脛病病菌病土的添加物，以便測定菸草品種對黑脛病的抗感性、篩選防治菸草黑脛病的藥劑或生防菌、天然產物。其培養步驟包括(A)病菌分離，從發病田塊中採集病株，經過分離、純化、致病力測定，獲得病菌；(B)平板培養，將病菌接種於培養基平板上，24~30℃下培養5~7天；(C)液體培養，將平板菌絲接種於培養液中，24~30℃、150轉/分鐘振蕩培養5~7天；(D)固體培養，將液體菌絲接種於固體培養基，24~30℃培養8~12天。本發明具有接種量大、培養周期短、不易汙染等優點。
文檔編號C12R1/645GK102559516SQ20121002160
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月31日 優先權日2012年1月31日
發明者盧秀萍, 宋春滿, 方敦煌, 肖炳光 申請人:雲南省菸草農業科學研究院