一種新型海洋微生物低溫鹼性金屬蛋白酶及其產酶菌株的製作方法
2024-03-26 05:13:05
專利名稱：一種新型海洋微生物低溫鹼性金屬蛋白酶及其產酶菌株的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物酶領域，特別涉及一種新型海洋微生物低溫鹼性金屬蛋白酶及其高產海洋微生物低溫鹼性金屬蛋白酶的假單胞桿菌屬未知種菌株QD80。
背景技術：
海洋遼闊，微生物資源十分豐富，但由於海洋獨特的環境，包括高鹽、高壓、低營養、低溫等，造就了海洋微生物有別於陸生微生物的許多特異性如不易培養、形態多樣且在保藏和移種過程中很容易死亡等，不利於海洋微生物研究和開發的深入，因而迫切需要建立一些簡單、方便、易於操作並能在一定程度上更科學、更精確、更快速地找到並能分離得到有用微生物菌株，為海洋微生物資源的開發利用奠定基礎。目前，大分子rRNA已成為一個分子指標，廣泛地用於各種微生物的遺傳和分子差異的研究，加上大量已知微生物的DNA都已被測定並輸入國際基因資料庫，成為微生物鑑定分類非常有用的參照系統，從而可以通過對未知微生物DNA序列的測定和比較分析，達到以其進行快速、有效的鑑定分類的確定新的菌株的目的。
近年來隨著生物技術的發展，尋找具有全新性質的酶已成為國際酶製劑研究的熱點。海洋生物由於生長在海洋這一獨特的環境中，特別是生活在極端環境下的海洋微生物和微藻，能產生豐富的極端酶。與陸地微生物所產生的酶相比，海洋酶具有更為獨特的酶學性質，因此引起了國內外研究人員的極大關注。鹼性蛋白酶作為一種改進合成洗滌劑去垢性的必要成分已為世人共識。但在過去的10年中，世界洗滌傳統發生了革命性的改變。全球洗衣正向著低溫、節水型發展，傳統的洗滌劑用酶(主要是鹼性蛋白酶)在較低溫下所表現出的清潔能力已難以滿足消費者的需求，所以需要在低溫區域具有明顯相對活性優勢的酶。目前已知的洗滌劑用商品低溫鹼性蛋白酶包括Properase CT(GENENCOR國際公司，美國)、Savinase4.OT(NOVO公司，丹麥)等品牌，氧化穩定性洗滌劑鹼性蛋白酶為MaxapemCX(GENENCOR國際公司，美國)。其中Savinase 4.0T酶在pH 10.1條件下，最適反應溫度55℃、20℃時相對活性約為15％。Properase CT酶在pH 10條件下，最適反應溫度50-55℃、20℃時相對活性約為42％。MaxapemCX酶在最適條件下於20mM H2O2中可穩定60min。可見，在各自推薦的最適條件下，在低溫區蛋白酶的相對活性較低，所以這些酶的低溫活性區和對氧化劑的穩定性仍然沒有令人滿意。
發明內容
本發明的目的在於提供在中國東海海域的海泥中培養分離得到的一種高產新型海洋微生物低溫鹼性金屬蛋白酶的假單胞桿菌屬未知種菌株QD80。
本發明的另一目的提供由上述假單胞桿菌屬未知種菌株QD80高產海洋微生物低溫鹼性金屬蛋白酶。
本發明提供的新型假單胞桿菌屬未知種菌株QD80是從東海海域的海泥中培養分離得到高產新型海洋微生物低溫鹼性金屬蛋白酶(簡稱低溫鹼性金屬蛋白酶)的假單胞桿菌屬未知種菌株QD80。該假單胞桿菌屬未知種菌株QD80於2004年12月1日保藏於中國武漢典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC NOM204100。
本發明提供的假單胞桿菌屬未知種菌株QD809(簡稱菌株QD80)形態特徵形態特徵對菌株(指菌株QD80)進行革蘭氏染色，為革蘭氏陰性菌。顯微鏡形態觀察發現形態特徵呈粗的短杆狀；周生鞭毛、好氧；菌落乳白色、凸起、邊緣光滑；不透明、不產生色素。
菌株QD80 16SrDNA序列經測定，全長為1443bp。將該16SrDNA序列遞交GenBank進行Blast同源序列檢索，結果發現，在親緣關係相近的前500個序列中，前400個均為假單胞桿菌屬的菌株，QD80與他們都具有98％以上的同源性。
菌株QD80 16srRNA全序列GCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGGTGCTTGCACCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATACCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAACCTTGAGTTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTANCACGGTGTGATTCATG菌株QD80 16SrRNA基因序列在某些位點會以不同的機率發生突變，在種、屬等水平上表現出結構和功能的保守性，有「細菌化石」之稱，特別是其進化具有良好的時鐘性質，是生物進化史的計時器。應用16SrRNA作為分子指標，可以實現快速、微量、準確、簡便的對微生物進行分類鑑定。
本發明提供的海洋微生物低溫鹼性金屬蛋白酶，是由假單胞桿菌屬未知種菌株QD80高產的海洋微生物低溫鹼性金屬蛋白酶，特性為
(1)酶的基因ATGATCGAATCCGTCGAGCACTTCCTTGCCCGCCTCAAAAAACGCGACCCAGACCAGCCAGAATTCCACCAGGCGGTGGAAGAAGTCCTGCGCAGCCTGTGGCCTTTTCTCGAAGCCAATCCGCACTACCTGACTTCCGGGATTCTCGAACGTATTTGCGAACCTGAGCGGGCAATTGTGTTTCGCGTGTCATGGGTGGATGACGAAGGCAAAGTGCGGGTTAACCGCGGCTTCCGCATTCAGATGAACAGCGCCATTGGCCCTTACAAAGGCGGGTTGCGCTTCCACCCGTCGGTGAATTTGGGGGTGTTGAAGTTCTTGGCGTTTGAACAAACCTTCAAAAACTCCCTGACCTCGCTGCCCATGGGCGGCGGTAAGGGTGGCTCGGATTTCAACCCCAAGGGCAAGAGCGACGCGGAAGTCATGCGTTTCTGCCAGGCCTTCATGAGCGAGCTGTACCGTCATATCGGTTCGGACGTGGACGTGCCCGCTGGCGATATCGGCGTCGGCGCCCGTGAGATTGGCTTCCTCTTTGGCCAATACAAACGCCTGAGCAACCAGTTCACCTCCGTGTTGACCGGCAAAGGCATGAGCTACGGCGGCAGCCTGATTCGCCCGGAAGCCACCGGGTTTGGCTGCGTGTATTTTGCGCAGGAAATGCTCAAGCGCAGCGGCCAGCGGATTGATGGCAAGCCGGTTGCGATTTCCGGCTCGGGTAACGTGGCGCAGTATGCCGCGCGCAAAGTCATGGACCTGGGCGGCAAAGTCATTTCGCTCTCGGACTCCGAAGGCACCCTGTATTGCGAAGCCGGTCTGGACGACGCGCAGTGGGAAGCACTGATGGAGCTGAAAAACGTCAAGCGCGGACGTATCAGCGAACTGGCGGCGCAATTTGGTCTGGAGTTTCTGGCGGGCCAGCATCCGTGGCATCTGCCCTGTGACATTGCGCTGCCTTGCGCAACACAGAACGAACTGGACGCCGAAGCCGCTCGCACATTGCTGAGCAATGGCTGTGGGTGCGTGGCCGAAGGCGCCAACATGCCGACCACGCTGGAAGCGGTGGACCTGTTTATCGAGGCGGGCATTTTGTTCGCACCGGGCAAAGCCTCCAATGCGGGCGGTGTGGCCGTGAGCGGTCTGGAAATGTCGCAGAACGCCATGCGCTTGCTGTGGACGGCGGGTGAGGTGGACAGCAAGTTGCACAACATCATGCAATCGATCCACCACGCCTGA。
(2)酶(指低溫鹼性金屬蛋白酶)的分子量、等電點SDS-PAGE凝膠電泳測得該酶的表觀分子量為49000±1000Dal。HPLC凝膠過濾法測定酶分子量為49320Dal。薄層聚丙烯醯胺凝膠等電聚焦測定酶的等電點為pH8.5。
(3)酶的底物特異性該蛋白酶在35℃以下低溫條件下具有低活化能和高活性，所以在低溫下能有效的降解蛋白類物質，諸如蛋白汙漬(奶、血、草汁)或肽及酪蛋白、血紅蛋白、血纖維蛋白、彈性蛋白、肉蛋白、魚蛋白質等蛋白質。
(4)酶最適反應溫度、pH採用Folin-酚法測定酶活性，通過預先調整的pH緩衝體系，測定了不同pH對酶活性的影響，結果該酶的有效pH穩定範圍約在6-10(不同pH條件下，20℃保溫60min後的活性)；最適反應pH為9-10(20℃，反應時間10min)。
通過上述相同的測酶活性方法，測定了不同溫度對酶活性的影響，結果該酶的有效溫度穩定範圍約在20℃以下(不同溫度條件下pH9.5保溫60min後的活性)；最適反應溫度為30℃(pH9.5，反應時間10min).
(5)酶與常規試劑的配伍性金屬離子對低溫鹼性金屬蛋白酶的影響
配伍化學試劑對酶活性的影響
抑制物質對酶活性的影響
穩定劑(增稠劑)對酶活性的影響
(6)酶的穩定性該低溫鹼性金屬蛋白酶能夠滿足下列條件之一①Folin-酚試劑法測定該低溫鹼性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含過氧化氫(H2O2)緩衝溶液(50Mm硼砂鹽緩衝液、pH10，H2O220mM、Ca2+5mM)放置60min後剩餘酶活性不低於95％。
②按Folin-酚試劑法測定該低溫鹼性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含1％(W/V)過硼酸鈉(NaBO3)緩衝溶液(50mM硼砂鹽緩衝液、pH10，Ca2+5mM)放置60min後剩餘酶活性不低於90％。
③按Folin-酚試劑法測定該低溫鹼性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS)緩衝溶液(50mM硼砂鹽緩衝液、pH10，LAS500ppm、Ca2+5mM)放置60min後剩餘酶活性不低於65％。
④按Folin-酚試劑法測定該低溫鹼性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含亞硫酸鈉(Na2SO3)緩衝溶液(50mM硼砂鹽緩衝液、pH10，Na2SO38mM、Ca2+5mM)放置60min後剩餘酶活性不低於90％。
⑤按Folin-酚試劑法測定該低溫鹼性金屬蛋白酶的活性，10℃下在含5％(W/V)氯化鈉(NaCl)緩衝溶液(50mM硼砂鹽緩衝液、pH10，Ca2+5mM)放置12小時後剩餘酶活性不低於70％。
⑥按Folin-酚試劑法測定該低溫鹼性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含2％(V/V)乙醇緩衝溶液(50mM硼砂鹽緩衝液、pH10，Ca2+5mM)放置121小時後剩餘酶活性不低於70％。
(7)酶動力學研究①酶基本動力學參數以不同濃度酪蛋白為底物，在0.05M甘氨酸—氫氧化鈉pH9.5緩衝液中，反應體系溫度18℃，測定反應的初速度v0，對[S]作圖，結果如下 ②溫度對酶反應動力學參數的影響以酪蛋白為底物，在0.05M甘氨酸—氫氧化鈉pH9.5緩衝液中，按Folin法測不同溫度下反應穩態動力學參數V、Km的。
結果由Hanes作圖法求得動力學參數V、Km。
T(℃) 5.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0V(10-4g·l-1·s-1) 1.53 6.21 13.41 16.98 23.37 33.05 27.65Km(g·l-1) 0.19 2.11 5.37 6.29 10.65 14.51 10.48根據Arrhenius公式k＝A·e-Ea/RT上式可改寫為 logk＝logA-Ea/2.3RT將logK對1/T作圖由圖1的直線斜率求得Ea＝33242J/mol。結果如下反應 催化劑 活化能(J/mol)H+66944乙酸丁酯水解 OH-41840胰脂肪酶18828H+83680酪蛋白水解胰蛋白酶50208H+104600蔗糖水解酵母蔗糖酶 33472以Ke和KH表示酶和H+催化的反應速度常數，則logke=logA-Eae2.3RT]]>
logkH=logA-EaH2.3RT]]>logkekH=EaH-Eae2.3RT=83680-332422.38.28303=8.7]]>kekH=5.0108]]>反應的溫度係數Q10(Q10表示溫度升高10℃，反應速度提高的倍數)。
logQ10＝logkT2/kT2＝Ea(1/T1-1/T2)/(2.3R)＝[1/(T1··T2)]10×33242/(2.3×8.28)＝17455[1/(T1··T2)](3)pH對酶動力學參數的影響以酪蛋白為底物，在0.05M不同pH值緩衝液(磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉pH6-7；Tris-鹽酸pH8；甘氨酸pH9-11)中，按Folin法測不同pH下反應穩態動力學參數V、Km的，反應體系控制30℃。
由Hanes作圖法求得的不同pH下的動力學參數V、Km。
pH6.0 7.0 8.08.59.09.510.0 10.5 11Vap(10-4g·l-1·s-1) 3.45 5.83 10.57 12.07 13.16 23.10 23.32 25.85 15.17Kap(g·l-1) 1.31 2.50 3.80 4.48 5.06 10.46 10.53 11.64 7.12將測得的V取log對pH作圖，得到反應的pH曲線見圖2。
根據圖2所測數據，求得pKa＝9.3、pKb＝10.7，低溫鹼性金屬蛋白酶催化酪蛋白反應的最適pH0＝10.0。
(4)抑制劑對酶反應的作用以酪蛋白為底物，通過加入不同濃度的EDTA，在0.05M甘氨酸—氫氧化鈉pH9.5緩衝液中，測定反應的V、Km，反應體系溫度18℃。結果採用Kinetics軟體進行分析，EDTA對酶抑制情況數據分析
競爭性8.390.51 1.67非競爭性 0.800.05 0.06混合 0.100.06 0.09根據分析結果我們可以看到，EDTA對於該酶的抑制屬於可逆抑制中的競爭性抑制，在可逆抑制劑存在條件下，酶反應系統進行的反應可表示為
在這種抑制中，酶不能同時和底物、抑制劑結合，即不能形成EIS，或者說K′i或K′s＝∞，它的動力學方程是vi=V[S][S]+Km(1+[I]/Ki)]]>EDTA與酶結合後，Km增大了(1+[I]/Ki)倍，而酶和底物的親和力降低了(1+[I]/Ki)倍；[I]愈高，Ki愈小，抑制劑濃度愈高，酶和抑制劑間的結合力愈強，Km增大，酶和底物親和力進一步降低，酶反應速度因之相應減緩。抑制程度取決於[I]和[S]、Ks和Ki的相對大小，以(1/vi-1/v)表示抑制程度時，有1vi-1vi=1VKs[S][I]Ki]]>表明底物、抑制劑在濃度以及它們和酶的親和力上存在著競爭關係，底物具有保護作用。EDTA和該海洋低溫鹼性蛋白酶的活性部位結合，阻止了酶與底物的進一步結合，從而抑制了酶的活性，由於EDTA是對金屬有強螯合作用的特徵試劑，可能有金屬離子存在於該酶活性中心，該蛋白酶為低溫鹼性金屬蛋白酶。該蛋白酶可廣泛應用於洗滌劑、飼料、毛織品處理等領域中。
圖1為logK～1/T作2為lgV對pH作圖(30℃)具體實施方式
本發明用下列實施例來說明本發明，但本發明並保護範圍不限於下列實施例實施例1產酶菌株的培養及海洋微生物低溫鹼性金屬蛋白酶的生產20℃下將本發明假單胞桿菌屬未知種菌株QD80在500ml含有3.5％大豆粉、2％麩皮、0.4％ NaH2PO4、0.03％ K2HPO4、0.2％ Ca(Cl)2的培養基中震蕩培養48小時(用1M氫氧化鈉將培養基的pH調節到7.5-7.7)，然後可在培養基中產生並分泌所述的低溫鹼性金屬蛋白酶。4℃下以1000G離心此培養物，獲得含有本發明酶的上清液。上清液中的酶的活性大約為700u/ml(用上述Folin-酚試劑法測定)。
實施例2海洋微生物低溫鹼性金屬蛋白酶的純化將在實施例1.中獲得的培養物的上清液再用30-65％飽和度的(NH4)2SO4分級沉澱，離心收取沉澱。將沉澱溶解在蒸餾水中，並透析24小時。將透析液過二乙氨乙基一瓊脂糖(DEAE-Sepharose) FF陰離子交換層析柱，用0-1M NaCl·磷酸緩衝液(20mM，pH7.0)梯度洗脫，收集活性組分再經CM-Sepharose FF凝膠層析柱，用0-1M NaCl·磷酸緩衝液(10mM，pH5.0)梯度洗脫，收集活性組分。然後進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳SDS-PAGE鑑定，經考馬斯亮蘭染色為單一條帶，雷射灰度掃描結果，樣品純度大於95％。
權利要求
1.一種假單胞桿菌屬未知種菌株QD80為從東海海域的海泥中培養分離得到，該未知種菌株QD80高產海洋微生物低溫鹼性金屬蛋白酶，該菌株保藏在中國武漢典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM204100。
2.根據權利要求1的假單胞桿菌屬未知種菌株QD80，其特徵在於該菌株形態特徵與生物生化特徵對菌株進行革蘭氏染色，為革蘭氏陰性菌；顯微鏡形態觀察發現形態特徵呈粗的短杆狀；周生鞭毛、好氧；菌落乳白色、凸起、邊緣光滑；不透明、不產生色素。
3.根據權利要求1的假單胞桿菌屬未知種菌株QD80，其特徵在於該菌株QD80 16srRNA全序列如下，全長為1443bpGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGGTGCTTGCACCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATACCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAACCTTGAGTTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTANCACGGTGTGATTCATG16SrRNA基因序列在某些位點會以不同的機率發生突變，在種、屬等水平上表現出結構和功能的保守性。
4.一種海洋微生物低溫鹼性金屬蛋白酶，其特徵在於由假單胞桿菌屬未知種菌株QD80產生的海洋微生物低溫鹼性金屬蛋白酶。
5.一種海洋微生物低溫鹼性金屬蛋白酶，其特性為(1)酶的基因ATGATCGAATCCGTCGAGCACTTCCTTGCCCGCCTCAAAAAACGCGACCCAGACCAGCCAGAATTCCACCAGGCGGTGGAAGAAGTCCTGCGCAGCCTGTGGCCTTTTCTCGAAGCCAATCCGCACTACCTGACTTCCGGGATTCTCGAACGTATTTGCGAACCTGAGCGGGCAATTGTGTTTCGCGTGTCATGGGTGGATGACGAAGGCAAAGTGCGGGTTAACCGCGGCTTCCGCATTCAGATGAACAGCGCCATTGGCCCTTACAAAGGCGGGTTGCGCTTCCACCCGTCGGTGAATTTGGGGGTGTTGAAGTTCTTGGCGTTTGAACAAACCTTCAAAAACTCCCTGACCTCGCTGCCCATGGGCGGCGGTAAGGGTGGCTCGGATTTCAACCCCAAGGGCAAGAGCGACGCGGAAGTCATGCGTTTCTGCCAGGCCTTCATGAGCGAGCTGTACCGTCATATCGGTTCGGACGTGGACGTGCCCGCTGGCGATATCGGCGTCGGCGCCCGTGAGATTGGCTTCCTCTTTGGCCAATACAAACGCCTGAGCAACCAGTTCACCTCCGTGTTGACCGGCAAAGGCATGAGCTACGGCGGCAGCCTGATTCGCCCGGAAGCCACCGGGTTTGGCTGCGTGTATTTTGCGCAGGAAATGCTCAAGCGCAGCGGCCAGCGGATTGATGGCAAGCCGGTTGCGATTTCCGGCTCGGGTAACGTGGCGCAGTATGCCGCGCGCAAAGTCATGGACCTGGGCGGCAAAGTCATTTCGCTCTCGGACTCCGAAGGCACCCTGTATTGCGAAGCCGGTCTGGACGACGCGCAGTGGGAAGCACTGATGGAGCTGAAAAACGTCAAGCGCGGACGTATCAGCGAACTGGCGGCGCAATTTGGTCTGGAGTTTCTGGCGGGCCAGCATCCGTGGCATCTGCCCTGTGACATTGCGCTGCCTTGCGCAACACAGAACGAACTGGACGCCGAAGCCGCTCGCACATTGCTGAGCAATGGCTGTGGGTGCGTGGCCGAAGGCGCCAACATGCCGACCACGCTGGAAGCGGTGGACCTGTTTATCGAGGCGGGCATTTTGTTCGCACCGGGCAAAGCCTCCAATGCGGGCGGTGTGGCCGTGAGCGGTCTGGAAATGTCGCAGAACGCCATGCGCTTGCTGTGGACGGCGGGTGAGGTGGACAGCAAGTTGCACAACATCATGCAATCGATCCACCACGCCTGA；(2)酶的分子量、等電點酶的表觀分子量為49000±1000Dal，酶分子量為49320 Dal，酶的等電點為pH8.5；(3)酶的底物特異性該蛋白酶在35℃以下低溫條件下具有低活化能和高活性，在低溫下能有效的降解蛋白類物質；(4)酶最適反應溫度、pH最適反應pH為9-10，酶的有效pH穩定範圍在6-10，最適反應溫度為30℃；(5)酶與常規試劑的配伍性金屬離子對低溫鹼性金屬蛋白酶的影響
配伍化學試劑對酶活性的影響.
抑制物質對酶活性的影響
穩定劑對酶活性的影響
(6)酶的穩定性該低溫鹼性金屬蛋白酶能夠滿足下列條件之一①按Folin-酚試劑法測定該低溫金屬鹼性蛋白酶的活性，25℃下在含過氧化氫緩衝溶液(50Mm硼砂鹽緩衝液、pH10，H2O220mM、Ca2+5mM)放置60min後剩餘酶活性不低於95％；②按Folin-酚試劑法測定該低溫鹼性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含1％(W/V)過硼酸鈉緩衝溶液(50mM硼砂鹽緩衝液、pH10，Ca2+5mM)放置60min後剩餘酶活性不低於90％；③按Folin-酚試劑法測定該低溫鹼性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含直鏈烷基苯磺酸鈉緩衝溶液(50mM硼砂鹽緩衝液、pH10，直鏈烷基苯磺酸鈉500ppm、Ca2+5mM)放置60min後剩餘酶活性不低於65％；④按Folin-酚試劑法測定該低溫鹼性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含亞硫酸鈉緩衝溶液(50mM硼砂鹽緩衝液、pH10，Na2SO38mM、Ca2+5mM)放置60min後剩餘酶活性不低於90％；⑤按Folin-酚試劑法測定該低溫鹼性金屬蛋白酶的活性，10℃下在含5％(W/V)氯化鈉緩衝溶液(50mM硼砂鹽緩衝液、pH10，Ca2+5mM)放置12小時後剩餘酶活性不低於70％；⑥按Folin-酚試劑法測定該低溫鹼性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含2％(V/V)乙醇緩衝溶液(50mM硼砂鹽緩衝液、pH10，Ca2+5mM)放置121小時後剩餘酶活性不低於70％。
全文摘要
本發明涉及一種從東海海域的海泥中培養分離得到的假單胞桿菌屬未知種菌株QD80，該菌株保藏在CCTCC，保藏號為CCTCC NOM204100，以及由該菌株高產的新型海洋微生物低溫鹼性金屬蛋白酶，可廣泛應用於各種洗滌劑、飼料、毛織品處理等領域。
文檔編號C12N1/20GK1632106SQ20051000205
公開日2005年6月29日 申請日期2005年1月12日 優先權日2005年1月12日
發明者孫謐, 郝建華, 王躍軍, 朱重浩 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所