頭孢菌素c醯基轉移酶的製作方法

2024-03-26 05:08:05 2

專利名稱：頭孢菌素c醯基轉移酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有頭孢菌素C醯基轉移酶活性的酶、製備這些酶的重組DNA方法、編碼所述酶的核苷酸序列、包含所述核苷酸序列的表達載體、用所述表達載體轉化的細胞和利用所述酶製備7-氨基頭孢烷酸的方法。
背景技術：
頭孢菌素C醯基轉移酶是一種將頭孢菌素C轉換為7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)的酶，7-ACA是製備大量半合成頭孢菌素的中間體。
儘管通過化學合成法也能夠從頭孢菌素C獲得7-ACA，但是酶學方法由於其具有更加環保和低成本的特性仍然是優選的。
將頭孢菌素C轉化成7-ACA的常規酶學方法需要兩種不同的酶，D-胺基酸氧化酶(DAAO)和戊二醯醯基轉移酶。DAAO將頭孢菌素C轉化成α-酮-己二醯-7ACA並伴隨有過氧化氫產生。然後過氧化氫將α-酮-己二醯-7ACA氧化成戊二醯-7-ACA(通過氧化脫氨基作用產生並/或被加入到反應介質中)，然後戊二醯醯基轉移酶將戊二醯-7-ACA水解成7-ACA。常規方法需要兩個獨立的酶反應器，並且存在或加入過氧化氫能夠失活固定化酶，這會損壞機械設備並增加成本。
已經試圖研發能夠將頭孢菌素C直接水解成7-ACA的酶。三種已知的從假單胞菌(Pseudomonas)菌株分離得到的酶，即SE83、N176和V22，具有這種能力(Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.72(4)，232-243，1991)，但是它們對於戊二醯-7-ACA的醯基轉移酶活性高於對於頭孢菌素C的醯基轉移酶活性。
已經公開了用於它們的製備的突變體和重組DNA方法(US 5320948、EP 475652、EP 558241、US 5804429)以改善這些酶的特性，尤其是改善其特異性、穩定性和活性。
然而，從動力學、穩定性、活性和特異性，以及能被大量表達的觀點看，仍然需要具有改善了的頭孢菌素C醯基轉移酶活性的酶。

發明內容
基於已知的來自假單胞菌的N176醯基轉移酶的序列，已經設計了編碼具有頭孢菌素醯基轉移酶活性的酶的基因(Aramori I.等(1991)，從假單胞菌菌株克隆新的戊二醯7-ACA和頭孢菌素C醯基轉移酶基因並對其核苷酸測序，Journal of Fermentation and Bioengineering；72(4)，232-243)。據報導這種醯基轉移酶對於戊二醯-7ACA和對於頭孢菌素C(儘管處於較低程度)都具有活性。
當設計起始基因(命名為野生型HisVAC)時，導入多種變化-在270位點導入苯丙氨酸；該突變(由文獻得知)增加對於頭孢菌素C的活性(Ishii Y.等(1995)，高水平產生、化學修飾及定點誘變來自假單胞菌菌株的頭孢菌素C醯基轉移酶N176，Eur.J.Biochem；230，773-778)。
-在C-末端導入額外的序列(由胺基酸LEHHHHHH組成)，但並不幹擾活性區域(β亞基第一個胺基酸參與催化作用)。利用pET24質粒作為克隆和表達載體，將所述序列導入以便使隨後的層析純化更容易。該質粒具有卡那黴素抗性而且能夠在蛋白質的C-末端插入「His-標籤序列」並在N-末端插入「T7-標籤序列」。藉助於pET24的多接頭在基因末端加入含有EcoRI、XhoI和NdeI限制性酶切位點的區域，以便易於克隆入載體。
-通過替換某些鹼基去除基因中的某些限制性位點(BamHI和NheI)，以至於不在相應的胺基酸序列即利用大腸桿菌(E.coli)的密碼子選擇中導入所不希望的改變。
-優化大腸桿菌密碼子選擇的核苷酸序列，利用最易翻譯的密碼子(具體而言，明顯改變了編碼蛋白質N-末端部分的序列)，主要的突變為1.替換在大腸桿菌中幾乎不使用的編碼甘氨酸的GGA密碼子；2.替換在大腸桿菌中幾乎不使用的編碼精氨酸的AGG和CGA密碼子；
3.替換在大腸桿菌中幾乎不使用的編碼異亮氨酸的ATA密碼子；4.替換在大腸桿菌中幾乎不使用的編碼脯氨酸的CCC密碼子；5.按照其在大腸桿菌中的發生頻率平衡編碼穀氨酸的GAG和GAA密碼子的使用；6.按照其在大腸桿菌中的發生頻率平衡編碼苯丙氨酸的TTT和TTC密碼子的使用；7.按照其在大腸桿菌中的發生頻率平衡編碼穀氨醯胺的CAG和CAA密碼子的使用；8.按照其在大腸桿菌中的發生頻率平衡編碼組氨酸的CAT和CAC密碼子的使用；所得到的cDNA與天然N176基因具有63.7％的序列一致性。
然後通過化學合成法獲得編碼HisVAC的cDNA(Itakura K，Rossi JJ，Wallace RB，合成和使用合成的寡核苷酸，Annu Rev Biochem.1984；53323-56)。
目前已經發現一些特殊的突變能夠顯著地改善「野生型」酶(下文中是指HisVAC)的特性。
具體而言，本發明提供了具有

圖1中所報導的胺基酸序列(SEQ.IDNO1)的具有頭孢菌素C醯基轉移酶活性的酶，其中已經插入了一個或多個下面的突變-用Tyr、Phe、Glu或Val替代丙氨酸215；-用Asn、Ser、Thr、Phe替代組氨酸296；-用任意其它胺基酸替代天冬氨酸416和組氨酸417；-用任意其它胺基酸替代261、271、294、297、307、308和309位上的胺基酸。
特別優選的是這些酶，其中-丙氨酸215由Tyr替代；-丙氨酸215由Phe替代；-丙氨酸215由Glu替代；
-丙氨酸215由Val替代；-組氨酸296由Asn替代；-組氨酸296由Ser替代；-組氨酸296由Thr替代；-組氨酸296由Phe替代；-丙氨酸215由Tyr替代並且組氨酸296由Ser替代。
不必替換「野生型」酶的精氨酸263。
本發明的酶能夠通過這樣一種方法製備，該方法包括-將通過對圖2中報導的核苷酸序列(SEQ ID NO2)定點誘變、隨機或徹底誘變得到的DNA序列插入用於細菌或真核細胞的表達載體；-用所述載體轉化細菌或真核細胞；-培養轉化的細胞，提取並回收表達產物。
然後通過常規方法將本發明的突變序列插入質粒表達載體中，該質粒表達載體能夠用於轉化能產生酶的大腸桿菌感受態細胞。
針對所設想的工業使用，這些酶能夠連接到固相載體上，如在用於將頭孢菌素C酶轉化為7-氨基頭孢烷酸的液體介質中的不溶性合成多聚物。用於固定化醯基轉移酶的適當樹脂為具有丙烯酸類結構、具有環氧官能團的樹脂，如Sepabeads EC-EP(Resindion srl-Mitsubishi ChemicalCorporation)和Eupergit C(Rohm-Degussa)，或者具有伯氨基的樹脂，如Sepabeads EC-has和EC-EA(Resindion srl-Mitsubishi ChemicalCorporation)。無論如何，將酶與樹脂相接觸並通過官能團(環氧化物)的高反應性或具雙功能劑如戊二醛的樹脂的活化作用固定化酶，從而將酶結合到基質上。其它適於醯基轉移酶固定化的樹脂是聚苯乙烯樹脂、大網絡樹脂和具有鹼性官能團的樹脂，如Sepabeads EC-Q1A將酶吸附於樹脂上並通過與雙功能劑(戊二醛)交聯使酶固定。
附圖簡述圖1示出了已插入突變並具有頭孢菌素C醯基轉移酶活性的酶的胺基酸序列(SEQ.ID NO1)。
圖2示出了用於誘變的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)。
圖3示出了pET24Δ-AcyHis表達質粒中用作DNA模板的區域及設計的兩條寡核苷酸引物RND-ACY-EXT和RND-ACY-UP。
實施例實施例1微生物培養和發酵持續培養從瓊脂平板挑取的含有HisVAC表達質粒的大腸桿菌菌株單個克隆。所有菌株在不同的瓊脂培養基中均顯示良好的生長速率，特別是LB和LB Miller培養基(含有或不含有1％葡萄糖)，pH為7且成分如下LB＝胰蛋白腖(胰酪蛋白消化)10g/l；酵母提取物5g/l；NaCl5g/l；LB Miller＝胰蛋白腖(胰酪蛋白消化)10g/l；酵母提取物5g/l；NaCl10g/l。
將瓊脂平板在37℃孵育1天，然後將細胞刮去。在4℃保存平板數周克隆仍保持活性。
將細胞懸浮於無菌溶液中並將懸浮液(生長至OD600＝4)轉移至裝有含34μg/ml氯黴素和30μg/ml卡那黴素的LB Miller培養基的燒瓶(或發酵罐，當在燒瓶中完成生長期之後)中。培養物在37℃，200轉/分鐘生長3小時至OD600＝0.8(指數生長期)。生產期之後，加入0.6mM IPTG進行誘導，然後將細胞在21或25℃生長3-5小時。
野生型HisVAC醯基轉移酶的提取和純化HisVAC是細胞內的醯基轉移酶；發酵之後離心培養物肉湯並通過化學(加入去汙劑或氫氧化鈉幾秒鐘)或物理(擠壓或玻璃珠研磨)處理完成細胞膜裂解。優選的方法是將細胞糊重懸於緩衝液中，如磷酸鹽或焦磷酸鹽緩衝液(pH 7.5-8)，然後用法式壓濾器o Rannie勻漿器壓力為600-800巴進行裂解。離心或微孔過濾(孔徑0.45μm)使細胞裂解液澄清，任選地存在聚電解質。通過層析法純化含有粗酶的澄清溶液。優選的方法是通過含有具結合金屬離子(例如鋅或鎳)的亞氨基二乙酸基的螯合樹脂的柱子，該柱子能夠選擇性吸附具組氨酸標籤的蛋白質。適當的層析樹脂為HiTrapChelating(Amersham Biosciences)和Sepabeads FP-IDA(Resindion srl-Mitsubishi Chemical Corporation)。通過漸增咪唑濃度或pH變化的洗脫能夠得到高純度的HisVAC醯基轉移酶。
純化後的HisVAC在pH為5-9的範圍內孵育120分鐘後仍然是穩定的。酶活性以反應溶液pH，範圍為5-10，的函數形式增加，在40℃反應30分鐘後達到最高值。
通過培養用pET24Δ-HisVAC質粒轉化的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS產生HisVAC醯基轉移酶1)微生物製備用NdeI和BamHI限制性酶消化編碼HisVAC的cDNA(野生型和突變體，2322bp)。將cDNA連接到相應的經NdeI-BamHI-消化的pET24Δ(BglII-Tth111I)-HisVAC表達質粒的3.6kb片段上。pET24Δ(BglII-Tth111I)-HisVAC表達質粒是通過用BglII和Tth111I限制性酶消化方法斷裂7.6kb的pET24-HisVAC質粒(通過將XhoI/NdeI限制性酶處理的完整VAC cDNA(2.3kb)克隆入用XhoI/NdeI消化的pET24質粒的5.3kb片段中獲得)、回收4984bp片段、用Klenow酶鈍化粘性末端，並進行連接而獲得的。將所得到的pETΔ-HisVAC用於轉化BL21(DE3)pLysS大腸桿菌細胞。將轉化的細胞轉移至含有34μg/ml氯黴素和30μg/ml卡那黴素的LB-瓊脂平板上，並在37℃孵育24小時。從平板上選擇單克隆，並培養於750ml含有34μg/ml氯黴素和30μg/ml卡那黴素的液體LB Miller培養基中。通過對回收的質粒DNA進行限制性酶切分析檢測細胞中pET24Δ-HisVAC質粒的存在。
2)發酵作用a)生產期將用pET24Δ-HisVAC質粒轉化的BL21(DE3)pLysS大腸桿菌細胞在含有30μg/ml氯黴素和30μg/ml卡那黴素的固體LB-瓊脂培養基中37℃發酵24小時。將細胞重懸於100ml無菌溶液中並取30μg/ml 15ml懸液(生長至OD600＝4)轉移至含750ml含有30μg/ml氯黴素和卡那黴素的LB Miller培養基的2升燒瓶(或在燒瓶中完成生長期之後轉移至發酵罐)中。培養物在37℃，200轉/分鐘生長3小時至OD600＝0.8(指數生長期)。
b)誘導期生產期之後，加入0.6mM IPTG進行誘導。誘導後細胞生長於21或25℃；3-5小時後達到最高酶產量。
實施例2野生型HisVAC乙醯轉移酶的提取和純化將從4.5升實施例1所述的肉湯中得到的細胞糊(13g，相應於90UHisVAC醯基轉移酶)重懸於39ml 50mM的磷酸鹽緩衝液，pH 7.5並含有0.7μg/ml胃蛋白酶抑制劑。將懸浮液冷卻至4℃並使其通過法式壓濾器。39000g離心60分鐘使裂解液澄清。得到50ml具有1.8 U/ml HisVAC醯基轉移酶活性，相當於90總單位，的澄清溶液。將粗提樣本裝到5mlHiTrap螯合柱上(Amersham Biosciences)，該柱子預先裝載了鎳離子並用含有1M NaCl和20mM咪唑緩衝液的50mM焦磷酸鈉緩衝液，pH 7.2進行平衡。用6ml含500mM咪唑、10％甘油，pH7.2的50mM焦磷酸鈉緩衝液洗脫HisVAC醯基轉移酶。純化後的酶活性為12U/ml(72總單位)，並且比活性為6.5U/mg蛋白質，以戊二醯-7ACA為底物。
實施例3HisVAC醯基轉移酶固定化於EC-EP Sepabeads珠子將1g EC-EP Sepabead珠子加入到10ml 20℃的含100單位醯基轉移酶的1M磷酸鉀緩衝液中，pH 8.0。20℃時將混合物溫和攪拌12小時，然後20℃使其另外靜置12小時。通過過濾和用25mM磷酸鉀緩衝液，pH 8.0，洗滌回收樹脂。所得到的生物催化劑具有以戊二醯-7ACA為底物時35-40U/g的固定化活性。
實施例4在溶液中用HisVAC醯基轉移酶轉化頭孢菌素C將0.053g頭孢菌素C、二水合鈉鹽(純度86％)溶解於20ml 100mM的磷酸鉀緩衝液中，pH 8.0(2.27g/l，假定純度100％)，並加入到6.4ml純化的醯基轉移酶中(167.2總單位)。將混合物在20℃攪拌孵育，加入稀釋的氫氧化鈉維持pH為8。150分鐘後獲得轉化為7-ACA的最大轉化(92.8％轉化，HPLC)。
實施例5突變體製備1.定點誘變使用「QuikChange定點誘變試劑盒」(STRATAGENE)導入核苷酸突變，該試劑盒能夠在雙鏈DNA的特定位點導入突變。並且使用含有目的基因的雙鏈pET24Δ-HisVAC和具有預期突變的兩條引物。用PfuTurboDNA聚合酶延伸與各自相應的載體鏈互補的引物，該酶能夠高度保真地複製質粒兩條鏈。PCR之後，用Dpn I(一種用於消化親本DNA的對甲基化DNA特異的核酸內切酶)處理混合物並將產物用於轉化XL1-Blue超感受態細胞，從轉化的XL1-Blue細胞中提取DNA，轉化大腸桿菌表達株BL21(DE3)pLysS。
利用大約50ng模板DNA(pET24Δ-HisVAC)；每條引物各125ng；2.5U PfuTurboDNA聚合酶，進行以下PCR程序 如實施例2中所述純化定點誘變獲得的突變蛋白質。
2.飽和點誘變為了得到隨機重組HisVAC突變體文庫，使用了飽和(或徹底的)點誘變，因為這種誘變允許在蛋白質的相同位置插入20種胺基酸中的任意一種。該技術在於使用簡併寡核苷酸在特定靶密碼子處導入不同的突變。利用等摩爾核苷混合物(dA、dC、dG、dT)使相應的位置被「飽和」合成寡核苷酸。所得到的突變體基因群體由具有隨機密碼子的同一基因組成。在不同的克隆中，該密碼子能夠編碼任意胺基酸，從而獲得在一個特定靶殘基處具有所有可能的胺基酸替換的突變體文庫。將pET24Δ-AcyHis表達質粒用作DNA模板，並將編碼特定殘基(如215和296位上的胺基酸)的密碼子的全部三個鹼基均簡併的寡核苷酸用作引物。
利用同樣用於專一位點定點誘變的「QuikChange定點誘變試劑盒」(STRATAGENE)導入突變。將突變的DNA用於轉化表達菌株BL21(DE3)pLysS。然後，如實施例2所述將突變的克隆進行篩選和純化。
3.隨機誘變通過易錯PCR擴增靶基因製備重組體HisVAC酶突變體的文庫。在不同的誘變條件下進行擴增a.10％DMSO、1mM 2-巰基乙醇和高循環數；b.[Mn++]＝0.5mM，[Mg++]＝0.25mM，[dGTP]和[dATP]＝0.2mM，[dCTP]和[dTTP]＝1mM。
將pET24Δ-AcyHis表達質粒用作DNA模板並將兩條設計的寡核苷酸RND-ACY-EXT(5』-CGAGATCTCGATCCCGCGAAA-3』)和RND-ACY-UP(5』-AACCAACCGTTTCATGATGCTTCGGC-3』)用作引物。這些引物退火至NdeI和BamHI限制性酶酶切位點兩側的載體區，如圖3所示。
為了從DNA模板(7.6kb)中分離所擴增的條帶(～1.6kb)，將PCR產物合併並在瓊脂糖凝膠上分離。然後凝膠純化擴增的DNA並用NdeI和BamHI限制性酶進行初步消化。將消化混合物加樣至瓊脂糖凝膠上並且回收和凝膠純化靶片段(～1.4kb)。用NdeI和BamHI限制性酶對所提取的DNA進行O.N.消化；得到3.6kb和1.4kb的兩個片段。回收並凝膠純化靶片段(3.6kb)。將在誘變條件下擴增、酶消化並純化的編碼AcyHis酶的DNA連接到表達載體pET24Δ-(BglII-Tth111)-AcyHis上。連接混合物用於轉化大腸桿菌菌株JM109。
為了將「突變體文庫」轉移進大腸桿菌BL21(DE3)pLysS(表達株)，用含有全部所獲得的突變體的質粒DNA混合物轉化細胞。為了該目的，將用連接產物轉化JM109細胞所獲得的全部菌落重懸於選擇培養基中，並提取總質粒DNA。該DNA用於轉化BL21(DE3)pLysS表達株。
實施例6通過誘變得到的突變體的特性通過測定37℃時頭孢菌素C或戊二醯7-ACA在0.1M磷酸鹽緩衝溶液，pH 8.0，中的水解而測定突變體和HisVAC醯基轉移酶的動力學參數(然後轉換至25℃的單位)。使用改良的Bulasingham方法(Biochem.Biophys.Acta 276，250，1972)，分光光度法測定7-ACA的量，使用標準曲線，在415nm測定與對二甲基氨基苯甲醛反應所產生的黃色強度(希夫鹼)。
1醯基轉移酶單位是在測定條件下產生1微摩爾7-ACA/分鐘所需的酶(溶液中或固定化)的量。
根據下面表格中報告的數據，與野生型HisVAC醯基轉移酶相比，本發明的突變體對頭孢菌素C的動力學特性優於對戊二醯-7-ACA的動力學特性。
Gl-7-ACACef C野生型 A215E A215F A215L A215V A215Y 野生型 A215E A215F A215L A215V A215YVmax24.22 3.3 6.2 12.516 0.23 0.160.210.750.78 1.8(U/mg)Km(mM) 1.6 1 0.85 1.7 1.2 1.7 8.2 3.2 7.7 9.5 8.3 6.9Vmax/Km 15.52.1 3.9 3.7 10.19.4 0.03 0.050.030.080.09 0.26抑制 12.5mM 25mM 50mM 12.5mM 12.5mM 12.5mM 50mM 無抑制 無抑制 12.5mM 50mM 25mM而且，突變體A215Y在溫度高於25℃時更穩定。
Gl-7-ACA Cef C野生型 H296N H296S H296T H296F 野生型 H296N H296S H296T H296FVmax(U/mg) 24.2 4.3 2.00.67 1.7 0.23 0.27 0,63 0.20.05Km(mM) 1.62.8 0,72.01.9 8.25.27.74.84.1Vmax/Km15.5 1.5 2.80.33 0.9 0.03 0.05 0.08 0.04 0.0112.5 50 60抑制 25mM50mM 50mM50mM 50mM 25mM 60mMmMmMmMGl-7-ACACef C野生型 H417Y D416Y D416Y-H417Y 野生型 H417Y D416Y D41Y-H417YVmax(U/mg) 24.214.84.9 1.2 0.230.050.664.2Km(mM)1.6 4.3 1.759 8.2 12.37.2 13.1Vmax/Km 15.53.4 2.8 0.130.030.004 0.090.3抑制 12.5mM 無抑制 25mM12.5mM 50mM50mM無抑制 50mM
Gl-7-ACA Cef C野生型A215Y-H296S野生型A215Y-H296SVmax(U/mg) 24.2 2.20.23 0.66Km(mM) 1.6 4 8.2 10Vmax/Km 15.5 0.55 0.03 0.07抑制後 12.5mM25mM 50mM 40mM下表中報告了產物抑制作用的數據。數據表明相對於野生型HisVAC，突變體醯基轉移酶的產物抑制作用顯著變化。
Ki(mM)Gl-7-ACA Cef C7-ACA戊二酸 α-氨基己二酸野生型0.1mM13.6mM 67.7mMA215Y 11.3mM 6.1mM無抑制作用A215F 4.7mM2.1mM85.2mM
序列表110安蒂比奧蒂科斯有限公司120頭孢菌素C醯基轉移酶1307186meur1602170PatentIn版本3.12101211782212PRT213假單胞菌種(Pseudomonas sp.)4001Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala Leu1 5 10 15Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser Val20 25 30Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly35 40 45Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln Asp Arg50 55 60Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala65 70 75 80Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg85 90 95Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Val
100 105 110Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe115 120 125Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala130 135 140Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg145 150 155 160Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu165 170 175Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp180 185 190Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Asp195 200 205Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu210 215 220Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser225 230 235 240Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile245 250 255Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Phe Tyr Ala260 265 270Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val
275 280 285Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala290 295 300Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu305 310 315 320Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe Glu325 330 335Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp340 345 350Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly355 360 365Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala370 375 380Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser385 390 395 400Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile Asp405 410 415His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val420 425 430Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val435 440445Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu
450 455 460Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr Ala465 470 475 480Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp485 490 495Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu Val Ala500 505 510Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr515 520 525Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu Gly530 535 540Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val Ala545 550 555 560Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr Asn565 570 575Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly Leu580 585 590Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val Ser595 600 605Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp Asp610 615 620Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser Glu
625 630 635 640Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp Gly Glu645 650 655Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro Ala660 665 670Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly675 680 685Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln Ala690 695 700Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp705 710 715 720Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser725 730 735Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val740 745 750Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser755 760 765Gln Glu Leu Val Pro Ala Leu Glu His His His His His His770 775 78021022112349212DNA213假單胞菌種
4002atgactatgg cagctaatac ggatcgtgcg gttttacaag cggcgctgcc tccgttgtct60ggttccctgc cgattccggg cctctcggca agcgtgcggg tgcggcgtga tgcttggggt120atccctcata tcaaagcaag tggtgaagcg gatgcatacc gcgctcttgg cttcgttcat180tctcaagatc ggttgttcca aatggaactt acccggcgca aagcgctggg tcgtgctgcg240gagtggcttg gggcggaggc cgctgaggcg gacatcctgg tccgccgtct gggtatggaa300aaagtctgtc gccgcgattt cgaggctctc ggcgttgaag cgaaagatat gttacgggcc360tacgttgccg gggtgaatgc cttcctggca tcgggggcac ctctgcctgt ggaatacggc420ctgcttggtg cggaaccgga accatgggaa ccatggcaca gtatcgcggt tatgcgccgc480ttgggcctgc tgatggggtc tgtgtggttt aaattatggc ggatgcttgc actgccggtc540gtgggggctg ctaacgcgtt aaaactgcgc tatgacgacg gcgggcggga tctcttgtgc600attccgccgg gcgccgaggc tgatcggctt gaggcggacc tcgcgacgct ccgcccagcg660gtcgatgcgc tgctgaaagc catgggtggg gatgctagcg acgccgctgg cgggggcagc720aataactggg ccgtcgctcc gggccgcacc gcaaccggtc gtccgatcct ggccggtgat780ccgcatcggg tttttgagat tccgggtttt tatgctcaac atcacttagc atgtgaccgt840tttgatatga ttggtctgac cgtgcctggc gtcccgggct tcccacattt tgcccataac900ggtaaggtcg catattgtgt gacccacgca tttatggata tccacgatct ttatctggaa960cagttcgcag gcgaaggtcg gacggcgcgc ttcggtaacg acttcgaacc ggtggcctgg 1020tcccgcgacc gtattgcggt tcgtggcggg gccgaccgtg aatttgatat tgtcgagacg 1080cgtcacgggc cggttatcgc aggtgaccca cgggatggtg cagcgctgac gctgcggagc 1140gttcagtttg cggaaacgga cctctcgttt gactgcctca ctcgcatgcc gggggccagc 1200accgttgcgc agctgtatga tgctacccgt ggctgggggt tgattgatca caacctcgtc 1260gccggggatg tcgcaggctc gatcgggcac cttgtgcgtg cacgggtgcc gagtcgtcca 1320
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權利要求
1.具有胺基酸序列(SEQ.ID NO.1)的具有頭孢菌素C醯基轉移酶活性的酶，其中已導入了一個或多個下列突變-用Tyr、Phe、Glu或Val替代丙氨酸215；-用Asn、Ser、Thr、Phe替代組氨酸296；-用任意其它胺基酸替代天冬氨酸416和組氨酸417；-用任意其它胺基酸替代胺基酸261、271、294、297、307、308和309。
2.如權利要求1所述的酶，其中丙氨酸215由Tyr替代。
3.如權利要求1所述的酶，其中丙氨酸215由Phe替代。
4.如權利要求1所述的酶，其中丙氨酸215由Glu替代。
5.如權利要求1所述的酶，其中丙氨酸215由Val替代。
6.如權利要求1-5中任意一項所述的酶，其中組氨酸296由Asn替代。
7.如權利要求1-5中任意一項所述的酶，其中組氨酸296由Ser替代。
8.如權利要求1-5中任意一項所述的酶，其中組氨酸296由Thr替代。
9.如權利要求1-5中任意一項所述的酶，其中組氨酸296由Phe替代。
10.如權利要求1-9中任意一項所述的酶，其中丙氨酸215由Tyr替代且組氨酸296由Ser替代。
11.製備權利要求1-10中的酶的方法，該方法包括-將通過對核苷酸序列SEQ ID NO.2進行定點、隨機或徹底誘變得到的DNA序列插入用於細菌或真核細胞的表達載體；-用所述載體轉化細菌或真核細胞；-培養轉化的細胞，提取並回收表達產物。
12.製備頭孢菌素的方法，該方法包括當存在適當的醯化劑時用權利要求1-10中的酶對頭孢菌素C進行水解作用和醯化作用。
13.編碼權利要求1-10中的酶的核苷酸序列。
14.包含權利要求13的序列的表達載體。
15.用權利要求14的載體轉化的細胞。
全文摘要
通過對天然序列進行定點、隨機或「點飽和」誘變獲得具有頭孢菌素C醯基轉移酶活性的酶，優化在大腸桿菌中的表達。
文檔編號C12P35/06GK1641019SQ20051000046
公開日2005年7月20日 申請日期2005年1月11日 優先權日2004年1月12日
發明者L·波萊焦尼, M·皮洛內, G·莫拉, E·庫凱蒂, R·韋爾加, W·卡布裡 申請人:安蒂比奧蒂科斯有限公司