藥用野生稻抗白葉枯病主效基因Xa3/Xa26-2和它在改良水稻抗病性中的應用的製作方法

2024-03-26 06:18:05

專利名稱：藥用野生稻抗白葉枯病主效基因Xa3/Xa26-2和它在改良水稻抗病性中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域。具體涉及一個水稻抗白葉枯病主效基因Xa3/ Xa26-2的分離克隆、功能驗證和應用。所述的DNA片段能夠賦予水稻抵抗由白葉枯病菌引 起的病害。將該片段與其內源調節序列直接轉入植物體，轉基因水稻可以產生由該基因介 導的對白葉枯病菌的防衛反應。
背景技術：
植物在生長的過程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病 毒、細菌、真菌和線蟲等。病原物侵入植物導致兩種結果(1)病原體成功的在寄主植物內 繁殖，引起相關的病症；(2)寄主植物產生抗病反應，殺死病原物或阻止其生長。利用抗性 基因資源改良植物的抗病性，是預防病害同時又保護環境的根本出路。植物的抗病反應是多基因參於調控的複雜過程。參於植物抗病反應的基因分為兩 類(1)抗病(主效)基因，又稱R(resistance)基因和(2)抗病相關基因。根據目前人們對抗病基因功能的認識，抗病基因的產物主要是作為受體，直接或 間接與病原蛋白相互作用，啟動植物體內的抗病信號傳導路徑(Chisholm等，2006)。抗病 基因介導的抗病反應抗性強，是很好的基因資源。但是農作物栽培種中抗病基因的資源有 限。從近緣物種中發掘新的抗病基因用於農作物遺傳改良一直是研究者工作的一個重要目 標。水稻是世界上重要的糧食作物，但病害的影響常常造成其產量和品質的下降。水 稻白葉枯病由白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)引起，是世界上對水稻危害最 大的細菌性病害之一(過崇儉，1995)。水稻栽培種(Oryza sativa L.)中抗病基因的資源 非常有限。如目前知道的抗白葉枯病基因只有大約30個(儲昭暉和王石平，2007)。由於野 生稻長期處於野生狀態，經受了各種不良環境和災害的自然選擇，形成了極其豐富的遺傳 多樣性。野生稻中蘊藏有優良抗病基因資源，是人們發掘新的優良基因的一個重要資源庫。 已知的大約30個抗白葉枯病基因中就有多個基因是從野生稻中導入進栽培稻中的。如抗 白葉枯病顯性基因Xa21源自西非長藥野生稻(Oryza longistaminata)，對大多數白葉枯 病菌株表現高抗；但是該基因是成株期抗性，即只有在水稻成株期才對白葉枯病菌具有完 全抗性(Khush等，1990 ；Wang等，1996)。Xa21基因已經被分離克隆(Song等，1995)。一個 尚未被分離克隆的抗白葉枯病顯性基因Xa23源自普通野生稻(Oryza rufipogon)，它具有 廣譜抗性(章琦等，2000)。另一個已經被分離克隆的抗白葉枯病基因Xa27來自於四倍體 小粒野生稻(Orzyaminuta)，該基因抗白葉枯病菌菲律賓小種2、3、5和6 (Amante-Bordeos 等，1992 ；Gu等，2005)。此外，尚未被分離克隆的抗白葉枯病基因Xa29 (t)和Xa30 (t)是分 別從藥用野生稻(Orzya officinalis)和普通野生稻中鑑定出的(譚光軒等，2004 ；王春連 等，2004)。

發明內容
本發明的目的是分離克隆藥用野生稻(Oryza officinalis)中攜帶的抗白葉枯病 基因Xa3/Xa26-2和包含調控這個基因的啟動子的DNA片段，利用這個基因改良水稻品種或 其他植物抵禦病害的能力。本發明涉及分離和應用包含Xa3/Xa26-2基因的DNA片段，它的核苷酸序列如序列 表SEQID NO :1所示，它的編碼序列如序列表SEQ ID NO :1中第3284-6191和6295-6662位 所示。該基因(片段)賦予水稻對由白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)所引 起的病害產生特異性的抗病反應。這一發明適用於所有對該病原菌敏感的植物。這些植物 包括單子葉植物和雙子葉植物。除上述所述的如SEQ ID NO :1所示的DNA片段外，本發明 所定義的基因還包括基本上相當於SEQ IDNO 1所示的DNA序列，或者其功能相當於SEQID NO :1所示序列的亞片段。對序列表SEQ ID NO :1所示序列進行生物信息學分析表明，該DNA 序列編碼一種受體蛋白激酶，它包含細胞外的富亮氨酸重複(leucine-rich repeat, LRR) 結構域和細胞內的蛋白質激酶結構域。可以採用已經克隆的Xa3/Xa26-2基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選到本 發明的基因或同源基因。同樣，採用PCR(polymerase chain reaction)技術，也可以從基因 組、mRNA和cDNA中擴增得到本發明的Xa3/Xa26_2基因以及任何感興趣的一段DNA或與其 同源的一段DNA。採用以上技術，可以分離得到包含Xa3/Xa26-2基因的序列或者包含一段 Xa3/Xa26-2基因的序列，將這一序列與合適的載體連接，可以轉入植物細胞，並表達Xa3/ Xa26-2基因，產生抗病轉基因植物。採用這種轉基因技術創造抗病植物是傳統育種技術所 不能達到的。將克隆的抗病基因轉入感病的植物，有助於產生新的抗病植物。特別是可以用遺 傳轉化技術在植物中累加多個抗病基因，而不會產生傳統育種技術中伴隨出現的將遺傳連 鎖累贅引入需改良的品種。同時，抗病基因的克隆可以克服傳統育種不能在植物種間轉移 抗病基因的問題。本發明能夠進一步提供或應用利用上述DNA片段獲得的抗病的轉基因植 株和相應的種子，可以用有性雜交的方式將本發明的基因轉入其它的植物。本發明為增強水稻對白葉枯病的抗性提供了一種新的方法。這種方法包括將來源 於野生稻的Xa3/Xa26-2基因和它的調控DNA序列與遺傳轉化載體連接、轉入感病水稻，改 良水稻對白葉枯病的抗性。更詳細的技術方案見《具體實施方式
》所述。


序列表SEQ ID NO 1.是本發明克隆的Xa3/Xa26_2基因的DNA序列。圖1.本發明鑑定和分離克隆水稻抗白葉枯病基因Xa3/Xa26-2以及驗證Xa3/ Xa26-2基因功能的流程圖。圖2.秈稻品種明恢63中Xa3/Xa26基因和MRKa基因的結構及用於製備DNA探針 的PCR引物(箭頭)位置。圖3. Xa3/Xa26基因片段的DNA探針與9個BAC克隆的雜交結果。λ _ECoT14I是 DNA分子大小標準標準參照物(DNAladder ；購自大連TaKaRa公司)。圖4.秈稻品種明恢63和藥用野生稻中Xa3/Xa26基因家族成員的分布和序列同源性。每一個箭頭代表一個Xa3/Xa26家族成員和轉錄方向。Xa3/Xa26和Xa3/Xa26_2基因 下遊約有1. 4kb核苷酸序列同源程度達到83%。11. 9kb區段是用於遺傳轉化DNA片段。圖5.遺傳轉化載體pCAMBIA1301的結構。圖6. T1代遺傳轉化植株中的報告基因GUS與抗病表型共分離。說明與GUS基因 緊密連鎖的Xa3/Xa26-2基因與抗病表型共分離。對照為水稻感病品種牡丹江8 (遺傳轉化 的受體)。病斑面積為接種白葉枯病菌PX061兩周後的數據。圖7.與對照牡丹江8相比，攜帶Xa3/Xa26-2基因的遺傳轉化植株(D1010M43)對 不同白葉枯病菌的抗性都增強了。圖8.Xa3/Xa26-2基因結構。箭頭示用於基因結構分析的PCR引物位置和方向。 「ATG」和「TGA」分別是翻譯起始密碼和終止密碼。數字示每一種結構的核苷酸數目。
具體實施例方式本發明的前期研究結果顯示來源於秈稻(Oryza sativa L. ssp. indica)品種明恢 63的抗白葉枯病顯性基因Xa3/Xa26屬於多基因家族成員；這個家族的成員以串連排列的 形式位於水稻11號染色體的長臂(Yang等，2003 ；Sun等，2004，2006 ；Xiang等2006)。在 明恢63中，Xa3/Xa26家族由4個成員(Xa3/Xa26、MRKa、MRKc和MRKd)組成，它們的編碼區 之間的DNA序列同源性為60%至78% (Sun等，2004)。Xa3/Xa26編碼一個富亮氨酸重複 (leucine-richrepeat,LRR)蛋白激酶類蛋白(Sun等，2004)。根據本發明中的目標基因與 Xa3/Xa26基因序列同源性分析和它在藥用野生稻(Oryza officinalis)的Xa3/Xa26家族 中與其他成員的相對應位置關係，確定該基因是Xa3/Xa26基因的等位基因，故命名為Xa3/ Xa26-2 基因(視 Xa3/Xa26 基因為 Xa3/Xa26_l)。以下實施例中進一步定義本發明。圖1描敘了鑑定和分離克隆Xa3/Xa26-2基因 以及驗證Xa3/Xa26-2基因功能的流程。根據以下的描述和這些實施例，本領域技術人員可 以確定本發明的基本特徵、並且在不偏離本發明精神和範圍的情況下，可以對本發明做出 各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實施例1 從藥用野生稻中分離克隆Xa3/Xa26-2基因和基因結構分析1.鑑定攜帶Xa3/Xa26基因同源序列的大片段DNA本發明研究人員首先用Xa3/Xa26基因的特異性PCR弓丨物RKb_3，race2 (5，-TGGTCA AATACCGGAAGGAG-3，)和 RKb_2R (5，-CAGTCCACCACATGGACAAG-3，)和 Xa3/Xa26 家族成員 MRKa 基因的特異性 PCR 引物 RKa-llL(5，-TTGGCTTGAACGGCTTAACT-3，)和 RKa-IR(5，-AAGATGA AATATGCTCGGTGGT-3，)從明恢63中擴增出Xa3/Xa26基因和MRKa的DNA片段,擴增長度各 約Ikb (圖2)。將這兩段PCR擴增產物混合作為探針篩選藥用野生稻(Oryza officinalis) 的基因組 BAC(bacterialartificial chromosome)文庫(Ammiraju 等，2006)，鑑定了 9 個 陽性BAC克隆。這9個陽性BAC克隆(Ammiraju等，2006)由美國University of Arizona 大學的Rod Wing教授惠贈。將篩選到得BAC克隆擴大培養，採用標準鹼裂解法分離提取 BAC質粒(Sambrook和Russell，2001)。將所得BAC質粒用Hind III完全酶切、電泳、轉移 至尼龍膜；然後用上述Xa3/Xa26基因片段探針和MRKa基因片段探針分別與載有BAC質粒 的尼龍膜雜交(Sambrook和Russell，2001)。用Xa3/Xa26基因片段作探針的雜交結果顯示 BAC克隆00Ba0120J21具有最多雜交帶(圖3)，推測該BAC克隆可能覆蓋Xa3/Xa26基因家族區段。決定對00Ba0120J21克隆進行測序。2. BAC克隆的shotgun文庫的構建本發明研究人員首先構建了用於測序的00Ba0120J21克隆的shotgun文庫。採用 超聲波法構建shotgun文庫(Sambrook和Russell，2001)。用超聲波處理00Ba0120J21克 隆的環形質粒1. 6秒(超聲破碎儀Sonipr印150為SANYO公司產品，具體操作參考該儀 器的使用說明書)。通過瓊脂糖凝膠電泳分離大約2. 0-3. 5kb的DNA片段，用UNIQ-IO 柱式DNA膠回收試劑盒(購自中國上海生工生物工程有限公司)從電泳凝膠中純化DNA。 純化後的DNA用T4 DNA聚合酶補平末端，與限制性內切酶SmaI酶切的去磷酸化的pUC19 載體(購自美國Amersham Bioscience公司)平端連接，電轉化大腸桿菌DHlOB(購自美 國Invitrogen公司)(電轉化儀為印pendorf公司產品，本實施例所用電壓為1800V，具體 操作參考該儀器的使用說明書)。挑克隆檢測插入片段大小提取陽性克隆質粒，並用空 PUC19質粒進行電泳比較，剔除假陽性克隆及小片段克隆，或用EcoRI和HindIII雙酶切重 組質粒，檢測插入片段大小，篩選插入片段大小合適的克隆作為shotgun文庫用於測序。3. Shotgun文庫的測序採用Ml 3-F (5 『 - G T A A A A C G A C G G C CA G T - 3 『)禾口 M13-R 5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3 『)通用引物(購自中國上海生工生物工程有限公司)、美國 Perkin Elmer公司的測序試劑盒(BigDye Kit)，根據試劑盒說明書以雙脫氧核苷酸末端終 止法分別從shotgun文庫中隨機挑選的克隆兩端測序。4.原始序列的拼接使用Squencer 4. 5 軟體(美國 Gene Codes Corporation)拼接序列。用 Squencer4. 5軟體自動去除末端測序較差的序列和pUC19載體序列；軟體沒有去除乾淨的 序列則用手工刪除。BAC載體的碎片序列和汙染的細菌DNA序列通過和BAC序列進行比較 或BLAST分析的方法(Altschul等，1997)加以去除。用Squencer 4. 5軟體對兩條序列進 行拼接的參數是重疊序列長度(Mini Overlap)大於20bp(base pair)，重疊序列的一致 性(Mini Match)大於85%。每一個鹼基的確定都要參照重疊在該位點的多個shotgun片 段序列。對於由一個shotgun片段序列所覆蓋的區域要再次測序驗證，以確保鹼基的準確 性。5. DNA序列分析首先用Blastn和Blastx方法(Altschul等，1997)分析所得序列。然後採 用 Fgenesh(http//www. softberry.ru/berry.phtml) (Salamov 禾口 Solovyev, 2000) 禾口 GeneMark. hmm (http//exon.gatech. edu/GeneMark/eukhmm. cgi) (Besemer 禾口 Borodovsky, 2005)軟體分析預測基因結構，分析結果進一步用Blastp方法(Altschul等， 1997)進行確定。兩條或多條核苷酸或胺基酸序列的比較分析使用BLAST2 sequence方法 (Tatusova 等，1999)和 Clustalff 方法(http //www. ebi. ac. uk)。對BAC克隆00Ba0120J21測序和序列拼接形成三個大的序列片段，其長度分別為 84. Ikb, 25. 8kb和3. 3kb。序列分析發現在84. Ikb的片段上有4個基因編碼LRR-蛋白激 酶類蛋白，與水稻抗白葉枯病基因Xa3/Xa26編碼的產物有不同程度的同源性，它們被命名 為 OoRKa、OoRKb 1、OoRKb 和 OoRKf (圖 4)。用 Fgenesh,GeneMark. hmm 和 Blastx 分析表明， OoRKa, OoRKb和OoRKf是3個完整的基因，OoRKbl是一個不完整基因(圖4)。OoRKa和OoRKb的轉錄方向相同，而OoRKf的轉錄方向與OoRKa和OoRKb相反(圖4)。將該區段與水稻明恢63中Xa3/Xa26基因家族區段進行比較分析。發現藥用野生 稻中的OORKa基因和明恢63中的MRKa基因的同源程度達到80 %，藥用野生稻中的OoRKb 基因和和明恢63中的Xa3/Xa26 (又稱為MRKb)基因同源程度高達95 % ；並且OoRKb和MRKb 基因下遊約有1. 4kb區段同源程度達到83%，所以OoRKb為Xa3/Xa26的等位基因，我們命 名該基因為Xa3/Xa26-2 (圖4)。實施例2 :Xa3/Xa26-2基因的功能驗證1.遺傳轉化載體的構建本發明所用載體是pCAMBIA1301 (圖5)，它是常用的水稻遺傳轉化載體(Sim等， 2004)。用限制性內切酶EcoRV從BAC克隆00Ba0120J21上酶切後回收11.9kb包含Xa3/ Xa26-2基因的編碼區、啟動子以及尾部序列的片段(圖4)。同時，用限制性內切酶SmaI酶 切遺傳轉化載體PCAMBIA1301 ；酶切完畢，用SAP(蝦鹼性磷酸酶)去磷酸化；用氯仿異戊 醇(體積比24 1)抽提、純化酶切產物。用包含Xa3/Xa26-2基因的酶切回收片段和純化 好的載體做連接反應。通過酶切驗證陽性克隆，獲得的重組質粒被命名為D1010。2.遺傳轉化和Ttl代遺傳轉化植株分析採用農桿菌介導的遺傳轉化方法(Lin和Zhang，2005)將DlOlO導入水稻感病品 種牡丹江8(0ryza sativa ssp. japonica)。獲得的遺傳轉化植株被命名為DlOlOM (該命名 的前面部分即DlOlO為遺傳轉化載體名稱，M代表水稻品種牡丹江8)。本發明共獲得獨立轉 化植株33株。對其中一半轉化植株接種白葉枯病菌株PX061，另一半轉化植株接種白葉枯 病菌株PX0341。白葉枯病菌接種採用剪葉法對成株期的水稻進行接種(Sim等，2004)。白 葉枯病菌株PX061和PX0341由菲律賓國際水稻研究所惠贈(Sun等，2004 ；Wu等，2008)。白 葉枯病菌的培養遵循已經公開發表的方法(Sim等，2004)。接種14天後調查病斑面積(病 斑長度/病葉長度X % )。與對照牡丹江8及遺傳轉化陰性植株相比，絕大部分的陽性遺 傳轉化植株的抗性顯著增強(表1)。表1. T0代遺傳轉化植株(DlOlOM)接種白葉枯病菌株PX061和PX0341的表型
7 (1)每株遺傳轉化基因植株接種3-5片葉，14天後調查病斑和病葉長度，每個數據 來自多個葉片的平均值士標準差。(2)陰性轉化植株，其它植株為陽性轉化植株。3.遺傳轉化植株的共分離分析為了驗證遺傳轉化植株的抗病能力增強是否與Xa3/Xa26-2基因轉入相關，對在Ttl 代抗性增強的3株遺傳轉化植株(D1010M1、D1010M14、D1010M43)的T1代家系進行基因型和 抗性共分離分析。在孕穗期時接種白葉枯病菌PX061，接種14天後調查病斑面積。同時取樣 抽取DNA，採用遺傳轉化載體所攜帶的報告基因GUS ( β -葡萄糖醛酸酶)的PCR引物Gus2F (5』-CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC-3』)和 Gus2R(5』-GAGTGAAGATCCCTTTCTT GTTACCG-3 』) 擴增檢測陽性遺傳轉化植株。分析發現遺傳轉化植株的抗性增強和GUS基因共分離(圖 6)。說明遺傳轉化植株的抗性增強是因為Xa3/Xa26-2基因的存在，Xa3/Xa26-2是一個抗 白葉枯病基因。4.遺傳轉化植株的抗譜分析對T1代遺傳轉化家系D1010M43及對照牡丹江8在孕穗期接種不同白葉枯病菌 株，分析遺傳轉化植株的抗譜。接種採用上述剪葉法。菲律賓白葉枯病菌株PX061、PX071、 PX0112、PX0341由菲律賓國際水稻研究所惠贈(Sun等，2004 ；Wu等，2008)。中國白葉枯病 菌株是常用菌株(Sun等，2004 ;Li等，2009)。日本菌株T7174也是常用白葉枯病菌株(Cao 等，2007)。與遺傳轉化受體水稻品種牡丹江8相比，攜帶Xa3/Xa26-2基因的遺傳轉化植株 顯著增強(P < 0. 01) 了對不同白葉枯病菌株的抗性(圖7)。遺傳轉化植株的病斑面積只 是對照牡丹江8的12%至75%。這些結果說明Xa3/Xa26-2基因對白葉枯病菌具有廣譜抗 性。5. Xa3/Xa26-2基因結構和編碼產物分析本發明研究人員利用轉基因植株(D1010M)分析了 Xa3/Xa26-2基因的結構。轉基 因植株的總RNA的抽提採用TRIzol Reagent (美國Invitrogen公司)，操作方法按公司提 供的說明書進行。先將用於反轉錄的總RNA用無RNA酶活性的DNA酶I (美國Invitrogen公司)處 理，室溫放置15分鐘，去除總RNA中可能存在的DNA汙染；再將總RNA在65°C處理10分 鍾，滅活DNA酶I。用superscript III反轉錄酶(美國Invitrogen公司)，按其提供的說 明書進行反轉錄。採用跨越預測內含子位置的PCR引物RKb3F和RKb2R(表2)擴增基因組 DNA和RNA反轉錄產物，RT-PCR產物比基因組擴增產物小，說明該區段確實存在一個內含子 (圖8)。採用Xa3/Xa26-2基因區段的其它引物(表2)進行反轉錄(RT)-PCR分析，沒有再 發現其它內含子的存在。基因末端序列分析採用Clontech 公司 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒，根據試劑盒說明書，通過RACE (rapid amplification of cDNA end)分析方法，確 定Xa3/Xa26-2基因的5，和3，末端序列。
表2.用於RT-PCR和RACE分析的基因特異性引物 採用上述DNA測序方法，對RT-PCR產物進行測序。比較分析Xa3/Xa26-2基因的 cDNA序列和基因組序列，確定該基因由3600個核苷酸組成，包含兩個外顯子和一個內含子 (圖8)。第一個外顯子由2954個核苷酸組成(位於序列表SEQ ID NO 1的3238-619Ibp 處)，其中包含由46個核苷酸組成的5，端非翻譯區(untranslated region，UTR)(位 於序列表SEQ ID NO 1的3238-3283bp處)和2908個核苷酸組成的編碼區(位於序列 表SEQ ID N0:1的3284-6191bp處)；內含子由103個核苷酸組成(位於序列表SEQ ID NO :1的6192-6294bp處)；第二個外顯子由543個核苷酸組成(位於序列表SEQ ID NO 1的6295-6837bp處)，其中包含由368個核苷酸組成的編碼區(位於序列表SEQ ID NO 1的6295-6662bp處)和由175個核苷酸組成的3，端UTR(位於序列表SEQ ID NO 1的 6663-6837bp 處)。Xa3/Xa26_2基因編碼一個由1092胺基酸組成的LRR受體激酶類蛋白質。XA3/ XA26-2蛋白與XA3/XA26蛋白的胺基酸一致性為92%，胺基酸的同源性為95%。參考文獻儲昭暉，王石平，(2007)，抗性基因分離克隆、結構與功能和分子進化，見章琦主 編，水稻白葉枯病抗性的遺傳及改良。北京科學出版社，pp. 349-377。過崇儉(1995)中國農作物病蟲害。中國農業科學院植物保護研究所主編，中國農 業出版社，PP. 14-24。譚光軒，任翔，翁清妹，時振英，祝莉莉，何光存，藥用野生稻轉育後代一個抗白葉 枯病新基因的定位，遺傳學報，(2004)31 :724-729。王春連，趙炳宇，章琦，趙開軍，邢全黨，水稻白葉枯病新抗源Y238的鑑定及其近 等基因系培育，植物遺傳資源學報，(2004)5 :26-30。章琦，趙炳宇，趙開軍，普通野生稻的抗水稻白葉枯病新基因Xa23的鑑定和分子 標記定位，作物學報，(2000)26 :536-542。
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權利要求
一種分離的對白葉枯病產生抗性的基因Xa3/Xa26 2，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO1所示。
2.一種分離的對白葉枯病產生抗性的基因Xa3/Xa26-2，它的編碼序列如序列表SEQ IDNO 1 中第 3284-6191 和 6295-6662 位所示。
3.權利要求1或2所述的基因在增加水稻對白葉枯病抗性中的應用。
全文摘要
本發明涉及植物基因工程技術領域。具體涉及包含藥用野生稻抗白葉枯病主效基因Xa3/Xa26-2的DNA片段的分離克隆和功能驗證。Xa3/Xa26-2基因編碼富亮氨酸蛋白激酶類蛋白質。它能夠賦予水稻抵抗由細菌性病原菌-白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起的病害。將該片段與其自身調控序列直接轉入水稻，攜帶Xa3/Xa26-2的轉基因水稻對白葉枯病的抵抗能力顯著增強。
文檔編號C12N15/29GK101892244SQ20101012593
公開日2010年11月24日 申請日期2010年3月17日 優先權日2010年3月17日
發明者李弘婧, 王石平 申請人:華中農業大學