水稻白葉枯病菌和水稻細條病菌的padlock探針及多重檢測方法
2024-03-26 05:53:05
專利名稱：水稻白葉枯病菌和水稻細條病菌的padlock探針及多重檢測方法
技術領域：
本發明涉及檢測水稻白葉枯病菌(^b"^wwwas. o^zaepv. oo;zae)和水稻細菌 性條斑病菌(義a"Ao附oway.w7加e pv.oo^'co/e)的padlock探針以及能夠同時檢測這 兩種植物病原菌的多重檢測方法，屬於生物技術領域。適用於口岸檢驗檢疫、農 業生產、植物保護等部門使用。
(二)
背景技術：
水稻白葉枯病是一個世界性病害，每年給水稻生產造成的損失輕則10%，重 則30%，甚至可達50%以上。自1884年在日本發生以來，相繼在亞洲、歐洲、 大洋洲、非洲和北美洲均有發現(MewT.1989)，目前其發生範圍已遍及全球水稻 栽培地區(OuSH. 1985;MewTW 1987;SwingJM. 1990)。水稻細菌性條斑病亦 是危害水稻的重要細菌病害，其危害僅次於水稻白葉枯病，屬國內植物檢疫性病 害。在國外，俄羅斯、韓國、澳大利亞、美國等均把它列為檢疫性有害生物。在 熱帶亞洲各國均有發現，在非洲中部亦有發生。中國主要分布在華南稻區，近年 來在長江流域雜交稻上亦有發現。水稻白葉枯病菌和細菌性條斑病菌均借種子調 運做遠距離傳播。因此，在國內調種引種前，儘量到產地實地考察進行產地檢驗， 十分有效且完全必要。檢測技術先進、可靠，外來有害生物傳入的風險就可以降 低。
目前己有很多不同的PCR檢測技術應用於水稻白葉枯和細菌性條斑病菌的 檢測和鑑定。Sakthivel等(2001 )利用IS1113序列設計了一對引物TXT和TXT4R， 通過PCR對水稻白葉枯病菌進行擴增，得到片段大小為964bp的擴增引物。該方 法可以快速簡便的從受侵染的稻種和稻株上檢測到白葉枯病菌，但是引物的轉化 性不夠強，不能很好的區分出條斑病菌。廖曉蘭等(2003)成功建立了水稻白葉 枯病菌和細菌性條斑病菌快速檢測鑑定的實時螢光PCR方法。結果表明，兩個特 異性探針能分別特異性檢測到病原菌產生的螢光信號而其他參試菌不產生螢光信 號，檢測靈敏度為103cfWml-105cfWml，該方法可以有效地避免傳統PCR方法無 法避免的非特異性擴增和假陽性現象。近年來的調查研究發現，水稻白葉枯病和條斑病在同一稻田可以同時發生， 甚至在同一葉片上出現兩種病害的症狀(黃瑞榮等，1996)。已有許多研究者通 過設計專化性引物來檢測白葉枯病菌和條斑病菌，但是由於這兩種病菌是水稻黃 單胞菌的不同致病變種，在生理生化等方面比較類似，還存在不同程度的交互抑 製作用(王長方等，1999)，通過PCR擴增往往產生交叉反應，因而很難把白葉 枯病菌和條斑病菌完全區分開來。雖然，在實時定量PCR應用到植物病原菌檢測 以後，通過在實時定量PCR的反應體系中加入不同的螢光染料，根據不同染料發 出螢光顏色的差異來區分不同的病原物(Heide/a/，1996)。但是，這種方法仍存在 缺陷，由於受到引物設計問題、螢光染料的種類和螢光定量PCR儀光源是單一光 源問題(Martin^a/，2000)，因此不能同時檢測非常多的病原物。所以我們極有必 要建立能夠同時檢測這兩種病原菌的多重檢測方法。
Padlock探針(PLPs)的發明為植物病原菌的高通量分子檢測提供了一條新的 思路。Padlock探針是一條長度為100bp左右的單核苷酸探針(
圖1),包括磷酸化 的5'端和羥基化的3'端，這兩端能夠識別特定目標物的DNA序列(Nilsson " a/, 1994),我們通常稱之為T1端和T2端。在T1端和T2之間，存在著一段通用序 列和一段特異序列，我們稱之為P1、 P2端和ZipCode。在進行反應時，首先將 padlock探針和要檢測的目標DNA進行連接，在TaqDNA連接酶的作用下，探針 的Tl端和T2端通過和特定的檢測靶標物的DNA序列互補而相結合，探針的5' 端和3'端連成環狀。由於ra《DNA連接酶的特性，只有DNA序列和探針的T1 端和T2端完全互補時，探針才能形成環狀，否則，探針以線性存在。採用核酸 外切酶去除沒有形成環狀的探針和錯配的探針，然後採用所有探針的通用端Tl 端和T2端的引物對切除後的產物進行滾環擴增。然後將擴增後的產物與固定在 膜上或者Microarray上的與ZipCode序列互補的核酸序列進行雜交(Shoemaker W fl/， 1996)。通過膜上的地高辛標記信號或者Microarray上的螢光來判斷檢測樣品 中是否有特定的病原物。由於padlock探針可與Macroarray或者Microarray技術 相結合，因此能夠在檢測的過程中實現高通量(HardenbolWa/,2003)。目前， padlock探針獨特的設計多與基因晶片相結合應用於病毒性疾病分子的檢測 (Baner J W fl/，2007)和單核苷酸突變檢測當中(Baner J e, "/，2003)。目前尚未有將 padlock探針應用於植物病原菌實際檢測的實例。參考文獻
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發明內容
技術問題
本發明的目的是解決現有技術中對水稻白葉枯病菌和水稻細菌性條斑病菌 的分子檢測方法難以實現多重檢測等問題，提供分別用於檢測水稻白葉枯病菌和 水稻細菌性條斑病菌的padlock探針以及同時檢測這兩種病原菌的分子檢測方 法，對水稻白葉枯病菌和水稻細菌性條斑病菌進行檢測，靈敏度高、特異性強。技術方案
本發明的目的意在克服上述現有技術的不足，提供快速、可靠、靈敏度高、 特異性強的檢測水稻白葉枯病菌的padlock探針和檢測水稻細菌性條斑病菌的 padlock探針以及能夠同時檢測這兩種病原菌的分子檢測方法。
實現上述目的的技術方案
1) 用於檢測水稻白葉枯病菌的padlock探針序列
2) 用於檢測水稻細菌性條斑病菌的padlock探針序列
探針的靶標識別序列(即5'末端和3'末端)取自待測病原菌16S-23S rDNA (ITS)區域特異的核酸序列。探針中間PiP2 (CTCGACCGTTAGCAGCATGACCG AGATGTACCGCTATCGT)為通用引物結合區，加下劃線的鹼基序列(即Zipcode 序列)用於識別固定在尼龍膜上的cZipcode探針。
3) Padlock探針是一種長寡核苷酸探針，其兩端的序列可通過核酸間的互補與靶 標DNA結合。通過和耙標DNA的雜交，padlock探針的兩端在連接酶的作用下連 成環狀，具有非常高的特異性。Padlock探針可與Macroarray技術結合進行多重 檢測。Padlock探針結合Macroarray技術檢測方法，包括如下步驟(1)探針 的連接與外切酶處理。首先將padlock探針和待檢測的目標DNA進行雜交，在 TaqDNA連接酶的作用下，探針的兩端通過與特定的檢測靶標物的DNA序列互 補而相結合，探針的5'末端和3'末端連成環狀。採用核酸外切酶去除沒有形成環 狀的探針和錯配的探針。(2)探針的擴增。採用兩條探針P-x.o.o、 P-x.o.oc經
地高辛標記的通用引物對連接產物進行擴增。(3) Macroaary多重檢測。將擴 增後的產物與固定在膜上的與探針上的ZipCode序列互補的探針(cZipcode探針) 進行雜交。通過膜上的地高辛標記信號來判斷檢測樣品中哪些病原物。 有益效果採用上述技術方案，突出的技術進步在於 (1)本發明設計了分別適用於水稻白葉枯病菌和細菌性條斑病菌檢測的 padlock探針。(2)本發明利用padlock探針結合Macroaary技術，實現了對水 稻白葉枯病菌和細菌性條斑病菌的多重檢測，檢測方法可靠、靈敏度高、特異性 強。(3)採用padlock探針作為分子檢測工具，有效地避免傳統PCR檢測方法的假陽性現象。傳統的基於PCR擴增的分子檢測通常只能檢測單種病原物，螢光 定量PCR的出現在一定程度上解決了這一問題，通過在反應的體系中添加不同熒 光染料，可以同時檢測l種以上的病原物。但是由於螢光染料種類的限制和彼此 之間的幹擾，採用這種方法對多種病原物進行檢測時候效果往往不好。採用 padlock探針作為分子檢測工具，結合Macroaary技術彌補了實時定量PCR檢測 因受到引物設計問題、螢光染料的種類和螢光定量PCR儀光源是單一光源等問題 而不能同時檢測非常多的病原物的不足。 (四)說明書附圖
圖1. Padlock探針結構示意圖及檢測原理。 圖2A.水稻白葉枯病菌特異性驗證結果。
M為DNA Maker DL2000, 1~10為水稻白葉枯病菌，11~21為其他細菌，22為陰性 對照。
圖2B.水稻細菌性條斑病菌特異性驗證結果
M為DNA Maker DL2000, 1~10為水稻細菌性條斑病菌，11 22為其他細菌，23為 陰性對照。
圖3水稻白葉枯和水稻細菌性條斑的靈敏度驗證結果。
M為DNA Maker DL2000, 1-6為病原菌DNA依次為10 ng 、 lng、 100pg、 10pg、 lpg、 lOOfg 7為陰性對照。分別以十倍梯度稀釋的DNA為模板，利用padlock探針檢 測，最低可檢測到lpg。
圖4水稻白葉枯病菌和水稻細菌性條斑病菌的多重檢測結果。 ， A. Jfawf/zoOTOwos oryzae pv. oryzae; B. A2 "^zo附owo oryzore pv.ofyz/co/a; CJTa加/20附owos or少zae pv. 0^/zag and Xaw^ 歸owas or_yzfl6 pv.o;-戸'co/a; D. Layout of multi-chamber universal tag array on nylon membrane. cZip control= TATGGTCGG CAATTCCCTGC。
結果表明，利用padlock探針結合Macroaary技術可以成功地對水稻白葉枯病 菌和水稻細菌性條斑病菌進行多重檢測。
圖5利用Padlock探針結合Macroaary技術對田間發病的水稻樣品檢測結果。
結果表明，利用padlock探針結合Macroaary技術可以成功地對田間發病的水 稻樣品進行檢測。
具體實施方式
實施例1: 一種利用padlock探針結合Macroaary技術的多重檢測方法，用於同 時檢測水稻白葉枯病菌和細菌性條斑病菌。 用於檢測水稻白葉枯病菌的padlock探針序列
用於檢測水稻細菌性條斑病菌的padlock探針序列
(1)連接反應液包括20mM Tris-HCL， pH 9.0， 25 mM KCH3COO， 10 mM Mg(CH3COO)2， 10 mM DTT, 1 tnM NAD, 0.1% Triton X-100, 2.4 U T叫DNA連接 酶，lpl待測模板，探針P-x.o.oc 、 P-x.o.oc各100pm。連接的反應程序為95。C預 變性5分鐘；然後進入循環，95'C變性30秒，65'C連接5分鐘，反應共進行20 個循環；然後95'C滅活15分鐘。採用核酸外切酶切除自連和錯連的探針在連 接後的產物中加入2個單位的核酸外切酶I和2個單位的核酸外切酶III， 37'C反 應2個小時，然後將反應後的產物95'C滅活3小時。
(2) 採用經地高辛標記的通用引物P1-F (5'-CTCGACCGTTAGCAGCATGA-3，) P2-R(5'-CCGAGATGTACCGCTATCGT-3')對連接產物進行PCR擴增，反應液包括 0.5 nMPl-F和P2-R，4種dNTP各50 ^M，2.5 (jl 10xPCR反應緩衝液，2 mMc Mg2+， 2.5|all%BSA， 1.25單位Taq酶(TaKaRa)， 3pl經核酸外切酶處理後的連接產物。 反應程序為94'C預變性5 min;然後進入循環，94。C變性30 sec， 6(TC退火30 sec， 72。C延伸30sec，共35個循環；最後72。C延伸7 min。
(3) Macroaary多重檢測。各取lpL cZipcode探針點於尼龍膜上，，每條 cZipcode探針重複4次，經紫外交聯30s固定。將固定好的膜放入雜交管中，加 入預雜交液(0.02% SDS、 5xSSC、 50%去離子甲醯胺、0.1%N-laurysarosine、 50 mmol丄-1磷酸鈉、pH 7.0 2%封閉劑)於雜交爐中42。C預雜交lh,棄預雜交液， 將經地高辛標記的擴增產物沸水浴中變性10rain，迅速移至冰上，5分鐘後加入預 雜交液中，42'C雜交過夜後，用大量2XSSC、 0.1% SDS室溫洗膜2次，每次5 min，再用0.5XSSC、 0.1% SDS於68。C洗膜2次，每次15min。洗膜後把膜加 入洗滌液(0.1 mol.L"馬來酸、0.15mol.L"NaCl， pH7.5、 0.3%吐溫)中洗膜2 min,棄去，用封閉液(1%封閉劑、0.1 mol.L"馬來酸、0.15 mol.L" NaCl， pH7.5)封閉30min後，加入用封閉液稀釋了 5 000倍的Anti-DIG-AP，輕搖30 min。 最後，將結合完抗體的膜用洗滌液洗膜2次，每次15min，加入檢測液(O.lmoH/1 Tris-HCl、 0.1 mol.L"NaCl、 pH9.5)平衡3 min,再加入NBT/BCIP溶液，黑暗 中靜止顯色2h，待觀察到理想的顯色後，用無菌水浸泡10min終止反應，進行 拍照。通過膜上的地高辛標記信號來判斷檢測樣品中哪些病原物。 實例l從安徽發病的水稻中檢測水稻白葉枯病菌和細菌性條斑病菌
上述水稻白葉枯病菌和細菌性條斑病菌的padlock檢測探針及其多重檢測方法 用於檢測安徽的發病水稻，方法包括
1) 將安徽發病的水稻樣品分別從其根部(R)、莖杆(S)以及葉片(L)提取DNA作為 檢測模板，提取方法參照McMcouchSR (1988)。
2) 參照上述技術方案利用padlock檢測探針P-xoo、 P-xooc結合Macroaary檢測
樣品。檢測結果見圖5。結果表明從安徽發病的60份水稻樣品中共檢測出19份 帶有白葉枯病菌，17分帶有細菌性條斑病菌。證明了上述技術方案能夠應用於水 稻白葉枯病菌和細菌性條斑病菌的實際檢測。
權利要求
1、用於檢測水稻白葉枯病菌的padlock探針序列P-x.o.o5』-GGAGCTATATGCCGTGCTGTGTGGAGTAPIP2＊GAATCGCCTACAATTCTGTCCCCCAAGTTGCCTC-3』
2、 用於檢測水稻細菌性條斑病菌的padlock探針序列
3、 權利要求Padlock探針結合Macroarray技術檢測方法，包括如下步驟(1)探針的連接與外切酶處理。首先將padlock探針和待檢測的目標DNA進行 雜交，在TaqDNA連接酶的作用下，探針的兩端通過與特定的檢測耙標物的DNA 序列互補而相結合，探針的5'末端和3，末端連成環狀。採用核酸外切酶去除沒有 形成環狀的探針和錯配的探針。(2)探針的擴增。採用兩條探針P-x.0.0、 P-x.o.oc 經地高辛標記的通用引物對連接產物進行擴增。(3) Macroaary多重檢測。將 擴增後的產物與固定在膜上的與探針上的ZipCode序列互補的探針(cZipcode探 針)進行雜交。通過膜上的地高辛標記信號來判斷檢測樣品中哪些病原物。
全文摘要
本發明用於檢測水稻白葉枯病菌和水稻細菌性條斑病菌的padlock探針及其多重檢測方法屬於農作物防病治病及植物檢疫範疇。水稻白葉枯病菌的padlock探針序列P-x.o.oGGAGCTATATGCCGTGCTGTGTGGAGTACTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGTACCGCTATCGTGAATCGCCTACAATTCTGTCCCCCAAGTTGCCTC。水稻細菌性條斑病菌的padlock探針序列P-x.o.ocCCACACAACACGGCATATCGCTCCAAGGCTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGTACCGCTATCGTGCGGCATACGTTCGTCAAATGGTGGCTTTGTACC。以此探針為基礎結合Macroaary技術能夠同時檢測水稻白葉枯病菌和細菌性條斑病菌，這種多重檢測方法具較強的特異性、靈敏性及穩定性，為水稻白葉枯病菌和細菌性條斑病菌的檢測提供了快速、靈敏、特異的技術方法。圖為Padlock探針結合Macroaary技術同時檢測水稻白葉枯病菌和水稻細菌性條斑病菌結果。
文檔編號C12R1/64GK101608235SQ20091003012
公開日2009年12月23日 申請日期2009年3月27日 優先權日2009年3月27日
發明者劉鳳權, 王源超, 田豔麗, 胡白石, 鄭小波 申請人:南京農業大學