水稻細菌性谷枯病菌檢測用培養基的製作方法

2024-03-26 05:29:05

專利名稱：：水稻細菌性谷枯病菌檢測用培養基的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物檢測技術，具體地說涉及水稻細菌性谷枯病菌檢測用培養基。
背景技術：
：水稻細菌性谷枯病(Bacterialgrainrotofrice)是由穎殼伯克氏菌(Burkholderiaglumae)引起，是近年來一種危害嚴重的水稻種傳病害，它不但侵害穀粒，而且還引起水稻秧苗腐爛，造成水稻的嚴重減產和損失。種子帶菌是該病菌遠距離傳播的主要途徑，播種帶菌病穀粒，遇有適宜的發病條件，如高溫多日照，降雨量少易發病。病菌可通過氣孔和傷口侵入，病菌在植株體內繁殖，在細胞間擴散，引起葉鞘薄壁組織的分解。1970年代後期由於推行機械化生產而進行大面積的工廠化育秧，導致B.glumae引起的水稻苗腐病大流行，目前該病已成為日本水稻最嚴重的病害之一，並造成傳播流行。目前水稻細菌性谷枯病已經蔓延到印度尼西亞、泰國、越南、韓國、斯裡蘭卡、馬來西亞、菲律賓等東南亞國家及南美洲的哥倫比亞等國。非洲的坦尚尼亞及美國的路易安那洲相繼報告有該病發生。Shahjahan等報導該病在美國可導致1580X的產量損失。我國臺灣地區1983年也有水稻細菌性谷枯病的發生報導並在病原及品種抗性方面做過一些研究。也曾有報導我國貴州省有細菌性谷枯病的發生，但未得到進一步的證實。日本、韓國、美國、越南等國已有多起細菌性谷枯病分離和危害的報導。日本和韓國由於Burkholderiaglumae對水稻的危害嚴重，在病原和危害發生等方面進行了較多的石開究。1986年TushimaS.，S.Wakimoto，等在SelectivemediumfordetectingPseudomonasglumaeKuritaetTabei，thecausalbacteriumofgrainrotofrice一文中報導研究了檢測Burkholderiaglumae的S-PG選擇性培養基；2000年，MitsuoK，Kiyotsugu.O等在NewSelectiveMediumforIsolationofBurkholderiaglumaefromRiceSeeds—文中報導了研究用於分離Burkholderiaglumae的CCNT選擇性培養基；2004年xianglongyuan等在Indentificationofbacterialpathogenscausingpanicleblightofriceinlouisiana—書中應用KBA培養基對水稻細菌性谷枯病菌進行分離培養，並採用Biolog微生物鑑定系統、傳統生化試驗、致病性測定對谷枯病菌進行鑑定，羅金燕等在水稻細菌性谷枯病病原菌分離鑑定一文中採用脂肪酸測定、Biolog微生物鑑定系統以及RAPD-PCR等方法對水稻細菌性谷枯病菌進行了鑑定，劉友勳等在水稻細菌性條斑病菌致病型鑑別品種的篩選一文中採用PSA培養基對植物病原菌進行了培養。但對於用於添加至培養基中增快培養速度和增加檢出率的增效因子並無相關報導。
發明內容本發明目的在於提供用於水稻細菌性谷枯病菌培養基中添加水稻葉汁(以下用D表示)和胡蘿蔔汁(以下用C表示)中的至少一種，達到水稻細菌性谷枯病菌在培養基上的生長速度加快和增加檢出率。本發明提供的水稻細菌性谷枯病菌檢測用培養基，在水稻細菌性谷枯病菌生長或選擇性分離培養基中添加水稻葉汁和胡蘿蔔汁中的至少一種。本發明發現，通過加入水稻葉汁和胡蘿蔔汁中的至少一種，能增快水稻細菌性谷枯病菌在培養基上的生長速度，提高檢出率。根據本發明的實施例，同時加入水稻葉汁和胡蘿蔔汁時，有增敏效果。根據本發明的實施例優選的添加的水稻葉汁或/和胡蘿蔔汁的濃度是1-5%。添加的水稻葉汁或/和胡蘿蔔汁的終濃度大於上述濃度，並沒有不利影響，同樣具有增敏的作用，只是從實用的角度看，不需要更大的濃度。其中，上述濃度中又以2.5%為最佳。水稻葉汁和胡蘿蔔汁的製備方法非常簡單，即通過打碎水稻葉或胡蘿蔔後，經過過濾除菌後，即可得到水稻葉汁或胡蘿蔔汁。選擇在4t:冷藏備用。當然，可以根據本發明的增效因子組裝成培養基試劑盒，以方便使用。本發明採用的用於水稻細菌性谷枯病菌培養基，顯著地提高了水稻細菌性谷枯病菌的檢出率和檢出速度，為菌種的復活培養和水稻材料的生物安全檢疫提供了保證。具體實施例方式下面實施例用於對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1增效因子的提取和培養基製備。水稻葉汁的製備取新鮮水稻葉剪碎後按照質量比1:2添加蒸餾水後榨汁機榨汁，O.45iim濾膜過濾除菌後4t:冷藏備用。以下簡稱D。胡蘿蔔汁的製備直接將新鮮胡蘿蔔榨汁機榨汁後，0.45ym濾膜過濾除菌後4t:冷藏備用。以下簡稱C。PS液體培養基配方(生長培養基的一種)酵母粉lg牛肉浸膏3g蛋白腖5g蔗糖15g蒸餾水1L以上成份充分混合後調節ra至7.2，分裝50mL每瓶，115"滅菌15min後備用。向滅菌後的PS液體培養基(生長培養基)中添加D、C以及兩者的混合物D+C(體積比為2:l)，製備成液體培養基。向滅菌後溫度為53t:左右的PSA平板中添加過濾除菌的D、C以及兩者的混合物(體積比2:1)，傾注平板，表面晾乾備用，PSA培養基在PS液體培養基中添加18g細菌瓊脂粉即可。向滅菌後溫度為53t:左右的S-PG選擇性瓊脂和CCNT選擇性瓊脂中添加過濾除菌的D、C以及兩者的混合物(體積比2:l)，傾注平板，表面晾乾備用。水稻細菌性谷枯病菌鑑定方法採用Biolog微生物鑑定系統方法進行水稻細菌性谷枯病菌的鑑定。本方法所使用的Biolog微生物鑑定儀型號為BIOLOGELX808BLG，微生物鑑定板為biologGN2鑑定板。將水稻細菌性谷枯病菌疑似菌落接種至Biolog鑑定系統專用BUG平板培養基上進行富集培養，28°C±1°C培養24小時後，並挑取BUG上的單個菌落再次轉接BUG培養基，使其性狀充分表達以適合Biolog鑑定。用滅菌棉籤挑取取BUG上二次培養的菌落接種至GN/GP-IF接種液，並調節菌懸液濃度至目標濁度為52%±2，並靜止放置5分鐘。接種調節好菌濃度的接種液至GN2微生物鑑定板中，每孔接種菌液150L。將接種完成的微孔板放置於28°C±1°C中保溼培養24小時後使用Biolog微生物自動鑑定系統進行鑑定分析。實施例2增效因子在PSA搖瓶培養基中的增效作用。用3mm接種環挑取將4t:保存4周的水稻細菌性谷枯病菌，在裝有1ml滅菌PBS的試管中塗抹均勻，取50L接種至添加有終濃度為2.5%(v/v)的實例1中不同植物提取物的50mlPS液體培養基中，並接種未添加植物提取物的PS液體培養基做陽性對照(CK)，同時以未接種水稻細菌性谷枯病菌的PS液體培養基作為陰性對照，28t:±rC180rpm振蕩培養，4小時後開始每1小時無菌條件下取菌液塗布5個PSA瓊脂平板進行計數，液體培養基繼續培養，至菌液生長24小時，取平均值並記錄試驗結果。取培養12小時後的菌液20mL至滅菌同規格50mL離心管中，lOOOOrpm離心20min後，去上清，觀察菌體生長情況並照相。計算5個平行試驗的平均值(P>0.05)後得出以下試驗結果陰性對照均未生長出菌落，添加了D+C混合物和單一添加D的搖瓶培養基中水稻細菌性谷枯病菌的生長速度明顯增快，在培養10小時前其菌落數量也較未添加提取汁的培養基上有明顯地增加，而同一時間內添加D+C混合因子的培養基較單一添加D的培養基中水稻細菌性谷枯病菌菌落生長顯著性地增加(P<1。22.OxlO12.3〉<10241.5xl027.8〉<1033.lxl026.7〉<1036.4x1025.1〉<10465.5xl038.1〉"09104.1xl089.6x10107.7xl085.4x1010培養12小時，添加D+C混合物和添加D的培養基中菌液離心得到的沉澱較未添加和單一添加C的培養基中得到的沉澱有明顯增加。稱重後菌體重量分別為CK(1.2g);添加D(2.lg);添加D+C(2.3g);添加C(l.3g)。稱重結果表明添加D和添加D+C至PS液體培養基中時，菌體生長較旺盛。實施例3增效因子在PSA培養基上的增效作用。將fC保存4周的水稻細菌性谷枯病菌用滅菌生理鹽水洗下菌苔，製備成均勻的菌懸液，十倍稀釋法將菌液稀釋至一定濃度，取O.lmL塗布添加濃度為1%、2.5%和5%(v/v)的D、C和D+C的PSA平板，同時塗布未添加植物提取物的瓊脂平板作為陽性對照，同時以未接種水稻細菌性谷枯病菌的平板作為陰性對照，進行5次平行試驗，2『c士rc培養，IO小時後觀察菌落生長情況，之後每小時觀察一次，並記錄菌落生長數量。試驗結果為陰性對照均未生長出菌落，在添加D和D+C混合因子的情況下，PSA瓊脂平板上菌落較其它兩種培養基上生長速度增快5個小時，且在同時段內觀察菌落生長也有明顯地增加。在18小時添加有D+C混合液的瓊脂平板上生長的菌落較添加D的瓊脂平板上生長的菌落多，到24小時時菌落數相近(P>0.05)。在PSA瓊脂培養基中添加終濃度2.5%(v/v)D+C能增加水稻細菌性谷枯病菌在瓊脂平板上的生長速度，且生長數量在同時段內也較未添加的培養基上有顯著性地增加(P<0.05)，添加5%D(v/v)與添加2.5%(v/v)的D+C無明顯差別。(表2)表2水稻細菌性谷枯病菌在添加不同成分PSA瓊脂平板中生長情況tableseeoriginaldocumentpage6注"/"表示未出現典型菌落，單位cfu/Ml實施例4增效因子在S-PG和CCNT培養基上的增效作用。稱取10g或400粒的4C保存4周含水稻細菌性谷枯病菌的水稻種子，放入90mL0.001X吐溫-磷酸鹽緩衝液(pH7.0)中低溫(8°C±2°C)浸泡4h，用均質器打碎，製備樣品提取液。將樣品提取液置於22°C25t:環境中4h後，旋渦混勻懸浮液5min，懸浮液進行十倍梯度稀釋，稀釋後的IOX，IOOX以及1000X三個稀釋度分別放入到已製備好的添加有終濃度為2.5%(v/v)的增效因子的S-PG和CCNT的平皿中(每個平皿加0.2mL)，用L-型玻璃棒將液體均勻塗布在瓊脂的表面。同時塗布未添加植物提取物的瓊脂平板作為陽性對照，並以未接種水稻細菌性谷枯病菌的平板作為陰性對照，進行5次平行試驗，28°c士rc培養，io小時後觀察菌落生長情況，之後每小時觀察一次，並記錄菌落生長數試驗結果陰性對照均未生長出菌落，添加了增效因子D+C和增效因子D的半選擇性培養基上水稻細菌性谷枯病菌的生長速度增快約6小時，其菌落數量也較未添加提取物的培養基上有顯著性地增加(P<0.05)，添加D+C較添加單一D的培養基上菌落生長速度快且菌落數多。(表3)表3水稻細菌性谷枯病菌不同時間在添加不同成份的選擇性培養基上生長情況CKD+CCD注"/"表示未出現典型菌落，單位cfu/mL結論本發明得到了兩種在液體培養基中對水稻細菌性谷枯病菌生長有促進作用的植物提取物D和植物提取物C，通過對添加該兩種提取物至瓊脂平板中的研究表明，在瓊脂平板上添加D和添加D+C時生長情況較未添加和單一添加C的生長情況好。而在生長較快的同時段下，添加D+C的瓊脂培養基上水稻細菌性谷枯病菌生長較單一添加D的培養基上生菌落生長明顯且數量較多，因此可以在半選擇性瓊脂培養基中添加植物提取物D+C，達到改良培養基的目的。新研究的培養基可用於水稻細菌性谷枯病的分離檢測，在添加植物提取物D+C終濃度為2.5%(v/v)的瓊脂培養基中，谷枯病菌生長速度可加快56小時，同時可達到修復受損細菌的目的，提高細菌性谷枯病的檢出率30%40%。添加增效因子適用於水稻細菌性谷枯病菌的生長和選擇性培養基。CCNT24h25h26h27h28h29h30hS-PG/CCNT/S陽PG/CCNT/S陽PG/CCNT/S-PG////4.5X103//////2.6X103///7.1X103///6.6X103//7.6X1034.6X103//6.8X1033.4X103/8.9X1036.5X103//7.2X1034.6X103/2.3X1047.4X103//1.6X1046.5X103/6.4X1045.1X104//3.5X1042.3X104/8.9X1047.0X1043.5X103/6.7X1044.8X104/2.2X1051.3X1054.7X103/8.9X1047.5X1046.8X1032.2X1051.7X1059.4X1036.7X1031.8X1059.8X1041.8X1042.4X1051.9X1053.2X1042.1X1041.9X1051.4X1053.4X1042.4X1052.1X1055.6X1045.5X1041.9X1051.8X1054.1X1042.5X1052.1X1055.6X1045.5X1041.9X1051.8X1058.8X1042.5X1052.3X1051.9X1051.7X1052.2X1052.1X1051.7X1052.5X1052.3X1051.9X1051.8X1052.2X1052.1X1051.7X1052.5X1052.3X1051.9X1051.8X1052.2X1052.1X105333444555ooooooooohhhhhhhh234567893333333f*J權利要求水稻細菌性谷枯病菌的檢測用培養基，其特徵在於在水稻細菌性谷枯病菌生長或選擇性分離培養基中添加水稻葉汁和胡蘿蔔汁中的至少一種。2.根據權利要求1所述的水稻細菌性谷枯病菌的檢測用培養基，其特徵在於添加的水稻葉汁或/和胡蘿蔔汁的濃度是1_5%。3.根據權利要求1所述的水稻細菌性谷枯病菌的檢測用培養基，其特徵在於添加的水稻葉汁或/和胡蘿蔔汁的濃度是2.5%。4.權利要求1-3之一所述的檢測用培養基在檢測水稻細菌性谷枯病菌中的應用。5.試劑盒，包括水稻細菌性谷枯病菌生長或/和選擇性分離培養基，以及水稻葉汁和胡蘿蔔汁中的至少一種。全文摘要本發明涉及生物檢測技術，具體地說涉及水稻細菌性谷枯病菌檢測用培養基。本發明提供的水稻細菌性谷枯病菌檢測用培養基，在水稻細菌性谷枯病菌生長或選擇性分離培養基中添加水稻葉汁和胡蘿蔔汁中的至少一種。本發明採用的用於水稻細菌性谷枯病菌培養基，顯著地提高了水稻細菌性谷枯病菌的檢出率和檢出速度，為菌種的復活培養和水稻材料的生物安全檢疫提供了保證。文檔編號C12Q1/04GK101712978SQ20091004403公開日2010年5月26日申請日期2009年8月5日優先權日2009年8月5日發明者朱金國,莫瑾申請人:湖南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心