水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子標記及其應用的製作方法

2024-03-26 05:40:05

水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子標記及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於農作物生物【技術領域】，具體涉及水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子標記及其應用。所述分子標記基於核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示的特異性插入/缺失位點多態。兩個分子標記是針對Pi2功能基因兩側緊密連鎖區間開發的共顯性分子標記，具有準確性高、可廣泛應用於不同育種親本的優點。通過檢測兩個分子標記，可以準確判斷所檢測水稻材料是否具有抗病基因Pi2。利用分子標記組合，能夠準確檢測Pi2功能基因親本與其它親本的雜交轉育後代植株基因組中是否含有Pi2功能基因以及其純合狀態，提高選育含有Pi2功能基因抗稻瘟病水稻品種的效率。
【專利說明】水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子標記及其應用

【技術領域】
[0001]本發明屬於農作物生物【技術領域】，具體涉及水稻抗稻瘟病基因/--的分子標記及其應用。

【背景技術】
[0002]水稻是中國乃至世界上最重要的糧食作物之一，但其生產遭受稻瘟病嚴重危害。在世界範圍內，由稻痕菌oryzae)引起的稻痕病常年可造成水稻產量10_30%的損失(Dean等，2005)。長期的生產實踐表明，選育和利用抗病水稻品種是防治稻瘟病最有效、最經濟、對環境安全的方法。
[0003]傳統抗病水稻品種選育，主要依賴於苗期抗性接種表型鑑定或在稻瘟病易發區進行抗性表型篩選，容易因環境、氣候等稻瘟發病條件的變化而受影響，導致鑑定結果不準確，育種效率偏低。此外，不少抗病基因間存在表型上的抗譜重疊性，傳統育種依靠表型選擇，難以鑑定到聚合多抗病基因的持久廣譜抗病品種。
[0004]分子標記輔助選擇是隨著現代分子生物學、分子遺傳學的發展而產生的農作物育種新技術。這一技術主要通過分析與目標基因緊密連鎖的分子標記基因型，實現對目標基因的選擇。在作物抗病育種中，分子標記輔助選擇能夠提高選擇可靠性，加快育種進程。此外，基於對目標基因緊密連鎖分子標記的檢測，還能夠實現多個抗病基因聚合，培育持久抗病品種的目標。
[0005]/--基因是一個抗譜很廣的水稻抗稻瘟病基因。Chen等(2001)以來源於中國中部和南部稻區的792個生理小種接種攜帶/--基因的水稻近等基因系C101A51，發現C101A51對超過92%的生理小種表現抗性；Liu等(2002)研究表明，攜帶Ρι2基因的水稻近等基因系C101A51對來自13個國家的36個生理小種表現抗性。這些結果表明Pi2基因在水稻抗稻瘟病育種中具有重要的應用價值。因此，建立/--基因的分子標記，對充分利用該基因培育抗稻瘟病水稻新品種，具有重大意義。


【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供水稻抗稻瘟病基因/--的分子標記及其應用。通過檢測該分子標記，可以準確判斷所檢測水稻材料是否具有抗病基因Pi2,顯著提高培育抗稻瘟病水稻品種的效率。
[0007]本發明通過分析抗稻瘟病功能基因/--及其上、下遊區間的序列，發現與其它不含/--功能基因水稻品種基因組中等位區間的序列相比，/--功能基因的起始密碼子ATG上遊約28.3 kb區間存在一個27 bp的插入/缺失位點，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；同時，/--功能基因的終止密碼子TGA下遊2236/2237 bp之間存在一個53 bp的插入/缺失位點，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]基於上述發現，本發明提供了一種水稻抗稻瘟病基因/--的分子標記，分為上遊分子標記和下遊分子標記，分別針對核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所不的特異性插入/缺失位點多態。
[0009]所述的水稻抗稻瘟病基因/--的分子標記的引物組合Pi2U-F/Pi2U_R，由如SEQID N0.3所示的DNA序列和如SEQ ID N0.4所示的DNA序列組成，用於擴增上遊分子標記。
[0010]所述的水稻抗稻瘟病基因/--的分子標記的引物組合Pi2D-F/Pi2D_R，由如SEQID N0.5所示的DNA序列和如SEQ ID N0.6所示的DNA序列組成，用於擴增下遊分子標記。
[0011]根據上述引物組合，本發明還提供了一種檢測水稻抗稻瘟病功能基因/--的分子標記的方法，包括以下步驟:
1)提取水稻樣品基因組DNA；
2)利用權利要求3所述的引物組合Pi2U-F/Pi2U-R和權利要求4所述的引物組合Pi2D-F/Pi2D-R對水稻樣品基因組DNA進行PCR擴增，根據Pi2U_F/Pi2U_R的擴增產物是否為一條144 bp條帶，並且Pi2D-F/Pi2D-R的擴增產物是否為一條195 bp條帶，判斷所檢測水稻樣品基因組是否具有水稻抗稻瘟病基因/--,即如果利用Pi2U-F/Pi2U-R和Pi2D-F/Pi2D-R能夠分別擴增出一個144 bp和195 bp的標記片段，則標誌著該水稻樣品基因組中存在抗稻瘟病基因/^?。
[0012]本發明另外保護了一種選育水稻抗稻瘟病品種的方法，包括以下步驟:
O以含有抗稻瘟病基因/--的水稻品種C101A51或其衍生係為親本材料，與其他水稻品種雜交或回交並繁衍後代群體； 2)提取上述所獲得群體中單個植株的基因組DNA，利用權利要求3所述引物組合Pi 2U-F/Pi 2U-R和權力要求4所述引物組合Pi 2D-F/Pi 2D-R進行檢測，如果能夠同時檢測到Pi2U-F/Pi2U-R所擴增的144 kb標記片段和Pi2D_F/Pi2D_R所擴增的195 kb標記片段，則所檢測水稻植株攜帶有抗稻瘟病基因Pi2。
[0013]本發明的優點及有益效果:1)本發明基於對具有/--功能基因水稻品系C101A51基因組中的/--及其上、下遊區間的序列，以及其它不具有/--功能基因水稻品種基因組中的等位區間序列進行分析，在/--功能基因的上遊約28.3 kb區間，以及在/--功能基因的下遊2236/2237 bp區間分別確定了特異性插入/缺失多態，並開發了基於PCR反應的上、下遊分子標記組合Pi2-1D-U和Pi2-1D-D。與常規育種方法相比，應用本發明建立的標記方法選育含有/--功能基因的抗稻瘟病水稻品種，具有選擇目標明確、選擇效率高以及節約成本的優勢。在常規水稻抗病育種中，一般是依賴於苗期抗性接種表型鑑定或在稻瘟病易發區進行抗性表型篩選，受環境影響較大，不同年份間差別也較大，篩選鑑定的可靠性低，育種效率也低。基於本發明提供的抗稻瘟病基因/--分子標記方法，可以在苗期對水稻植株進行取樣、DNA提取以及PCR快速鑑定，能夠有效控制育種群體規模，節約育種篩選成本。
[0014]2)本發明提供的標記位於/--功能基因的上、下遊區間，在遺傳上與/--抗病性呈共分離，選擇效率達到100%，其比常用SSR標記的準確性顯著提高。
[0015]3)本發明提供的兩個分子標記均為共顯示標記，除了準確性高、重複性好，還能夠區分出雜合體和純合體，可以快速獲得具有純合/--功能基因的抗稻瘟病水稻植株。
[0016]綜上所述，利用本發明提供的分子標記方法，能夠準確預測不同水稻植株基因組中是否含有/--功能基因以及其是否純合，顯著提高選育含有/--功能基因抗稻瘟病水稻品種的效率。
[0017]

【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為部分水稻品種基因組中/--等位位點上遊區間序列分析。
[0018]其中，C101A51:C101A51 ；NPB:日本晴；9311:9311 ；SE21S:SE21S ；MH63:明恢 63 ；MY46:密陽 46 ；II32:1I_32B ；GH998:廣恢 998 ;75-1_127:75-1-127 ；C64:測 64 ；02428:02428 ;ZG:早岡 B ；GZ63S:廣佔 63S ；D62:D62B ；SH527:蜀恢 527 ；F838:輻 838 ；ZRlOl:ZRlOlo
[0019]圖2為基於Pi2U-F/Pi2U_R引物組合的/--上遊分子標記Pi2_ID_U檢測部分水稻品種基因組DNA的電泳圖譜。
[0020]其中，M:分子量 Marker ；1:C101A51 ；2:日本晴；3:9311 ；4:SE21S ；5:明恢 63 ；6:密陽 46 ；7:11-32B ；8:廣恢 998 ；9:75-1-127 ；10:測 64 ；11:02428 ;12:早岡 B ；13:廣佔63S ；14:D62B ；15:蜀恢 527 ；16:輻 838 ；17 =ZRlOl0 含有/--之功能基因的 C101A51 樣本顯示一條144bp條帶，其它無/--功能基因品種的樣本(除75-1-127擴增產物為162 bp外)顯示一條171 bp或172 bp的條帶。
[0021]圖3為具有/--功能基因水稻品種C101A51和無/--功能基因水稻品種日本晴的基因組中Pi2等位位點下遊區間序列分析。
[0022]其中，C101A51:C101A51 ；NPB:日本晴。
[0023]圖4為基於Pi 2D-F/Pi2D_R引物組合的/--功能基因下遊分子標記Pi2_ID_D檢測部分水稻品種基因組DNA的電泳圖譜。
[0024]其中，M:分子量 Marker ；1:C101A51 ；2:日本晴；3:9311 ；4:SE21S ；5:明恢 63 ；6:密陽 46 ；7:11-32B ；8:廣恢 998 ；9:75-1-127 ；10:測 64 ；11:02428 ;12:早岡 B ；13:廣佔63S ；14:D62B ；15:蜀恢 527 ；16:輻 838 ；17 =ZRlOl0 含有/--之功能基因的 C101A51 樣本顯示一條195bp條帶,其它無/7ZJ功能基因品種的樣本顯示一條142bp左右的條帶。
[0025]

【具體實施方式】
下面結合具體實施例，對本發明作進一步闡述。以下實施例用於說明本發明，但不限制本發明的範圍。
[0026]實施例1 /--功能基因上、下遊區間DNA序列特異插入/缺失位點多態性確定從公共資料庫Genebank下載獲得已經公開發表的來源於水稻品種C101A51的/--功能基因及其上、下遊區間的序列(Genbank DQ352453)和來源於水稻品種日本晴(無/--功能基因)的等位區間序列(Genbank DQ454158)，發現C101A51基因組序列與日本晴基因組序列相比，在/--功能基因的上遊約28.3 kb區間，缺失了一個序列為5』 -TTCGAGCCGTTTCATCCCTAATTGCAC-3』的大小為27bp的片段(附圖1)。為分析這一缺失多態性是否在C101A51與其它不同水稻品種間具有保守性，進一步利用PCR技術從9311、SE21S、明恢63、密陽46、I1-32B、廣恢 998、75-1-127、測 64、02428、早岡 B、廣佔 63S、D62B、蜀恢 527、輻 838 和 ZRlOl等15個水稻品種/品系基因組中擴增了相應的DNA片段並進行序列測序，結果表明，無/--功能基因等位區段均在相對應於/--功能基因的上遊約28.3 kb區間，具有一個序列為5』-TTCGAGCCGTTTCATCCCTAMTTGCRC-3』(其中M代表鹼基A或者C，R代表鹼基A或者G)的大小為27bp插入片段(附圖1)，說明/--功能基因上遊區間的這個27bp缺失多態性能夠特異性地甄別Pi2功能基因序列與無/--功能基因的等位序列。
[0027]對DQ352453序列和DQ454158分析還發現，在DQ352453序列中，P12功能基因終止密碼子 TGA 下遊 2236/2237 bp 之間具有一個序列為 5』 -GGCAGCGGTTCACGTCGGCACTGGCGGCCCTAGGGGTAGCGGTGCCCCAGGAC-3』 的大小為 53 bp 的插入多態性(附圖 3)。
[0028]實施例2 /--功能基因上、下遊分子標記的建立
針對/--功能基因上遊區間的特異缺失位點多態性，設計了一對特異性引物組合Pi2U-F: 5，-TATGTGGGGTTTCTGATTCC-3， ， Pi2U-R: 5，-CTTCACAAGCCATAATCAACA-3，，用於建立上遊分子標記Pi2-1D-U。利用Pi2U-F/ Pi2U_R引物組合對C101A51、日本晴、9311、SE21S、明恢 63、密陽 46、I1-32B、廣恢 998、75_1_127、測 64、02428、早網 B、廣佔 63S、D62B、蜀恢527、輻838和ZRlOl等17個水稻品種/品系的基因組DNA模板進行擴增。PCR反應體系為 25 μ L，含有模板 DNA 50 ng，2 X React1n Mix 12.5 μ L (含 MgCl2、dNTP 等)，10「]?引物卩9-卩和卩9-1?各1 yL，0.5U Golden DNA Polymerase (2.5 U/12.5 μ L, TIANGEN生物技術公司)，ddH20補齊至25 μ L0反應條件為:94°C 5min,94°C 30S,58°C 30S，72°C30S，共30個循環，最後72°C延伸8 min。擴增產物在8%非變性聚丙烯醯胺凝膠進行電泳分型。
[0029]電泳結果表明，含有/--功能基因的C101A51擴增產物顯示一條144bp條帶，其它16個無/--功能基因水稻品種/品系的擴增產物(除75-1-127擴增產物為162 bp外)顯示一條171bp或172bp的條帶(附圖2)，並且C101A51樣品的帶型與其它樣品的帶型可以在8%非變性聚丙烯醯胺凝膠中明顯區分開。
[0030]針對/--功能基因下遊區間的特異缺失位點多態性，設計了一對特異性引物組合Pi2D-F: 5』-TAGGGGCTGCGGCGGAGGAC-3』，Pi2D_R: 5』-CTAGGCCTCCATTATCCATAGT-3』，用於建立上遊分子標記Pi2-1D-D。利用Pi2D-F/卩120_1?引物組合對(:10認51、日本晴、9311、SE21S、明恢 63、密陽 46、I1-32B、廣恢 998、75_1_127、測 64、02428、早網 B、廣佔 63S、D62B、蜀恢527、輻838和ZRlOl等17個水稻品種/品系的基因組DNA模板進行擴增。PCR反應體系及反應條件與上述相同。擴增產物在8%非變性聚丙烯醯胺凝膠進行電泳分型。電泳結果表明，含有/--功能基因的C101A51擴增產物顯示一條195bp條帶，其它16個無/--功能基因水稻品種/品系的擴增產物顯示一條142bp左右的條帶(附圖4)。
[0031]上述所建立兩個標記均是共顯示標記，可以檢測出水稻植株是否攜帶功能/--基因以及以及其基因型是純合或雜合。如針對Pi2-1D-U標記和Pi2-1D-D標記，當所檢測水稻樣品的擴增產物分別是144bp和195bp的單一標記片段，標誌著水稻植株染色體中的/--基因是純合的。如果針對Pi2-1D-U標記擴增產物是包含一個144 bp片段和一個非144 bp片段(如171 bp或172 bp)，或者針對Pi2-1D-D標記擴增產物是包含一個195 bp片段和一個142 bp片段，則標誌著水稻植株染色體中的Z7^基因是雜合型。
[0032]實施例3 /--功能基因分子標記驗證
以/--功能基因供體品種C101A51為親本與不含/--功能基因的水稻品種C039配置F2群體。種植F2群體，提取幼苗基因組DNA，以Pi2-1D-U和Pi2_ID_D標記，篩選了 132個Pi2-1D-U標記檢測為陽性(擴增片段為144 bp)和Pi2-1D-D標記檢測為陽性(擴增片段為195 bp)的植株。進一步以稻瘟菌菌株P06-6進行接種鑑定。P06-6菌株對無/--功能基因的C039有強致病性，但對攜帶/--功能基因的植株則不具有致病性。接種結果表明，所有經過標記檢測為陽性的植株均表現出對P06-6抗性，選擇效率達到100%。
[0033]實施例4 Z7Zj功能分子標記在水稻抗病分子育種中的應用利用/--功能基因供體品種C101A51與超級稻恢復系9311配置組合，並通過回交結合分子標記輔助選擇將/--功能基因向9311轉育。經過配組、回交並標記篩選獲得了 BC3R材料。進一步對BC3代材料進行篩選，提取BC3代植株的基因組DNA，通過PCR分析，分別檢測Pi2功能基因上遊標記Pi2-1D-U和下遊標記Pi2-1D-D，檢測到24個植株的樣品具有代表/--功能基因144 bp的上遊Pi2-1D-U標記條帶，和195 bp的下遊Pi2_ID_D標記條帶，與這些植株的抗病性生物學鑑定結果一致。實施例結果體現出，應用本發明提供的/--功能基因的分子標記方法，能夠快速準確地在育種群體中鑑定出攜帶/--功能基因的水稻植株，加速水稻抗稻瘟病品種培育的進程。
【權利要求】
1.一種水稻抗稻瘟病基因/--的分子標記，其特徵在於:所述分子標記基於核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的特異性插入/缺失位點多態。
2.一種水稻抗稻瘟病基因/--的分子標記，其特徵在於:所述分子標記基於核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的特異性插入/缺失位點多態。
3.一種擴增權利要求1所述的水稻抗稻瘟病基因/--的分子標記的引物組合Pi2U-F/Pi2U-R，其特徵在於:由如SEQ ID N0.3所示的DNA序列和如SEQ ID N0.4所示的DNA序列組成。
4.一種擴增權利要求2所述的水稻抗稻瘟病基因/--的分子標記的引物組合Pi2D-F/Pi2D-R，其特徵在於:由如SEQ ID N0.5所示的DNA序列和如SEQ ID N0.6所示的DNA序列組成。
5.一種檢測水稻抗稻瘟病基因/--的分子標記的方法，其特徵在於包括以下步驟: 1)提取水稻樣品基因組DNA； 2)利用權利要求3所述的引物組合Pi2U-F/Pi2U-R和權利要求4所述的引物組合Pi2D-F/Pi2D-R對水稻樣品基因組DNA進行PCR擴增，根據Pi2U_F/Pi2U_R的擴增產物是否為一條144 bp條帶，並且Pi2D-F/Pi2D-R的擴增產物是否為一條195 bp條帶，判斷所檢測水稻樣品基因組是否具有抗稻瘟病功能基因/--,即如果利用Pi2U-F/Pi2U-R和Pi2D-F/Pi2D-R能夠分別擴增出一個144 bp和195 bp的標記片段，則標誌著該水稻樣品基因組中存在抗稻瘟病功能基因Pi2。
6.一種選育水稻抗稻瘟病品種的方法，其特徵在於:所述方法包括以下步驟: O以含有抗稻瘟病功能基因/--的水稻品種C101A51或其衍生係為親本材料，與其他水稻品種雜交或回交並繁衍後代群體； 2)提取上述所獲得群體中單個植株的基因組DNA，利用權利要求3所述引物組合Pi 2U-F/Pi 2U-R和權力要求4所述引物組合Pi 2D-F/Pi 2D-R進行檢測，如果能夠同時檢測到Pi2U-F/Pi2U-R所擴增的144 kb標記片段和Pi2D_F/Pi2D_R所擴增的195 kb標記片段，則所檢測水稻植株攜帶有抗稻瘟病功能基因Pi2。
【文檔編號】C12N15/11GK104073487SQ201410312834
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月3日 優先權日:2014年7月3日
【發明者】陳松彪, 王 鋒, 田大剛, 陳在傑, 陳子強, 林豔 申請人:福建省農業科學院生物技術研究所