一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其克隆的製作方法
2024-02-29 11:48:15
專利名稱：一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其克隆的製作方法
技術領域：
本發明是一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其克隆，屬於生物工程領域，特別涉及到紫穗槐(Amorpha fruticosa)編碼尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因及其克隆。
背景技術：
林業生產中樹木的價值不但在於木材產量，還體現在木纖維的理化指標上。木纖維主要由木質素和纖維素組成。纖維素是主要由β-D-葡萄糖基以1-4糖苷鍵連接而成的複雜的高分子物質，是造紙的主要原料。造紙製漿的過程就是要從植物纖維原料中去除木質素類物質，儘量保留纖維素和半纖維素。對植物纖維素合成過程及調控的研究，在生物學、生態學和經濟上都有重要意義。隨著植物分子生物學的飛速發展，人們開始重視從造紙原料——植物入手，試圖在了解植物生長發育機理及分子調控的基礎上，通過基因工程途徑研究開發出更適合製漿造紙工業的植物資源。因此涉及植物纖維素合成的基因工程的研究、應用對紙漿工業具有非常重要的作用。本發明從增加植物纖維素合成的角度來研究如何改善樹木材質的問題，並通過基因克隆及其在轉基因植物中的表達來研究相關基因在植物體內的作用。
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase(UDP-glucose pyrophosphorylase(EC 2.7.7.9))在UDP-葡萄糖的合成和降解中都起作用。尿苷二磷酸葡萄糖是高等植物中主要活化糖的形式，作為葡萄糖基供體參與蔗糖、纖維素、半纖維素、果膠質的合成代謝，是細菌和植物中纖維素合成酶的高能底物。高等植物在纖維素合成過程中，UDP-葡萄糖在細胞代謝途徑中作為葡萄糖苷供體扮演了重要角色，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶可以以1-磷酸葡萄糖為底物催化纖維素的前體UDP-葡萄糖的形成。本發明從增加植物纖維素合成的角度來研究如何改善樹木材質的問題，並通過基因克隆及其在轉基因植物中的表達來研究相關基因在植物體內的作用。
發明內容
本發明的目的是提供了紫穗槐(Amorpha fruticosa)編碼尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因UGPase序列及其相應的胺基酸序列，提供了含有UGPase的克隆載體pUC118/UGPase和含有這種載體的E.coli細胞JM109/pUC118/UGPase。利用本發明成果，可以構建尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因工程菌，用於植物的基因轉化，達到改善植物品質的目的。
本發明採用的技術方案是利用簡併寡核苷酸PCR法結合cDNA末端快速擴增PCR法，以紫穗槐莖RNA為模板，先用簡併PCR引物，通過RT-PCR的方法，得到了UGPase基因片段，又據此片段設計反向嵌套引物，用RACE方法獲得了未知的5』和3』端基因片段，從而克隆了紫穗槐UGPase全長cDNA，並測定了核苷酸序列。將UGPase和克隆載體pUC118分別用限制性內切酶切割，形成互補的粘性末端，T4DNA連接酶連接，形成UGPase克隆載體pUC118/UGPase。熱激法將這個克隆載體導入感受態E.coli細胞JM109，成為含有pUC118/UGPase的大腸桿菌細胞JM109/pUC118/UGPase。
紫穗槐(Amorpha fruticosa)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase序列如下1 aggtcaattt atgcaatcag caccacaccc tcctctcaac tctcacacac acaccctctt61 tctttatctt ggctctcttc tcttctcttc tactctccac acgtaaccga aactccctcg121 tttctcgaac cttccacagc aatggccgct actgctaccg acaacaagct ctccaacctc181 aaatccgccg tcgccggatt gaaccaaatc agcgagaatg agaagaaagg attcatcaac241 ctcgtctctc gctacctcag tggcgaagcg caacatgtgg aatggagcaa gatccagacg301 cctaccgatg aagtggttgt gccttacgag agtttggcgc caactcctga tggttcttcg361 gaggtgaaga gtctattgga taagcttgtg gtgttgaagc tcaatggagg cttggggaca421 actatgggtt gcactggtcc aaagtctgtc attgaagttc gtgatgggtt gacatttctt481 gatctgattg tcatccaaat tgagaatctc aattccaaat atggaagcaa tgttcctctg541 ctattgatga actcattcaa cactcatgat gacactcaaa agattattga aaagtacaaa601 aactcaaata ttcagattca tactttcaat cagagccagt atcctcgatt ggttgttgat661 gactttttgc cattgccttc caaagggcac actggcaagg atgggtggta ccctcctggg721 catggagatg tcttcccctc attgtcgaac agtggcaaac tcgatgcact attatcacag781 ggtaaagagt atgtgtttgt tgccaattcg gataacttgg gggctatagt tgacttgaaa841 atcttaaatc atttggtcaa gaacaagaac gaatactgta tggaggtgac tcccaaaaca901 ttggctgatg tgaagggtgg cactttgatt tcttatgaag gaagggttca gctcctggaa961 atcgcccaag tcccagatga acatgtcagt gaattcaagt caatagagaa gttcaaaatt1021 ttcaacacaa ataatttgtg ggtgaactta aaagcaatta aaaggctcgt tgaagctgat1081 gctcttaaga cggagattat tcccaatcca aaggaagttg atggagtaaa agttcttcag1141 ctggaaactg cagctggtgc agcaataagg ttctttgaca aggctattgg gattaatgtt1201 cctcgatccc gattccttcc agtgaaggca acttcagatt tgcttcttgt ccagtcggac1261 ctctacactt tggaagatgg atttgtcatt cgaaacaaag ctagggcaaa tcctgaaaac1321 cctactgttg aattggggcc agaatttaag aaggttagca acttcttgag ccggttcaag1381 tcaattccta gtatcgttga gcttgacagt ttaaaagtgg caggcgatgt atggtttgga1441 cctggcatta tcctcaaggg gaaagtcagt atcgtagcaa aacctggtgt aaagttggaa1501 attcctgatg gagctgtaat tgcgaacaag gaaattaatg gccctgagga cctgtgagga1561 agctgatgag ttttgaaatg tatctgactg tatacgatgt agacagtctt cttgctattt1621 ttgtattgct ccaagtttga taggaaaaga aaaaataata tggcggcttt tgttgaggat1681 tagtctgagt atggagcttt gctggatgtc ttgtaatttt gtttttaacg tttgcaagga1741 ctgcaggagg atcatgtttt gccccctaac atggtgagca ttttcgccat tttgtataaa1801 taaccgtgtt ccacaaaaaa aaaaaaaaaa a其中ATG為轉錄起始密碼，TAG為轉錄終止密碼。根據以上核苷酸序列，推測紫穗槐(Amorpha fruticosa)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶胺基酸序列如下1MAATA TDNKL SNLKS AVAGL NQISE NEKKG FINLV SRYLS41 GEAQH VEWSK IQTPT DEVVV PYESL APTPD GSSEV KSLLD81 KLVVL KLNGG LGTTM GCTGP KSVIE VRDGL TFLDL IVIQI121 ENLNS KYGSN VPLLL MNSFN THDDT QKIIE KYKNS NIQIH161 TFNQS QYPRL VVDDF LPLPS KGHTG KDGWY PPGHG DVFPS201 LSNSG KLDAL LSQGK EYVFV ANSDN LGAIV DLKIL NHLVK241 NKNEY CMEVT PKTLA DVKGG TLISY EGRVQ LLEIA QVPDE281 HVSEF KSIEK FKIFN TNNLW VNLKA IKRLV EADAL KTEII321 PNPKE VDGVK VLQLE TAAGA AIRFF DKAIG INVPR SRFLP361 VKATS DLLLV QSDLY TLEDG FVIRN KARAN PENPT VELGP401 EFKKV SNFLS RFKSI PSIVE LDSLK VAGDV WFGPG IILKG
441 KVSIV AKPGV KLEIP DGAVI ANKEI NGPED L紫穗槐(Amorpha fruticosa)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase全長1831bp，142-1558編碼區，共編碼472個胺基酸。
本發明的效果和益處在於UGPase是首次被提取、測序和克隆的紫穗槐(Amorpha fruticosa)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。因其所編碼的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶參與植物糖代謝過程中尿苷二磷酸葡萄糖的合成，尿苷二磷酸葡萄糖是纖維素合成的重要底物，所以該基因的克隆可用於構建表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因工程菌，用於植物的基因轉化，達到改善植物品質的目的。
具體實施方案以下詳細說明本發明的最佳實施例。
實施例1UGPase cDNA全長目的片段的克隆和測序取春季萌發的紫穗槐枝條，剝去外皮，用清潔力片刮取次生分生組織，液氮研磨成粉，加入TRIzol試劑，提取RNA。按照BcaBESTTMRNA PCR KitVer.1.1(TAKALA)方法，以Oligo dT為引物，以提取的總RNA為模板，進行反轉錄反應，合成cDNA。根據GENEBANK上編碼UGPase蛋白保守區序列設計簡併引物UGPF1和UGPR1(表1)，以上述合成的cDNA為模板，進行PCR反應。用TaKaRa Ex TaqTM試劑盒，調製反應液，PCR反應物組成如下(50μl體系)5μl dNTP，5μl ExTag buffer，0.25μl(5U/μl)ExTag，RT反應產物1μl，引物UGPF1和UGPR1各1μl。反應條件為94℃預變性5min，然後98℃10s，55℃30s，72℃55s，共30個循環，反應結束時72℃繼續延伸7min。將PCR產物回收片段UGP1克隆，測序並分析。
根據已獲得的紫穗槐UGP1 cDNA部分序列，設計一條5′末端磷酸化的反轉錄引物URT1。在反轉錄引物內側設計兩對反向嵌套PCR引物UF1\UR1和UF2\UR2，擴增包括5′末端的cDNA片段。引物序列如下UGPF1 TATGGGNTGCACNGGNCCNAAGTCUGPR1 CCAANCGNGGATACTGGCTCUF3AGGTCAATTTATGCAATCAGURT1 (P)-AGGATACTGGCTCTGUF1CCTCTGCTATTGATGAACTCUR1GCTTCCATATTTGGAATTGAGUF2TTCAACACTCATGATGACACTCUR2TGTCAACCCATCACGAACTT反應按照5′-Full RACE Core Set(TAKARA)的方法進行。
PCR反應條件94℃預變性5min，94℃1min，55℃30s，72℃60s，重複30個循環，反應結束時72℃繼續延伸7分鐘。將PCR產物回收測序。
按照3′-FULL RACE Core Set(TAKARA)方法，用OligodT-3sitesAdaptor引物進行反轉錄反應。再用OligodT-3sites Adaptor引物和UF1引物擴增含3′末端的cDNA片段UGP3。PCR反應條件94℃預變性5min，94℃1min，55℃30s，72℃60s，重複30個循環，反應結束時72℃繼續延伸7分鐘。將PCR產物回收測序。
依據5′RACE和3′RACE擴增產物的核苷酸序列設計特異引物UF3，按照BcaBESTTMRNA PCR Kit Ver.1.1(TAKALA)方法，以Oligo dT為下遊引物，擴增UGP全長cDNA並測序，得到紫穗槐(Amorpha fruticosa)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase。
實施例2UGPase與克隆載體pUC118的重組UGPase和克隆載體pUC118分別用EcoRI/SphI雙酶切。酶切條件如下Eppendorf AddH2O 11μl1×H 2μlPCR片段(1μg/μl) 5μlEcoRI 1μlSphI 1μlEppendorf BddH2O 15μl1×H 2μl質粒(1μg/μl)1μlEcoRI 1μlSphI 1μl37℃酶切3小時，電泳後分別回收兩個目的片段，用T4DNA連接酶連接。連接條件如下ddH2O 6μlPCR片段(0.1μg/μl) 1μl質粒(0.05μg/μl) 1μl10×T4DNA連接酶Buffer 1μlT4DNA連接酶(1U/μl)1μl16℃連接1小時，電泳檢測連接產物，回收其中約4.2kb片段為含有UGPase的克隆載體pUC118/UGPase，用於轉化大腸桿菌。
實施例3克隆載體pUC118/UGPase轉化大腸桿菌JM109加入60μl解凍的感受態E.coli JM109和10μl連接液至Eppendorf中，冰上30秒，42℃ 50秒，冰上2分鐘，加入37℃的LB培養基930μl，37℃震蕩培養1小時。菌液與4μl IPTG及40μl X-gal混合後塗含有50mg/Ap的LB平板上，37℃培養過夜。挑選白色菌落做PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳中呈現1.5kb特異帶者為陽性轉化菌落，為含有pUC118/UGPase的大腸桿菌JM109/pUC118/UGPase。從JM109/pUC118/UGPase中提取質粒，以pUC118的測序通用引物測定外源插入序列UGPase的核苷酸序列，與實施例1中所述PCR測序結果一致。
權利要求
1.一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase，其特徵在於它是紫穗槐(Amorpha fruticosa)編碼尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因。
2.根據權利要求1所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase的核苷酸序列1 aggtcaattt atgcaatcag caccacaccc tcctctcaac tctcacacac acaccctctt61 tctttatctt ggctctcttc tcttctcttc tactctccac acgtaaccga aactccctcg121 tttctcgaac cttccacagc aatggccgct actgctaccg acaacaagct ctccaacctc181 aaatccgccg tcgccggatt gaaccaaatc agcgagaatg agaagaaagg attcatcaac241 ctcgtctctc gctacctcag tggcgaagcg caacatgtgg aatggagcaa gatccagacg301 cctaccgatg aagtggttgt gccttacgag agtttggcgc caactcctga tggttcttcg361 gaggtgaaga gtctattgga taagcttgtg gtgttgaagc tcaatggagg cttggggaca421 actatgggtt gcactggtcc aaagtctgtc attgaagttc gtgatgggtt gacatttctt481 gatctgattg tcatccaaat tgagaatctc aattccaaat atggaagcaa tgttcctctg541 ctattgatga actcattcaa cactcatgat gacactcaaa agattattga aaagtacaaa601 aactcaaata ttcagattca tactttcaat cagagccagt atcctcgatt ggttgttgat661 gactttttgc cattgccttc caaagggcac actggcaagg atgggtggta ccctcctggg721 catggagatg tcttcccctc attgtcgaac agtggcaaac tcgatgcact attatcacag781 ggtaaagagt atgtgtttgt tgccaattcg gataacttgg gggctatagt tgacttgaaa841 atcttaaatc atttggtcaa gaacaagaac gaatactgta tggaggtgac tcccaaaaca901 ttggctgatg tgaagggtgg cactttgatt tcttatgaag gaagggttca gctcctggaa961 atcgcccaag tcccagatga acatgtcagt gaattcaagt caatagagaa gttcaaaatt1021 ttcaacacaa ataatttgtg ggtgaactta aaagcaatta aaaggctcgt tgaagctgat1081 gctcttaaga cggagattat tcccaatcca aaggaagttg atggagtaaa agttcttcag1141 ctggaaactg cagctggtgc agcaataagg ttctttgaca aggctattgg gattaatgtt1201 cctcgatccc gattccttcc agtgaaggca acttcagatt tgcttcttgt ccagtcggac1261 ctctacactt tggaagatgg atttgtcatt cgaaacaaag ctagggcaaa tcctgaaaac1321 cctactgttg aattggggcc agaatttaag aaggttagca acttcttgag ccggttcaag1381 tcaattccta gtatcgttga gcttgacagt ttaaaagtgg caggcgatgt atggtttgga1441 cctggcatta tcctcaaggg gaaagtcagt atcgtagcaa aacctggtgt aaagttggaa1501 attcctgatg gagctgtaat tgcgaacaag gaaattaatg gccctgagga cctgtgagga1561 agctgatgag ttttgaaatg tatctgactg tatacgatgt agacagtctt cttgctattt1621 ttgtattgct ccaagtttga taggaaaaga aaaaataata tggcggcttt tgttgaggat1681 tagtctgagt atggagcttt gctggatgtc ttgtaatttt gtttttaacg tttgcaagga1741 ctgcaggagg atcatgtttt gccccctaac atggtgagca ttttcgccat tttgtataaa1801 taaccgtgtt ccacaaaaaa aaaaaaaaaa a
3.根據權利要求1所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase的克隆載體pUC 118/UGPase。
4.根據權利要求3所述克隆載體pUC118/UGPase的大腸桿菌(E.coli)受體細胞JM109/pUC118/UGPase。
全文摘要
本發明是一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其克隆，屬於生物工程領域。本發明提供了一種來自於紫穗槐(Amorpha fruticosa)編碼尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因UGPase，提供了UGPase序列及其相應的胺基酸序列。提供了含有UGPase的克隆載體pUC 118/UGPase和含有這種載體的E.coli細胞JM109/pUC118/UGPase。本發明可用於構建尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因工程菌，用於植物的基因轉化，達到改善植物品質的目的。
文檔編號C12N15/70GK1401774SQ02132629
公開日2003年3月12日 申請日期2002年7月19日 優先權日2002年7月19日
發明者安利佳, 劉文哲, 蘇喬, 高曉蓉, 楊君 申請人:大連理工大學